铁死亡抑制剂在制备预防或治疗铁过载导致的骨质疏松或骨丢失的药物中的应用

摘要

本发明公开了铁死亡抑制剂在制备预防或治疗铁过载导致的骨质疏松或骨丢失的药物中的应用，涉及骨质疏松治疗领域。发明首次发现并证实了铁过载抑制成骨分化的细胞机制主要是铁死亡、而非目前研究者发现的凋亡或者其他死亡方式，发现了铁死亡降低Wnt信号抑制成骨分化的分子机制，并提供了四种通过降低铁死亡或者激活Wnt信号来高效低风险的治疗、预防或者降低铁过载导致骨质疏松或骨丢失的方案。具体地，褪黑素或者铁死亡抑制剂/药物抑制铁死亡，或者是直接激活Wnt信号的药物去除铁过载的作用，恢复骨髓基质细胞成骨分化功能。本发明为临床寻找治疗疾病或环境条件下因为产生铁过载而导致的骨质疏松或骨丢失提供实验数据和研究方向。

说明书

技术领域

本发明涉及铁过载导致骨质疏松以及骨丢失治疗领域，具体而言，涉及铁死亡抑制剂在制备预防或治疗铁过载导致的骨质疏松或骨丢失的药物中的应用。

背景技术

铁作为一种必需元素，在DNA合成、电子/氧运输和其他代谢过程中起着关键作用。正常血清中的铁含量为50μg/dL到180μg/dL。而铁死亡(ferroptosis)是一种依赖于铁和活性氧(reactive oxygen species,ROS)的调节细胞死亡(regulated cell death,RCD)的形式，由Brent R Stockwell博士的实验室于2012年首次提出。铁死亡与其他类型的RCD在形态学、生化和遗传方面不同，铁死亡不同于焦亡、凋亡、坏死和自噬细胞死亡。铁死亡这一过程表现为铁代谢过程中积累的致死ROS和脂质过氧化产物(LPO)。铁死亡途径根据ROS的产生机制可分为上游和下游两部分，在上游的一条通路中，过量的铁通过Fenton反应生成ROS促进了铁死亡发生；下游可进一步导致细胞死亡。现有的研究表明，铁死亡可以通过铁螯合剂或脂质过氧化抑制剂进行药理学抑制。

骨质疏松症是一种世界性的慢性疾病，其特点是骨量低，微结构恶化，骨折风险增加。到目前为止，骨质疏松症已经成为一个主要的公共健康问题，每年影响着全世界上亿人。以往对骨质疏松症的研究主要集中在钙和维生素D的生物学功能方面。近年研究发现，铁代谢与骨质疏松密切相关，铁代谢紊乱影响骨内稳态。研究发现，镰状细胞病(SCD)、地中海贫血、遗传性血色素沉着病、血红蛋白病和绝经后骨质疏松、长期航天飞行骨丢失、糖尿病性骨丢失、重症肌无力等多种疾病/情况可导致慢性铁积累。这些铁超载的情况进一步伴有骨质弱化，表现为低骨量、骨质疏松等。除骨代谢疾病以外铁过载也会导致其他疾病，如神经退行性病变、脑创伤功能衰退、肝硬化等。

此外，在不同的动物模型中已经证实：铁超载会导致骨质疏松的骨骼表型，这意味着过量的铁对骨骼有害。大量研究表明，铁超载会直接对骨代谢产生有害影响。同时，铁超载已被证实是骨质疏松的独立危险因素。然而，这背后的机理仍需要进一步研究。

铁超载引起的骨髓间充质干细胞功能障碍和细胞死亡与骨质疏松症的发生密切相关。Balogh等人的研究表明，铁选择性地抑制骨髓间充质干细胞的成骨分化，而不影响成软骨和成脂肪分化。在50mol/L铁作用下，成骨刺激诱导的Runx2及其靶基因OCN和ALP的上调被完全抑制。

