奶牛血清中孕酮的ELISA检测试剂盒

摘要

本发明公开了一种检测奶牛血清中孕酮的ELISA试剂盒，该试剂盒包括包被有孕酮人工抗原的酶标板、孕酮单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的记羊抗鼠IgG、洗涤液、底物显色液、终止液、孕酮标准品溶液。该试剂盒利用间接竞争法中包被抗原作为固相抗原和抗体结合，具有更高的灵敏度，通过准确测定血清孕酮浓度可以为奶牛排卵发情、早期妊娠诊断、预防和治疗奶牛繁殖系统疾病提供切实可靠的依据。

说明书

技术领域

本发明属于生物制品检测技术领域，具体涉及一种通过间接竞争ELISA法检测奶牛血清中孕酮的试剂盒。

背景技术

孕酮(P

目前针对孕酮的检测，国内外已有诊断试剂盒供应市场，主要是双抗体夹心法及直接竞争法的酶联免疫试剂盒，针对的检测样本主要是乳汁和粪便，适用于血清中孕酮的间接竞争ELISA检测试剂盒尚未见报道。但是，用乳汁中孕酮诊断妊娠牛的界限值各家不一，同时孕酮在全乳中分布不均，多在乳脂中，与乳脂率密切相关，受采样时间和方法影响较大；粪便中成分较复杂，干扰因素较多，且测定步骤繁琐。针对奶牛体内孕酮含量较低、难以准确定量的问题，本发明建立了一种简便、快速、灵敏的孕酮间接竞争ELISA测定方法，通过准确测定血清孕酮浓度可以为奶牛排卵发情、早期妊娠诊断、预防和治疗奶牛繁殖系统疾病提供切实可靠的依据。

发明内容

为了解决奶牛体内孕酮含量较低、难以准确定量的问题，本发明提供了一种通过间接竞争ELISA法检测奶牛血清孕酮的试剂盒。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种检测奶牛血清中孕酮的ELISA试剂盒，包括：包被有孕酮人工抗原的酶标板，孕酮单克隆抗体，辣根过氧化物酶标记的记羊抗鼠IgG，洗涤液，底物显色液，终止液，孕酮标准品溶液。

进一步地，所述的包被有孕酮人工抗原的酶标板是通过含0.5％山羊血清的PBST进行封闭的，所述的孕酮单克隆抗体是由保藏号为CCTCC NO：C2015170的孕酮杂交瘤细胞LX20150930制备的。

进一步地，封闭条件是37℃温育3h；抗原与抗体反应条件为37℃温育50min。

基于上述ELISA试剂盒用于检测奶牛血清中孕酮的方法，具体如下：

(1)采样与检测：采集待检牛静脉血，分离血清；

(2)加样：在酶标包被板上设空白孔(不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、标准品孔、待测样品孔，将孕酮标准品溶液和待测样品分别加于酶标板孔底部，50μL/孔，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；

(3)温育：用封板膜封板，置37℃温育50分钟，用PBST洗涤；

(4)加酶标二抗：将HRP标记的记羊抗鼠IgG用二抗稀释液(PBST，pH 7.4)稀释后，每孔加入100μL，37℃温育30min，用PBST洗涤；

(5)加底物：每孔加入100μL底物(TMB)，微微震荡混匀，避光、用封板膜封板，置37℃温育15分钟；

(6)终止：加入浓度为2mol/L的硫酸终止液，每孔加入50μL；

(7)测定：加入硫酸终止液后15min内测OD

(8)计算孕酮含量：根据标准品的浓度与ODD

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

1、本发明利用了间接竞争法中包被抗原作为固相抗原和抗体结合，其接触面积较液相抗原小，因此固相抗原与待测液相抗原结合抗体的机会是不同的，接近顺序饱和法，即固相抗原的相对结合率为0％，所以间接竞争法比直接竞争法具有更大的抑制曲线斜率，从而达到更大的灵敏度。

2、检测样本选择了血样，血清较乳汁和粪样，具有更快的分泌高峰，同时避免了乳汁中孕酮诊断妊娠牛的界限值各家不一、孕酮含量与乳脂率密切相关受采样时间和方法影响等缺点，也避免了粪便中成分较复杂，干扰因素较多，且测定步骤繁琐等缺点。

