腹主动脉瘤的肠道微生物标志物及其应用

摘要

本发明涉及腹主动脉瘤的肠道微生物标志物及其应用。本发明基于肠道微生物群丰度的分类器建模评价校验方法确定了30种腹主动脉瘤的肠道微生物标志物，其中上调的肠道微生物标志物有25种，下调的肠道微生物标志物有5种，根据腹主动脉瘤的肠道微生物标志物可以有效早期筛查腹主动脉瘤的高危人群或者发现早期患者，以便尽早预防腹主动脉瘤的进一步扩大和降低破裂风险，以及监控腹主动脉瘤的治疗效果。同时该肠道微生物标志物可用于制备诊断试剂盒及治疗药物。本发明克服了现有腹主动脉瘤诊断不能做到早期筛查、不能预测腹主动脉瘤发病以及发展趋势等缺点，能够帮助疾病病理分型以及药物作用靶点研究、精准用药、发病机理的研究等。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，主要涉及腹主动脉瘤的肠道微生物标志物及其应用。

背景技术

腹主动脉瘤为最常见的动脉瘤，是一种严重威胁人类健康的循环系统疾病。腹主动脉瘤(abdominal aortic aneurysm，AAA)是指腹主动脉某一段的异常或局限性膨胀，其横径＞3cm或超过正常腹主动脉直径的50％，最终使得管壁无法承受血流的冲击而出现破裂的一种高危疾病。腹主动脉瘤的发病率呈逐年增高趋势，大部分发生在50岁以上，尤其男性以及具有此病家族史者，其他危险因素包括吸烟、高血压、冠心病、高胆固醇、外周动脉疾病、高同型半胱氨酸水平等。其发病机制包括：基质金属蛋白酶的作用导致细胞外基质的破坏；炎症和氧化应激；血管平滑肌细胞凋亡；先天免疫系统异常，包括Toll样受体上调、趋化因子受体激活以及补体沉积。另外，近来年有研究显示高同型半胱氨酸血症、色氨酸的代谢中间产物参与了腹主动脉瘤的进展。

腹主动脉瘤是与高血压相关的高度致死性心血管疾病，目前尚无有效药物治疗方法。腹主动脉瘤在破裂前通常无明显症状，但是腹主动脉管壁薄弱、张力减退的结构性病理改变已经存在，当用力排便、发怒、搬重物时，都容易诱发瘤破裂。它的可怕性在于瘤体一旦破裂，必将引起大量出血，致使患者多死于失血性休克，并迅速致死，因此有人体内“不定时炸弹”之称，常常趁人不备突然“爆炸”。特别是高龄伴有其他疾病的病人破裂后急性出血死亡率更高，一旦破裂后的死亡率是85％至90％。在医疗如此发达的今天，面对这一隐匿性很强但危害性极大的疾病，仍是医药领域的首要难题。因此早发现早诊断早治疗，避免腹主动脉瘤加重和破裂已成为当务之急。

目前临床上对于腹主动脉瘤的诊断主要依靠腹部B超和CTA。腹主动脉的超声检查比下肢静脉、颈动脉困难，因为腹主动脉被前肠管和其他脏器遮挡，所以超声检查图像不清晰，诊断较为困难，尤其是直径3-4cm大的早期动脉瘤在筛查发现的腹主动脉瘤中所占比例不到10％。CTA(CT血管造影)是诊断腹主动脉瘤的金标准。但是有严格的禁忌症，对碘造影剂过敏、肝肾功能不全、严重心律不齐者禁用。而且CTA与大剂量的电离辐射有关，可能会导致罹患癌症风险显著增加。现阶段多数体检单位未对腹主动脉做特异性的体检，所以腹主动脉瘤很难发现。

近年来，科学家们通过研究发现，机体肠道微生物群与人类多种疾病密切相关。但目前肠道微生物群与腹主动脉瘤的关系尚未报道，腹主动脉瘤尚无可靠的肠道微生物标志物。此外，现有的诊断标准不能早期预测腹主动脉瘤的发病。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提出了腹主动脉瘤的肠道微生物标志物及其应用，根据腹主动脉瘤的肠道微生物标志物可以有效早期筛查腹主动脉瘤的高危人群或者发现早期患者，以便尽早预防腹主动脉瘤的进一步扩大和降低破裂风险，能够帮助疾病病理分型以及药物作用靶点研究、精准用药、发病机理的研究等。