研究表明，铁摄入量的增加和铁储存量的减少可能导致铁超载。最近，Wnt/β-catenin通路是骨重塑的关键调节因子，在成骨细胞祖细胞的铁调控成骨分化中发挥重要作用。Qu等人的研究表明，铁螯合剂DFO增加了骨髓间充质干细胞ALP活性和钙沉积，同时促进糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)的磷酸化，并增加了β-catenin的水平。Messer等人研究了过量的铁如何影响胎鼠颅骨细胞的分化和功能。他们发现成骨细胞表型基因标记下调，含铁细胞形成矿化骨结节的能力降低。该研究表明，过量的铁不仅对成骨细胞的分化有负面影响，而且对成熟成骨细胞的活性和细胞外基质矿化也有负面影响。

Wnt信号通路已成为骨稳态的关键调节因子。Wnt信号通过规范和非规范途径控制发育和出生后的过程，包括细胞增殖、分化、极性和迁移。

目前治疗骨质疏松症的方法存在如下弊端：大多数的药物如激素、甲状旁腺激素、双膦酸盐等效果不是很好或机制不明。现有的这些治疗方法会引起显著的副作用，且药物的使用特异性较低。尤其是目前急缺特异性用于治疗铁过载诱发的骨质疏松及骨丢失。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供铁死亡抑制剂在制备预防或治疗铁过载导致的骨质疏松或者骨丢失的药物中的应用。

发明人分析了铁死亡是否是铁超载抑制BMSCs成骨细胞分化的诱因。结果显示加入铁死亡特异性抑制剂Ferrostatin-1抑制铁死亡后，能显著恢复成骨分化及成骨相关基因的表达。发明人发现并证实铁过载抑制骨髓基质细胞成骨分化的主要原因是诱导细胞发生了铁死亡而非凋亡。发明人证实了褪黑素可以通过抑制铁死亡从而预防铁过载导致的骨髓基质细胞成骨分化功能降低。

本发明是这样实现的：

本发明提供了铁死亡抑制剂和/或Wnt信号激活剂在制备预防或治疗铁过载导致的骨质疏松的药物中的应用。

铁死亡抑制剂为褪黑素、Ferrostain-1或铁螯合剂DFO；Wnt信号激活剂为CHIR99201(即为C91)。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述的铁过载导致的骨质疏松是指：铁过载诱发铁死亡导致的骨质疏松。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述应用是褪黑素、铁螯合剂DFO、Ferrostain-1或CHIR99201通过抑制铁死亡或激活Wnt信号挽救铁过载诱导铁死亡导致的骨质疏松或骨丢失。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述骨质疏松/骨丢失的表现为如下至少一种的症状：骨髓基质细胞成骨分化功能障碍、骨髓基质细胞体外骨形成障碍、Wnt信号的靶基因表达降低、β-catenin入核减少、活性氧水平升高和脂质过氧化产物水平升高。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述Wnt信号的靶基因包括Smad6、Lef1、BMP4和CyclinD1中的至少一种。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述出现骨髓基质细胞成骨分化功能障碍表现为如下的至少一种标志物的表达量降低：碱性磷酸酶、Runx2、OCN、OSX和COL1。

骨髓基质细胞体外骨形成障碍表现为：骨髓基质细胞体外钙盐结节的形成受到抑制。

本发明提供了铁死亡抑制剂或Wnt信号激活剂在制备恢复铁过载导致的骨髓基质细胞成骨分化功能障碍的药物中的应用。

铁死亡抑制剂为褪黑素、铁螯合剂DFO、活性氧抑制剂或者脂质过氧化物抑制剂，Wnt信号激活剂为CHIR99201。

活性氧抑制剂或者脂质过氧化物抑制剂选自Ferrostatin-1、Melatonin、Liproxstatin-1、rosiglitazone、pioglitazone、troglitazone或Zileuton；

优选地，铁螯合剂选自去铁胺、去铁胺的衍生物、环吡唑胺、羟胺-铁离子螯合剂、异烟酰、苯甲酰腙类或羟基吡啶酮类；

优选地，去铁胺的衍生物为甲磺酸去铁胺；

优选地，Wnt信号激活剂为CHIR99201。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述药物还包括药学上可接受的添加剂或辅料；优选地，药物的剂型选自片剂、丸剂、粉剂、混悬剂、凝胶、乳液、乳膏、颗粒剂、纳米颗粒、胶囊、栓剂、注射剂、喷雾或针剂。