3、本发明所述的ELISA方法与雌酚酮、雌二醇、雌三醇、睾酮、雄酮、去氢表雄酮、异黄酮均无交叉反应，方法的灵敏度为0.243ng/mL，批内误差为3.94％，批间误差为5.98％，精确度较好。

具体实施方式

主要试剂：

孕酮人工抗原(上海药巢生物工程有限公司)；孕酮单克隆抗体由杂交瘤细胞LX20150930分泌，该杂交瘤细胞LX20150930于2015年9月30日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO：C2015170，其制备及纯化方法参照专利《一种猴早期妊娠检测的孕酮胶体金免疫层析试纸条》(专利号：ZL 201510641133.1)；山羊血清(武汉博士德生物工程有限公司)；孕酮标准品(中国计量科学研究院化学所)；辣根过氧化物酶羊抗鼠IgG(Biosharp公司)；TMB底物液(上海碧云天有限公司)；吐温-20(国药集团化学试剂有限公司)。

主要溶液配制：

包被稀释液(即为0.01mol/L，pH＝7.4的PBS)：准确称取NaCl 8.00g，KH

洗涤液(即为PBST，pH＝7.4)：准确称取NaCl 8.00g，KH

封闭缓冲液：准确量取山羊血清5ml，加入1000mLPBST，搅拌混匀直至完全溶解；

二抗稀释液(即为PBST，pH＝7.4)：准确称取NaCl 8.00g，KH

终止液：准确量取浓硫酸100mL，缓慢滴加到800mL超纯水。

间接竞争ELISA操作方法：

1)包被：抗原用包被稀释液稀释，100μL/孔，4℃过夜；

2)洗涤：甩掉包被原溶液，拍干，每孔加入洗涤液200μL，静置30s，拍干，重复3次；

3)封闭：封闭液250μL/孔，37℃3h，洗涤同步骤2)；

4)竞争：一定浓度的孕酮单抗与检测样本等比例混匀后，每孔加入100μL，

37℃60min，洗涤同步骤2)；

5)加酶标二抗：将HRP酶标二抗用稀释液稀释到工作浓度后，100μL/孔，

37℃45min，洗涤同步骤2)；

6)加底物：TMB 100μL/孔，微微震荡混匀，避光、37℃15min；

7)终止：2mol/L硫酸50μL/孔；测定：加终止液后15min内测OD

ELISA作为一种多步骤操作的检测方法，会比其他单一步骤操作的检测方法具有更多干扰因素，所关系到的每个主观操作过程、每个客观环境条件的变化都可以体现在最后的测定结果中。这些影响因素包括包被体系、封闭体系、洗涤体系、酶标抗体反应体系、各类稀释液的蛋白浓度和pH值，到总体条件筛选完毕整合在一起时测定的灵敏度、特异性试验等，在建立检测方法的过程中都要进行全面的优化和测定。

1、包被抗原和孕酮单克隆抗体工作浓度的初步确定

采用方阵滴定法，横向稀释包被抗原分别到3200ng/mL、1600ng/mL、800ng/mL、400ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL，纵向稀释孕酮单克隆抗体分别做1:2000、1:4000、1:6000、1:8000、1:10000、1:20000、1:40000、1:80000、1:160000、1:320000、1:640000、1:1280000倍稀释，按照间接ELISA程序测定。选择OD

结果显示(见表1)，OD

表1间接ELISA法检测包被抗原最适工作浓度方阵试验结果(OD

2、最佳包被浓度的确定

以上述方阵滴定法确定的几个包被抗原浓度和相对应的抗体稀释度的组合进行ic-ELISA试验，每个包被浓度做3个重复，竞争物为孕酮标准品原型(5个梯度和一个0ng/mL)，测定OD

3、最佳抗体稀释度的确定

以最佳包被浓度800ng/mL包被酶标板，将抗体以1:8000为中心稀释度，等差稀释抗体浓度为1:4000、1:6000、1:8000、1:10000、1:12000，每个浓度做3个重复，进行ic-ELISA试验，绘制标准曲线，计算IC

4、抗原包被液的确定

以上述试验结果确定的最适抗体稀释度为阳性对照，以阴性血清为阴性对照，分别用磷酸盐缓冲液、Tris盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液作包被液，全部为4℃包被。按间接ELISA操作程序测定，测定OD