本发明的技术方案如下：

本发明提供腹主动脉瘤的肠道微生物标志物，所述肠道微生物标志物包括30种微生物，

其中，腹主动脉瘤患者体内升高的肠道微生物标志物如下：

(1)Roseitalea_porphyridii；

(2)Streptomyces_peucetius；

(3)Pseudonocardia_autotrophica；

(4)Agrobacterium_fabrum；

(5)Enterobacter_cloacae_complex_sp._FDA-CDC-AR_0132；

(6)Gordonibacter_pamelaeae；

(7)Neokomagataea_sp._Ha5；

(8)Enterobacter_ludwigii；

(9)Simian_immunodeficiency_virus；

(10)Burkholderia_plantarii；

(11)Burkholderia_multivorans；

(12)Saimiriine_alphaherpesvirus_1；

(13)Actinosynnema_pretiosum；

(14)Georgenia_sp._ZLJ0423；

(15)Amycolatopsis_orientalis；

(16)Acetobacter_persici；

(17)Ruthenibacterium_lactatiformans；

(18)Synechococcus_sp._CB0101；

(19)Xanthomonas_vasicola；

(20)Geobacter_anodireducens；

(21)Cupriavidus_metallidurans；

(22)Adoxophyes_honmai_entomopoxvirus；

(23)Actinomadura_sp._WMMA1423；

(24)Legionella_oakridgensis；

(25)Klebsiella_quasipneumoniae；

腹主动脉瘤患者体内降低的肠道微生物标志物如下：

(1)Haemophilus_parainfluenzae；

(2)Candidatus_Rhodoluna_planktonica；

(3)Vibrio_phage_PWH3a-P1；

(4)Roseburia_intestinalis；

(5)Pseudomonas_asplenii。

本发明中，确定上述腹主动脉瘤的肠道微生物标志物的方法为基于肠道微生物群丰度的分类器建模评价校验方法，步骤如下：

I、获取31个健康人和33个腹主动脉瘤患者的粪便样品，提取DNA进行宏基因组测序，方法为PE150，用kneaddata对原始数据进行质控去宿主，平均碱基质量小于20的reads切除，用kraken2进行物种注释，计算各样品中每个物种的相对丰度；

II、将健康人和腹主动脉瘤患者编号，用R语言生成30个随机数，相应数字对应的人作为训练集，剩余共34个健康人和腹主动脉瘤患者作为测试集，训练集利用机器学习随机森林模型进行训练，测试集进行分类预测初步评估模型好坏，如果预测的准确度低于75％则优化随机森林模型参数重新训练，直至预测准确度高于75％，十折交叉验证查看最低错误率时对应的feature数，根据十折交叉验证结果和平均精度下降(Mean DecreaseAccuracy)重要性评分选出肠道微生物标志物，微生物数量为32时错误率最低，为最佳模型；

III、选取按平均精度下降(Mean Decrease Accuracy)降序排列前30名的肠道微生物作为腹主动脉瘤的肠道微生物标志物，划分为肠道微生物标志物升高组(AAA升高)和肠道微生物标志物降低组(AAA降低)两部分。

本发明提供上述腹主动脉瘤的肠道微生物标志物作为预测因子在早期筛查腹主动脉瘤中的应用。

本发明通过对检测对象中分离出的肠道微生物群进行基因测序，将所获得的腹主动脉瘤的肠道微生物标志物的丰度值与预定值比较，进行腹主动脉瘤的早期筛查。

本发明提供上述腹主动脉瘤的肠道微生物标志物在制备腹主动脉瘤早期筛查或预测的工具中的应用。

根据本发明优选的，所述腹主动脉瘤早期筛查或预测的工具包括腹主动脉瘤早期筛查或预测试剂盒。

进一步优选的，所述腹主动脉瘤早期筛查或预测试剂盒包括上述腹主动脉瘤的肠道微生物标志物的检测试剂。

进一步优选的，所述检测试剂包括上述腹主动脉瘤的肠道微生物标志物的特异性引物。

利用上述试剂盒可以检测腹主动脉瘤的肠道微生物标志物的丰度，由此可通过所得到的丰度值与预定值进行比较，从而对检测对象进行腹主动脉瘤的早期筛查或预测，或者监控腹主动脉瘤患者的治疗效果。