本发明具有以下有益效果：

本发明首次发现并证实了铁过载导致骨质疏松或骨丢失的机制主要是铁死亡，而非目前研究者发现的凋亡或者其他机制，并提供了四种铁死亡抑制剂的药物应用可高效低风险的治疗、预防或者降低铁过载导致骨质疏松的方案。具体地，死亡抑制剂是通过激活Wnt信号恢复铁过载导致的骨髓基质细胞成骨分化功能。本发明为临床寻找治疗铁过载导致的骨质疏松提供实验数据和研究方向。而且褪黑素、DFO都已经是临床批准使用药物，具有较好的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为实施例1中所示的铁过载浓度依赖性的抑制体外骨髓基质细胞成骨分化和骨形成的实验结果图；

图2为实施例2中所示的铁过载导致骨髓基质细胞增殖降低、细胞大量死亡的实验结果图；

图3为实施例3中所示的铁过载导致骨髓基质细胞发生铁死亡而非凋亡的实验结果图；

图4为实施例4中所示特异性铁死亡抑制剂Ferroptosis抑制铁死亡可以恢复铁过载导致的骨髓基质细胞成骨分化功能的实验结果图；

图5为实施例5中所示的铁过载通过Wnt信号(C91)诱发骨髓基质细胞铁死亡的实验结果图；

图6为实施例6中所示适应浓度的褪黑素可以完全挽救铁过载导致的骨髓基质细胞成骨分化功能障碍的实验结果图；

图7为实施例7中所示的褪黑素可以抑制铁过载导致的铁死亡的实验结果图；

图8为实施例8中所示的褪黑素可能通过Wnt/β-catenin信号发挥保护作用的实验结果图。

具体实施方式

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

2010年8月美国专利申请“铁调素治疗围绝经期和绝经后女性骨质疏松症”中提出围绝经期和绝经后女性不仅雌激素降低(这是医学界公认的现象)，而且铁的含量也显著增加，表现为低雌激素，高铁。而铁调素可以通过调节体内铁稳态从而治疗、预防或者降低围绝经期和绝经后女性骨质疏松症。铁调素的应用具有局限性且特异性低，铁调素的受体目前主要认为存在于小肠上皮细胞，其他组织相对减少，因此其作用机制及位点不明，其临床转化应用充满未知。

褪黑素(melatonin)是一种主要由哺乳动物的松果体分泌的吲哚类激素，褪黑素能激活两种高亲和力G蛋白偶联受体(称为MT1和MT2)，在睡眠和昼夜节律异常、情绪障碍、学习和记忆、神经保护、药物滥用和癌症中发挥有益作用。除了松果体外，研究表明褪黑素可以在骨髓和许多其他组织中合成。骨髓中合成的褪黑素浓度是夜间血液水平的两倍，提示其可能与骨代谢相关。松果体分泌的褪黑激素可以使包括骨骼本身在内的所有周围组织的生物钟同步，从而影响这些昼夜节律，使骨骼新陈代谢与昼夜节律同步；当褪黑激素水平最高时，这有助于最大程度的骨骼生长。褪黑素的减少已被证明会改变各种模型的骨骼形态，包括鱼、鸡和小鼠。在人类，特别是围绝经期妇女中，夜间补充褪黑素(3毫克)6个月，恢复了骨调节破骨细胞和骨形成成骨细胞之间的平衡。而保持夜间褪黑素的峰值，可能显著降低骨质减少、骨质疏松和骨折的风险。

最近许多研究已经证实了褪黑素可以通过褪黑素受体依赖和受体非依赖性的途径预防骨质降解和促进骨骼形成。褪黑素对骨代谢影响的主要机制有两个:①促进成骨细胞的增殖与分化；②抑制破骨细胞生成与活化以抵抗骨质疏松症。因此，褪黑素作为一种潜在的抗骨质疏松药物成为学界关注的热点。