5、包被时间、温度的确定

包被时间、温度分别设计为：37℃1h、37℃2h、37℃2h+4℃过夜、37℃1h+4℃过夜、4℃过夜、4℃过夜+37℃1h、4℃过夜+37℃2h。以确定的最适抗体稀释度为阳性对照，以阴性血清为阴性对照，每孔设重复孔，按间接ELISA操作程序测定，采用不同的包被时间、温度进行包被效果比较，最终选用4℃过夜作为本检测方法的包被时间、温度。

6、封闭液及封闭时间的确定

封闭液分别设计为不同浓度的山羊血清、脱脂奶粉、BSA、OVA的PBST及TBST溶液，封闭方式均为37℃2h，以确定的最适抗体稀释度为阳性对照，以阴性血清为阴性对照，每孔设重复孔，按间接ELISA操作程序测定，根据P/N值确定最佳封闭液，最终封闭液选为山羊血清溶于PBST形成浓度为0.5％的溶液，封闭时间和温度选为37℃3h。

7、抗原抗体反应时间的确定

分别设计为：37℃40min、37℃50min、37℃60min、37℃70min，采用不同的抗原抗体反应时间进行结合效果比较，最佳的抗原抗体反应时间为37℃50min。

8、酶标二抗稀释浓度的确定

分别设计为1:2000、1:3000、1:4000、1:5000、1:6000、1:7000、1:8000稀释度，按间接ELISA操作程序测定，采用不同的酶标二抗稀释度进行结合效果比较，最佳酶标二抗稀释度为1:6000。

9、酶标二抗稀释液的确定

分别用不同浓度的脱脂奶粉、牛血清白蛋白的PBST溶液做稀释液，反应方式均为37℃50min，按间接ELISA操作程序测定，采用不同的酶标二抗稀释液进行结合效果比较，选取的最佳酶标二抗稀释液为PBST。

10、酶标抗体反应时间的确定

分别设计为：37℃30min、37℃40min、37℃50min、37℃60min，按间接ELISA操作程序测定，采用不同的酶标二抗反应时间进行结合效果比较，选取的最佳酶标二抗反应时间选为37℃30min。

综上所述，本发明建立了奶牛血清孕酮间接竞争ELISA法，并对相应的参数条件进行了优化，上述实验结果表明，包被抗原的最佳浓度为800ng/mL，单克隆抗体的工作稀释度为1:8000，包被缓冲液为PBS(0.01mol/L,pH＝7.4)，包被条件为4℃过夜，封闭缓冲液为0.5％山羊血清的PBST，封闭条件为37℃3h，抗原抗体反应条件为37℃50min，酶标抗体的工作浓度为1:6000，酶标抗体的稀释液是PBST，酶标抗体的反应条件为37℃30min。

实施例2奶牛血清中孕酮间接竞争ELISA检测效果

1、标准曲线的制作

将竞争P

根据上述试验结果，进行ic-ELISA试验，在横坐标上绘制孕酮浓度的对数值，纵坐标上绘制Logit(B/B0)，建立了ic-ELISA标准曲线y＝2.09405-2.11551x(R

2、特异性检测

以P

交叉反应结果见表2，试剂盒与雌酚酮、雌二醇、雌三醇、睾酮、雄酮、去氢表雄酮、异黄酮均无交叉反应。

表2交叉反应试验

3、灵敏度检测

按照上述标准曲线的操作，测定36份0ng/mL的标准品溶液的OD值，并将其逐个代入标准曲线的回归方程计算相对应的平均数(X0)和标准差(S)，再计算X0-2S，以此数在剂量-反应曲线上计算出或查出相对应的剂量，得到竞争法的检测灵敏度。本方法的灵敏度为0.243ng/mL。

表3灵敏度测定

4、精确度检测

同时检测6个水平的孕酮标准品，并作6个重复，测定OD

在不同检测日期进行3批试验，用批间变异系数表示批间误差，结果如表5，各个水平的批间变异系数在4.41％～8.70％之间，平均为5.98％。由批内和批间误差可知，本方法的精确度较好。

表4批内变异系数

表5批间变异系数