本发明提供上述腹主动脉瘤的肠道微生物标志物在制备治疗腹主动脉瘤的药物中的应用。

根据本发明优选的，所述应用是以腹主动脉瘤的肠道微生物标志物为靶点进行治疗腹主动脉瘤的药物的制备或筛选。

本发明可利用候选药物使用前和使用后对本发明中腹主动脉瘤的肠道微生物标志物的影响，确定候选药物是否可以用于治疗或者预防腹主动脉瘤。

根据本发明优选的，所述药物是以腹主动脉瘤的肠道微生物标志物为靶点发挥作用。

本发明提供上述腹主动脉瘤的肠道微生物标志物在预测腹主动脉瘤患者个体治疗效果中的应用。

本发明的有益效果如下：

本发明基于肠道微生物群丰度的分类器建模评价校验方法确定了30种腹主动脉瘤的肠道微生物标志物，其中上调的肠道微生物标志物有25种，下调的肠道微生物标志物有5种，根据上述腹主动脉瘤的肠道微生物标志物可以有效早期筛查腹主动脉瘤的高危人群或者发现早期患者，以便尽早预防腹主动脉瘤的进一步扩大和降低破裂风险，以及监控腹主动脉瘤的治疗效果。同时该肠道微生物标志物可用于制备诊断试剂盒及治疗药物。本发明克服了现有腹主动脉瘤诊断不能做到早期筛查、不能预测腹主动脉瘤发病以及发展趋势等缺点，能够帮助疾病病理分型以及药物作用靶点研究、精准用药、发病机理的研究等，以及提供新的治疗方案。

附图说明

图1是基于肠道微生物群丰度的分类器建模评价校验方法确定肠道微生物标志物的流程图；

图2是腹主动脉瘤患者组和健康人组的肠道微生物界水平物种组成的冲击图；其中C为健康人组、P为腹主动脉瘤患者组；右侧为健康人组和腹主动脉瘤患者组的肠道微生物界水平的拉丁文名称；具体地，Archaea为古菌，Bacteria为细菌，Eukaryota为真核生物，Viruses为病毒；

图3是健康人组和腹主动脉瘤患者组间肠道微生物种水平对比PCoA图；

图4是利用另一数据集(测试集)验证随机森林模型优劣结果，其中(a)为健康人组预测结果，(b)为腹主动脉瘤患者组预测结果；

图5是十折交叉验证结果及随机森林确定的30个肠道菌群微生物标志物结果；图中，Actinobacteria：放线菌门；Cyanobacteria：蓝藻细菌门；Firmicutes：厚壁菌门；Proteobacteria：变形菌门；Virus：病毒；图中左侧为实施例1中筛选出的30种差异微生物物种水平的拉丁文名称；图中小图为十折交叉验证结果；

图6是腹主动脉瘤富集肠道微生物指数(AAA increased microbial index)和腹主动脉瘤减少肠道微生物指数(AAA decreased microbial index)的组间分布小提琴图；其中(a)为腹主动脉瘤富集肠道微生物指数的组间分布小提琴图，(b)为腹主动脉瘤减少肠道微生物指数的组间分布小提琴图，#表示wilcoxon秩和检验P＜0.05；

图7是腹主动脉瘤富集肠道微生物指数(AAA increased microbial index)和腹主动脉瘤减少肠道微生物指数(AAA decreased microbial index)在测试集中进行受试者工作特征曲线(ROC)和曲线下面积(AUC)评估图；

图8是舒张压、收缩压、胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、同型半胱氨酸、葡萄糖、尿酸指标组间分布的小提琴图；其中SBP为舒张压，DBP为收缩压，TC为血清总胆固醇，TG为血清甘油三酯，HDL为高密度脂蛋白，LDL为低密度脂蛋白，HCY为同型半胱氨酸，glucose为葡萄糖，UA为尿酸，#表示wilcoxon秩和检验P＜0.05；

图9是腹主动脉瘤患者组和健康人组的收缩压、舒张压、胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、同型半胱氨酸、尿酸、葡萄糖指数在测试集中进行受试者工作曲线(ROC)和曲线下面积(AUC)评估图；其中SBP为舒张压，DBP为收缩压，TC为血清总胆固醇，TG为血清甘油三酯，HDL为高密度脂蛋白，LDL为低密度脂蛋白，HCY为同型半胱氨酸，glucose为葡萄糖，UA为尿酸。