基于此，本发明提供了四种铁死亡抑制剂和/或Wnt信号激活剂在制备预防或治疗铁过载导致的骨质疏松的药物中的应用。

铁死亡抑制剂为褪黑素、Ferrostain-1或铁螯合剂DFO，Wnt信号激活剂为CHIR99201(或C91)。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述的铁过载导致的骨质疏松是指：铁过载诱发铁死亡导致的骨质疏松(成骨功能障碍)。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述应用是褪黑素、铁螯合剂DFO、Ferrostain-1或CHIR99201通过抑制铁死亡或激活Wnt信号挽救铁过载诱导铁死亡导致的骨质疏松或骨丢失。

为了探索其机制，发明人检测了Wnt信号在褪黑素挽救(铁过载诱导)铁死亡导致骨髓基质细胞成骨分化功能降低中的作用。Wnt信号本身就是调控成骨分化的重要信号，同时有研究发现褪黑素能通过激活Wnt信号从而促进骨形成。

Wnt信号通路已成为骨稳态的关键调节因子。Wnt信号通过规范和非规范途径控制发育和出生后的过程，包括细胞增殖、分化、极性和迁移。

发明人发现铁过载导致度依赖性抑制Wnt信号靶基因表达，为了确定Wnt信号在铁过载诱导铁死亡这一过程中的作用，发明人选用了Wnt信号的激活剂C41激活Wnt后，可以降低铁过载导致的ROS积累，以及可以减低细胞死亡的百分比，通过透射电镜也观察到激活Wnt后大部分的线粒体恢复正常。同时激活Wnt信号可以挽救铁过载对BMSC成骨分化抑制作用和成骨基因的表达，这说明Wnt信号在铁过载导致铁死亡的过程中发挥了重要作用。

而在褪黑素挽救铁过载诱导铁死亡导致骨髓基质细胞成骨分化功能降低过程中Wnt信号的靶基因表达恢复，β-catenin入核增加。这证实了褪黑素是通过激活Wnt信号从而挽救铁过载诱导铁死亡导致骨髓基质细胞成骨分化功能障碍。

本发明发现了铁过载导致骨质疏松的新机制主要是铁死亡而非是之前研究者发现的凋亡或者其他机制，并提供了一种高效低风险应用广泛的药物褪黑素用于治疗、预防或者降低铁过载导致的骨质疏松，其机制是通过激活Wnt信号。

目前，多种慢性铁过载疾病都伴发严重骨质疏松，其中，航天飞行失重会导致严重骨丢失已被证实发生铁过载，而采用铁螯合剂去铁胺治疗失重小鼠可以预防失重骨丢失。这表明寻找一种高效低风险的治疗铁过载导致的骨质疏松方法是非常有必要的，而褪黑素已经是临床批准使用药物，具有较好的应用前景。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述骨质疏松的表现为如下至少一种的症状：骨髓基质细胞成骨分化功能障碍、骨髓基质细胞体外骨形成障碍、Wnt信号的靶基因表达降低、β-catenin入核减少、活性氧(ROS)水平升高和脂质过氧化产物(LPO)水平升高。

骨髓基质细胞(BMSCs)的成骨潜能对骨稳态至关重要。骨质疏松症与循环骨髓间充质干细胞的低成骨潜能呈正相关。前期研究表明铁超载引起的骨髓间充质干细胞功能障碍和细胞死亡与骨质疏松症的发生密切相关，铁超载抑制成骨细胞增殖，成骨细胞中过量的铁积累会引发细胞凋亡，这可能在骨质疏松症中发挥重要作用。

发明人研究证明铁过载会诱导骨髓基质细胞(BMSCs)发生凋亡，但抑制凋亡不能恢复铁过载诱导的BMSCs成骨分化降低，这表明铁过载诱导的凋亡不是成骨分化降低的主要原因。

发明人探索了铁死亡是否参与了铁超载对骨髓间充质干细胞的影响，首先检测到二价金属转运体DMT1的表达增加及细胞内动态游离的Fe

同时检测了另一个铁死亡的指标，脂质过氧化产物(LPO)，LPO被认为是铁作用的近似执行者。Erastin(爱拉斯汀)作为阳性对照，结果显示LPO水平明显升高。因此，ROS和LPO水平的提高提示铁死亡的发生。为了确定铁死亡的发生，申请人利用铁死亡的特异性抑制剂Ferrostatin-1处理细胞，胎盘蓝计数观察到加入铁死亡抑制剂之后活细胞数量增加，细胞增殖恢复。同时透射电镜观察到铁过载的细胞线粒体皱缩，电子密度增加，部分线粒体膜破裂，出现空泡，线粒体脊部分溶解。以上观察到的形态结构与经典的铁死亡诱导剂，如erastin诱导的结构变化高度一致。而添加铁死亡抑制剂Ferrostatin-1后，线粒体结构保持正常。因此，这些结果证实了铁超载可引起BMSCs发生铁死亡。

发明人研究了褪黑素对铁过载诱导的铁死亡导致骨髓基质细胞成骨分化功能降低是否有保护作用。结果发现：适当浓度的褪黑素可以完全恢复铁过载对骨髓基质细胞成骨分化功能的抑制作用。同时发明人还发现褪黑素可以显著减少铁死亡指标活性氧(ROS)和脂质过氧化物(LPO)的表达，从而减少铁死亡发生，电镜下同样观察到加入褪黑素后铁死亡细胞显著减少，线粒体结构恢复正常。综上，发明人证实了褪黑素可以通过抑制铁死亡从而预防铁过载导致的骨髓基质细胞成骨分化功能降低。

一定浓度的ROS是生物体生长、发育、繁殖等生命过程所必需的。然而，当体内的抗氧化机制失衡，体内产生过多的ROS时，就会对组织和细胞造成严重的损伤。当组织细胞内的铁稳态被破坏时，过量的铁通过Fenton反应将H2O2和脂质过氧化物(LPO)转化为ROS。同时，铁螯合剂降低铁超载，可抑制erastin(爱拉斯汀)诱导的铁死亡。

骨质疏松/骨丢失的表现为如下至少一种的症状：骨髓基质细胞成骨分化功能障碍、骨髓基质细胞体外骨形成障碍、Wnt信号的靶基因表达降低、β-catenin入核减少、活性氧水平升高和脂质过氧化产物水平升高。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述Wnt信号的靶基因包括Smad6、Lef1、BMP4和CyclinD1中的至少一种。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述出现骨髓基质细胞成骨分化功能障碍表现为：如下的至少一种标志物的表达量降低：碱性磷酸酶、Runx2、OCN、OSX和COL1。

骨髓基质细胞体外骨形成障碍表现为：骨髓基质细胞体外钙盐结节的形成受到抑制。

本发明提供了铁死亡抑制剂在制备恢复铁过载导致的骨髓基质细胞成骨分化功能的药物中的应用。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述铁死亡抑制剂为褪黑素、铁螯合剂DFO、活性氧抑制剂或者脂质过氧化物抑制剂，Wnt信号激活剂为CHIR99201。

活性氧抑制剂或者脂质过氧化物抑制剂选自Ferrostatin-1、Melatonin、Liproxstatin-1、rosiglitazone、pioglitazone、troglitazone或Zileuton。

发明人分析了铁死亡是否是铁超载抑制BMSCs成骨细胞分化的诱因。结果显示加入铁死亡特异性抑制剂Ferrostatin-1抑制铁死亡后显著恢复成骨分化及成骨相关基因的表达。因此，发明人发现并证实铁过载抑制骨髓基质细胞成骨分化的主要原因是诱导细胞发生了铁死亡而非凋亡。

Ferrostain-1，它的化学名称为3-氨基-4-环己基氨基苯甲酸乙酯，分子式为C

Ferrostatin-1是一种脂质过氧化物清除剂，具有N-环己基部分，作为生物膜内亲脂锚，本身不影响细胞增殖、分化等生理性能，但可抑制其他药物诱导的细胞胞浆和脂质过氧化物积累。Ferrostatin-1为白色粉末，不溶于水，易溶于酒精和DMSO。