具体实施方式

下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。

基于肠道微生物群丰度的分类器建模评价校验方法确定肠道微生物标志物的流程如图1所示，首先获取健康人及腹主动脉瘤患者的粪便样本和临床指标指数，然后进行宏基因组测序获得物种组成，建立随机森林模型，优化模型参数并进行训练，采用另一数据集进行预测，评估模型优劣，建立好模型之后，根据物种贡献度和十折交叉验证确定肠道微生物标志物的数量及代表性肠道微生物标志物，计算肠道微生物标志物指标，将各指标分别作为一个变量做受试者工作特征曲线，并计算曲线下面积，确定其准确性。

实施例1

基于肠道微生物群丰度的分类器建模评价校验方法确定腹主动脉瘤的肠道微生物标志物，包括步骤如下：

1、研究对象的确定

腹主动脉瘤患者组和健康人组的排除标准为：

(1)罹患以下疾病者：免疫系统疾病(SLE、关节炎等)、肿瘤性疾病、肝硬化、甲减、甲亢、外周血管疾病、急性感染性疾病；

(2)近两周内服用过抗生素或近期感染、白细胞、中性粒细胞、CRP等炎症标志物明显升高者；

(3)近一月内大量服用其他药物。

腹主动脉瘤患者组和健康人组的信息如表1所示。

表1、研究对象的临床资料信息

注：NS：P＞0.05，无显著差异；##：P＜0.01，有显著差异。

2、粪便采集和保存

采集腹主动脉瘤患者组和健康人组新鲜的、中后段粪便样本一管，立即冻存于-80℃冰箱。

3、肠道微生物基因组DNA提取

(1)称量粪便25-30mg，样品之间用酒精将勺子消毒，用去酶ep管存放样品，做好标记；

(2)加入65℃水浴预热的2×CTAB，300μL/样，振荡10s，用95℃金属浴加热8min；

(3)加入300μL酚仿(饱和酚、氯仿、异戊醇体积比25:24:1)，振荡均匀，1000g/min，离心5min；

(4)取上清移至新的1.5mL ep管中，使用B518131试剂盒(sangon)，加入3倍体积(600μL)的溶胶液(B2液)；

(5)将上述800μL液体分次加入试剂盒中的分离柱，静置2min，12000g/min，离心1min；

(6)弃液体，在分离柱中加入400μL洗涤液，静置2min，12000g/min，离心1min；

(7)重复步骤(6)一次；

(8)弃回收管中废液，空管12000g/min，离心2min；

(9)将分离柱移入新的ep管中，加入60μL EB洗脱液，12000g/min，离心1min；

(10)用nanodrop2000测各样品DNA浓度和纯度。

4、宏基因组测序

将DNA样品随机打断后采用Illumina Novaseq测序平台的PE150策略，对每个样品进行宏基因组测序，每个样品产生6-12G clean reads。

5、数据分析

使用宏基因组测序数据质控软件kneaddata调用trimmomatic将平均质量＜20的reads去除并调用bowtie2比对至人类基因组去除宿主序列得到final reads；用fastqc评估final reads质量合格；用kraken2进行物种注释得到物种丰度表；用R脚本将物种丰度表标准化为相对丰度。

其中，腹主动脉瘤患者组和健康人组的肠道微生物界水平的物种组成冲击图如图2所示；腹主动脉瘤患者组和健康人组的肠道微生物种水平物种组成基于Bray-Curtis距离的PCoA分析结果如图3所示，置换多元方差分析(PERMANOVA)结果F值为7.2232，P值为0.0001，表明腹主动脉瘤患者组和健康人组的肠道微生物种水平物种组成差别显著。

6、模型构建及评估

将物种相对丰度作为输入，31例健康人和33例腹主动脉瘤患者编号1-64，用R语言生成1-64的30个随机数，相应数字对应的人作为训练集，剩余共34名健康人和腹主动脉瘤患者作为测试集，训练集利用随机森林进行训练，采用另一数据集(测试集)进行预测，评估模型优劣，如果测试集预测表型的准确度低于75％则重新调整随机森林参数；如图4(a)所示测试集的健康人中，16人中13人成功预测表型为健康人，预测成功率为81.25％，如图4(b)所示测试集的腹主动脉瘤患者中，18人中14人成功预测为腹主动脉瘤患者，预测成功率为77.78％，初步评估模型较好，可进行下一步操作，十折交叉验证查看最低错误率时对应的微生物数量，根据十折交叉验证结果和平均精度下降(Mean Decrease Accuracy)重要性评分选出肠道微生物标志物，微生物数量为32时错误率最低，为最佳模型。