可选的，铁螯合剂选自去铁胺、去铁胺的衍生物、环吡唑胺、羟胺-铁离子螯合剂、异烟酰、苯甲酰腙类或羟基吡啶酮类；

优选地，去铁胺的衍生物为甲磺酸去铁胺。

在其他实施方式中，铁螯合剂也可选自其他类型的铁离子螯合剂，并不限于上述的几种类型。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述药物还包括药学上可接受的添加剂或辅料；优选地，药物的剂型选自片剂、丸剂、粉剂、混悬剂、凝胶、乳液、乳膏、颗粒剂、纳米颗粒、胶囊、栓剂、注射剂、喷雾或针剂。

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

铁是人体必需的微量元素之一，但过多的铁堆积在组织或细胞会导致疾病。

本实施例用柠檬酸铁铵(FAC)处理骨髓基质细胞，浓度选用生理浓度到目前临床上发现的铁过载病人最高血清铁浓度范围(i.e.110μg/dl到1100μg/dl)设置20μM、50μM、200μM体外模拟铁过载微环境,柠檬酸钠为对照。本实施例中未测试更高的铁浓度，原因在于更高的铁浓度在铁过载疾病中无法达到。FAC有效地模拟铁超载患者血浆中非转铁蛋白结合铁(NTBI)。碱性磷酸酶(ALP)为早期成骨分化的标志物，ALP活性在早期成骨过程中起着至关重要的作用，因此用碱性磷酸酶染色和活性检测来反映成骨分化，茜素红染色反映晚期钙盐结节的形成。基因Alp、Runx2、Osx、Col1作为成骨分化标志基因，采用Q-PCR检测其mRNA表达水平。

本研究通过体外摸拟铁过载微环境探究了铁过载对骨髓基质细胞体外成骨分化和骨形成的影响。结果表明，与对照组相比，FAC剂量依赖性的抑制体外BMSCs成骨分化即ALP表达和活性降低(参照图1中的A-B所示)，同时铁过载也会剂量依赖性的抑制BMSCs体外钙盐结节的形成(图1中的D所示)，成骨分化标志基因Alp、Runx2、Osx、Col1的相对表达量也会剂量依赖性的显著降低(图1中的C所示)。

实施例2

前期实验观察发现铁过载的BMSCs增殖受到影响，细胞出现大量死亡，而其在铁过载患者中产生的影响不容忽视。因此，本实施例通过高清的显微镜直接进行形态学观察。

本实施例同时研究了铁超载对BMSCs细胞活力和细胞死亡的影响。通过CCK-8检查细胞活性，在FAC处理后的第3天，胎盘蓝染色直接计数细胞死亡百分比及细胞增殖情况(相同情况下1ul体积所含细胞数)。

实验结果显示，随着FAC浓度的增加，BMSCs的形态发生了不规则的变化，有更多的皱缩细胞和可见的漂浮细胞，尤其是在FAC浓度较高时(参照图2中的A所示)。细胞的活力降低(参照图2中的E所示)，细胞死亡百分率显著升高(参照图2中的B所示)，总细胞数(参照图2中的D所示)。

同时为了探究此时细胞死亡类型，申请人通过western blot检测自噬及焦亡的关键蛋白，LC3-II/Ⅰ的变化比率用来评估自噬的变化。焦亡是另一种类型的细胞程序性死亡，特点是激活的caspase-1发起大量炎性因子的释放。因此，检测caspase-1蛋白的变化情况用于判断焦亡。

检测调控细胞死亡的类型显示：LC3-II/Ⅰ和caspase-1在不同的组没有明显变化(图2中的J-K所示)。因此，在铁超载的中BMSCs未发生自噬和焦亡。

通过采用流式细胞术Annexin V和PI双染色细胞检测凋亡。并选用高效凋亡抑制剂Q-VD-Oph(QVD)检测凋亡抑制剂是否能恢复BMSCs的成骨分化。Q-VD-Oph是一种不可逆的caspase抑制剂，具有较高的抗凋亡能力，可高度抑制caspase 1、3、7、8、9、10和12。

凋亡结果表明，FAC 50μM和200μM均可诱导细胞凋亡。此外，铁螯合剂去铁胺(DFO)作用于FAC 50μM处理的细胞，以剂量依赖的方式显著降低了细胞的凋亡率(图2中的F所示)。同时用DFO处理BMSC检测成骨分化情况，结果显示DFO可以部分恢复铁过载导致的成骨分化降低(图2中的G所示)。

本实施例的实验结果证实了铁超载可导致一定程度的细胞凋亡，同时验证了抑制细胞凋亡是否能逆转铁超载抑制的成骨细胞分化。

利用选择性凋亡抑制剂Q-VD-Oph抑制了FAC 50μM处理的BMSCs发生凋亡(图2中的H所示)，但不同浓度的Q-VD-Oph抑制凋亡均不能挽救铁超载引起的ALP染色下降或ALP活性下降(图2中的I所示)。综上所述，本实施例的结果表明，这些形式的调控细胞死亡并不是铁超载阻碍成骨细胞分化的主要原因。

实施例3

发明人提供了一种新的受调控的细胞死亡形式——铁死亡是否参与了铁超载对骨髓间充质干细胞的影响。最初，发明人发现铁转运相关蛋白DMT1，Tfr1一种参与细胞内Fe

由于细胞内过量的铁可能通过Fenton反应产生ROS导致铁死亡，进一步使用细胞渗透探针H2DCFDA来评估ROS。结果显示，与未处理组相比，FAC处理组ROS水平明显升高(图3中的C所示)。

脂质过氧化产物(LPO)是铁死亡的另一个指标，它被认为是铁死亡最接近的执行者，使用erastin(爱拉斯汀)作为阳性对照，它是一种典型的铁死亡诱导剂，结果显示，LPO水平呈剂量依赖性显著增加(图3中D所示)。

因此，ROS和LPO水平的提高可能均与铁死亡有关。

为了进一步确定抑制铁死亡是否能减少细胞死亡，我们利用一种特异性的铁死亡抑制剂Ferrostatin-1(Fer)和50μM的FAC同时处理BMSCs。结果显示，活细胞的数量增加,抑制铁死亡可以挽救细胞增殖,减少细胞死亡(图3中的E所示)。

为了进一步证实铁死亡的发生，我们用透射电镜观察FAC 50μM处理BMSCs后的线粒体和细胞核的形态变化。

结果显示，正常组细胞内铁超载对细胞核没有影响，而FAC 50μM处理后的骨髓间充质干细胞线粒体明显缩小，电子密度增加。部分线粒体膜破裂，部分线粒体出现空泡，线粒体脊部部分溶解(图3中的F所示)。上述观察到的形态结构与Erastin、RSL3等经典的铁死亡诱导剂诱导的结构变化高度一致。

而在加入铁死亡抑制剂后(FAC+Fer)，线粒体结构保持正常(图3中的F所示)。因此，这些结果证实了铁超载可引起BMSCs发生铁死亡。

实施例4

本实施例中，发明人分析铁死亡抑制剂ferrostain-1和是否可以挽救铁超载抑制的BMSCs成骨分化。

本实施例采用50μM的FAC和不同浓度的ferrostain-1对BMSCs进行处理，ALP活性与ALP染色都显著恢复(图4中A所示)，qPCR检测结果显示，几种成骨标记物基因Alp、Runx2、Osx和Col1的mRNA表达也显著提高(图4中的B所示)。

通过铁死亡抑制剂ferrostain-1和铁螯合剂DFO对成骨细胞分化的促进作用表明，铁死亡是铁超载抑制骨髓间充质干细胞分化的原因。

实施例5

为了阐明铁死亡如何抑制骨髓间充质干细胞的成骨分化，本实施例研究了Wnt信号通路是否与之相关，因为它是调节骨形成的重要途径。

研究发现，经FAC处理3天后Wnt信号通路的4个靶基因Smad6、Lef1、Bmp4和CyclinD1的mRNA表达均下调。而在对照组对其表达无显著影响。说明FAC诱导的铁死亡特异性地抑制了Wnt信号通路(图5中A所示)。

然后我们用ferrostain-1抑制铁死亡，发现Smad6、Lef1、Bmp4和CyclinD1的mRNA表达都有一定程度的提高(图5中B所示)。因此，这些结果表明Wnt信号通路与铁死亡有关。