7、确定肠道微生物标志物

选取按平均精度下降(Mean Decrease Accuracy)降序排列前30名的肠道微生物作为腹主动脉瘤的肠道微生物标志物，结果如图5所示，划分为肠道微生物标志物升高组(AAA升高)和肠道微生物标志物降低组(AAA降低)两部分，最终在AAA升高组的肠道微生物标志物数为25，在AAA降低组的肠道微生物标志物数为5；

其中，腹主动脉瘤患者体内升高的肠道微生物标志物如下：

(1)Roseitalea_porphyridii；

(2)Streptomyces_peucetius；

(3)Pseudonocardia_autotrophica；

(4)Agrobacterium_fabrum；

(5)Enterobacter_cloacae_complex_sp._FDA-CDC-AR_0132；

(6)Gordonibacter_pamelaeae；

(7)Neokomagataea_sp._Ha5；

(8)Enterobacter_ludwigii；

(9)Simian_immunodeficiency_virus；

(10)Burkholderia_plantarii；

(11)Burkholderia_multivorans；

(12)Saimiriine_alphaherpesvirus_1；

(13)Actinosynnema_pretiosum；

(14)Georgenia_sp._ZLJ0423；

(15)Amycolatopsis_orientalis；

(16)Acetobacter_persici；

(17)Ruthenibacterium_lactatiformans；

(18)Synechococcus_sp._CB0101；

(19)Xanthomonas_vasicola；

(20)Geobacter_anodireducens；

(21)Cupriavidus_metallidurans；

(22)Adoxophyes_honmai_entomopoxvirus；

(23)Actinomadura_sp._WMMA1423；

(24)Legionella_oakridgensis；

(25)Klebsiella_quasipneumoniae；

腹主动脉瘤患者体内降低的肠道微生物标志物如下：

(1)Haemophilus_parainfluenzae；

(2)Candidatus_Rhodoluna_planktonica；

(3)Vibrio_phage_PWH3a-P1；

(4)Roseburia_intestinalis；

(5)Pseudomonas_asplenii。

8.计算肠道微生物标志物指数

分别用以下公式计算各样品腹主动脉瘤富集肠道微生物指数(AAA increasedmicrobial index)和腹主动脉瘤减少肠道微生物指数(AAA decreased microbialindex)：

实施例2、评估筛选的肠道微生物标志物预测腹主动脉瘤风险的准确性

在测试集中，将实施例1中计算得到的腹主动脉瘤富集肠道微生物指数(AAAincreased microbial index)和腹主动脉瘤减少肠道微生物指数(AAA decreasedmicrobial index)分别作为输入，其组间分布如图6所示，用受试者工作特征曲线(ROC)的曲线下面积(AUC)分别评价腹主动脉瘤富集肠道微生物和腹主动脉瘤减少肠道微生物对腹主动脉瘤的识别能力，结果如图7所示，腹主动脉瘤富集肠道微生物指数(AAA increasedmicrobial index)作为输入时得到的AUC＝0.8856，对腹主动脉瘤的诊断识别能力较好，腹主动脉瘤减少肠道微生物指数(AAAdecreased microbial index)作为输入时得到的AUC＝0.9071，对腹主动脉瘤的诊断识别能力较好。

为了进一步体现腹主动脉瘤的肠道微生物标志物预测腹主动脉瘤风险的准确性，同时获取健康人组和腹主动脉瘤患者组的舒张压(SBP)、收缩压(DBP)、甘油三酯(TC)、胆固醇(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、同型半胱氨酸(Hcy)、葡萄糖(glucose)、尿酸(UA)指数，各指标的组间分布如图8所示，在测试集中分别作为输入，用受试者工作特征曲线(ROC)的曲线下面积(AUC)评价各指标对腹主动脉瘤的识别能力，结果如图9所示，舒张压(SBP)、收缩压(DBP)、甘油三酯(TC)、胆固醇(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、同型半胱氨酸(Hcy)、葡萄糖(glucose)、尿酸(UA)作为输入得到的AUC分别为0.6848、0.6271、0.5420、0.6271、0.6711、0.5846、0.7204、0.5723、0.6530，由此可见，这些被认为是腹主动脉瘤危险因素的临床指标对于腹主动脉瘤的诊断准确性明显低于肠道微生物标志物。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。