当FAC增加ROS水平时，通过Wnt信号激活剂CHIR-99021(C91)对FAC处理的BMSCs检测ROS水平的变化。探针检测到的活性氧荧光显示，5μM的C91可使50μM的FAC诱导的活性氧水平降低(图5中C所示)。此外，C91对FAC 50μM诱导的细胞死亡也有明显的抑制作用(图5中D所示)。同时也检测到C91可以降低铁过载导致的Tfr1和DMT1升高(图5中E所示)。

进一步地，本实施例用透射电镜观察了C91对FAC诱导的铁死亡的影响。FAC处理BMSCs 3d后，可见典型的线粒体损伤。C91添加的细胞线粒体结构和形态与空白组正常BMSCs相似(图5中的F所示),电镜图分别是指在5000x和30000x拍照。

实施例6

本实施例证实了铁死亡可导致Wnt信号通路下调，激活Wnt信号通路可逆转ROS水平，降低铁死亡。C91和FAC处理BMSCs后，成功上调了Wnt信号通路中三个靶基因(Smad6、Lef1和CyclinD1)的表达(图6中的A所示)。而经FAC 50μM处理后，C91不能完全恢复这些基因的表达，这再次证实了铁死亡对Wnt信号通路的抑制作用。

进一步观察Wnt激活剂C91对FAC损伤骨髓间充质干细胞成骨分化的影响。经FAC处理的骨髓间充质干细胞中ALP染色较少，但添加C91后ALP染色明显升高，且呈剂量依赖性(图6中的B所示)。C91也检测到ALP的活性升高，证实了Wnt信号通路对骨形成的积极作用。FAC下调成骨标志物(ALP、Runx2、Osx和Col1)的表达也可通过Wnt的激活而上调，Osx和Col1的表达甚至完全恢复(图6中的C所示)，说明Wnt信号通路在铁死亡抑制成骨细胞分化过程中发挥重要作用。

实施例7

发明人希望寻找一种高效低风险的药物用于预防或者治疗铁过载导致的骨质疏松，而褪黑素(Melatonin)可以通过褪黑素受体依赖和受体非依赖性的途径预防骨质降解和促进骨骼形成，在其预防铁过载诱发铁死亡的过程中可能起到保护作用。

本实施例通过脂质过氧化物的荧光探针检测褪黑素对FAC 50μM诱导的铁死亡标志物LPO的影响，通过流式细胞仪和电镜分别观察褪黑素对铁过载导致的骨髓基质细胞凋亡和铁死亡的影响,电镜图分别是指在5000x和20000x拍照，Mel50指褪黑素的浓度为50μM。

实验证明，褪黑素可以有效的降低细胞内铁过载诱发的LPO显著增高(图7中的A所示)，以及部分降低铁过载导致的Tfr1和DMT1升高(图7中的B所示)。电镜图显示褪黑素可以有效的预防铁过载时线粒体的改变(图7中的C所示)。

综上所述，褪黑素可以抑制铁过载导致的骨髓基质细胞发生铁死亡降低铁的吸收。

实施例8

本实施例采用50μM的FAC和不同浓度的Melatonin对BMSCs进行处理，ALP活性与ALP染色都显著恢复(图8中A所示)，在50μM的Melatonin时ALP活性完全恢复，几种成骨标记物基因Alp、Runx2、OSX和Col1的mRNA表达也显著提高了(图8中B所示)，以及Wnt靶基因Smad6、BMP4、Lef1和CyclinD1几乎恢复(图8中C所示)，Mel50指Melatonin的浓度为50μM。处理流程参照图8中E所示。

综上，褪黑素可以有效的挽救铁过载导致的骨髓基质细胞成骨分化功能障碍。

通过免疫荧光的方法验证褪黑素挽救铁过载导致成骨分化功能降低的机制。紫色荧光DAPI为细胞核荧光染料，绿色荧光为结合β-catenin所发出的荧光，merge为两者图片的重叠，箭头所指的是结合后的天蓝色表示进入细胞核的β-catenin，由此检测褪黑素对Wnt/β-catenin的影响。铁过载时β-catenin入核显著减少，而在加入褪黑素以后β-catenin入核恢复(图8中D所示)。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。