微生物分解细菌、微生物制剂、微生物的分解方法及分解装置

摘要

本发明提供具有包含与SEQ ID No：1记载的碱基序列具有98.2％以上同一性的碱基序列的16S rRNA基因，且具有靶标微生物分解能力的细菌，以及包含细菌(a1)的用于分解靶标微生物的微生物制剂，以及使用它们的靶标微生物的分解方法及靶标微生物的分解装置。细菌(a1)为具有包含与SEQ ID No：1记载的碱基序列具有90％以上同一性的碱基序列的16S rRNA基因，且具有靶标微生物分解能力的细菌。

说明书

技术领域

本发明涉及具有微生物分解能力的细菌。

背景技术

利用活性污泥法进行污水净化时，被除去的有机物成为包含微生物的絮状物，产生称为剩余污泥的污泥。由于从废水处理设备排出的剩余污泥在产业废弃物中占多达20％的比例，因此，认为对于将产业废弃物减少体积而言，将这些剩余污泥减少体积是有效果的。通常而言，剩余污泥在脱水，干燥之后被燃烧处理(非专利文献1：平成27年度事业、产业废弃物排出、处理情况调查报告书，平成25年度实绩(概略版)，非专利文献2：山本昌幸，“关于污水的燃烧技术”，日本燃料学会志，一般社团法人日本燃烧学会，2011，第53卷，164号，p91-96)。

然而，由于将剩余污泥进行燃烧处理则会产生温室效应气体，因此，未必是对环境造成的影响较小的处理方法。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：“2015年度事业、产业废弃物排出、处理情况调查报告书，平成25年度实绩(概略版)”[在线]，平成28年3月，环境省大臣官房废弃物、再循环相应措施部，[平成30年8月31日检索]，互联网

非专利文献2：山本昌幸，“关于污水的燃烧技术”，日本燃料学会志，一般社团法人日本燃烧学会，2011，第53卷，164号，p91-96

发明概述

发明要解决的问题

近年来，整个社会对于地球环境的意识提高了，寻求对环境造成的影响更少的使剩余污泥减少体积的方法，即，分解构成剩余污泥的微生物的方法。

本发明的目的在于提供能分解微生物的细菌，微生物制剂，微生物的分解方法及分解装置。

用于解决问题的手段

即，本发明涉及以下例示的[1]～[17]。

[1]具有包含与SEQ ID No：1记载的碱基序列具有98.2％以上同一性的碱基序列的16S rRNA基因，且具有靶标微生物分解能力的细菌(下文中，有时记作“本发明所述的细菌”)。

[2]根据[1]所述的细菌，其具有包含与SEQ ID No：1记载的碱基序列具有98.5％以上同一性的碱基序列的16S rRNA基因。

[3]根据[1]所述的细菌，其具有包含与SEQ ID No：1记载的碱基序列具有99.0％以上同一性的碱基序列的16S rRNA基因。

[4]根据[1]所述的细菌，其具有包含与SEQ ID No：1记载的碱基序列具有99.5％以上同一性的碱基序列的16S rRNA基因。

[5]根据[1]所述的细菌，其具有包含SEQ ID No：1记载的碱基序列的16S rRNA基因。

[6]根据[1]～[5]中任一项所述的细菌，其中，靶标微生物为靶标细菌。

[7]根据[1]～[6]中任一项所述的细菌，其中，靶标微生物为靶标死细菌。

[8]以保藏号NITE BP-02779保藏的细菌。

[9]用于分解靶标微生物的微生物制剂(下文中，有时记作“本发明所述的微生物制剂”)，其包含细菌(a1)，

(a1)：具有包含与SEQ ID No：1记载的碱基序列具有90％以上同一性的碱基序列的16S rRNA基因，且具有靶标微生物分解能力的细菌。

[10]根据[9]所述的用于分解靶标微生物的微生物制剂，其中，细菌(a1)具有包含与SEQ ID No：1记载的碱基序列具有92％以上同一性的碱基序列的16S rRNA基因。

[11]根据[9]所述的用于分解靶标微生物的微生物制剂，其中，细菌(a1)具有包含与SEQ ID No：1记载的碱基序列具有95％以上同一性的碱基序列的16S rRNA基因。

[12]根据[9]所述的用于分解靶标微生物的微生物制剂，其中，细菌(a1)具有包含SEQ ID No：1记载的碱基序列的16S rRNA基因。

[13]根据[9]所述的用于分解靶标微生物的微生物制剂，其中，细菌(a1)为以保藏号NITE BP-02779保藏的细菌。

[14]根据[9]～[13]中任一项所述的用于分解靶标微生物的微生物制剂，其进一步包含细菌(a2)，其中，相对于细菌(a1)和细菌(a2)的总数，细菌(a1)数为0.1％以上且100％以下，

细菌(a2)：与细菌(a1)不同的细菌。

[15]用于分解靶标微生物的微生物制剂，其包含细菌(a1)的培养物，

(a1)：具有包含与SEQ ID No：1记载的碱基序列具有90％以上同一性的碱基序列的16S rRNA基因，且具有靶标微生物分解能力的细菌。

[16]靶标微生物的分解方法(下文中，有时记作“本发明所述的分解方法”)，其包括使[1]～[8]中任一项所述的细菌，或[9]～[15]中任一项所述的用于分解靶标微生物的微生物制剂与靶标微生物进行作用的工序。

[17]靶标微生物的分解装置(下文中，有时记作“本发明所述的分解装置”)，其使用[1]～[8]中任一项所述的细菌，或[9]～[15]中任一项所述的用于分解靶标微生物的微生物制剂。

发明效果

根据本发明能够提供能分解微生物的细菌，微生物制剂，微生物的分解方法及分解装置。

附图简述

[图1]为示出在实验7中添加了膨胀芽孢杆菌属物种(Tumebacillus sp.)(NITEBP-02779)之后的剩余污泥的干燥重量的图。

具体实施方式

下文中，对本发明的具体实施方案(下文中，称为“本实施方案”)进行详细说明。需要说明的是，本发明并不受限于以下实施方式。

(通用术语的说明)

在本说明书中，“微生物”是指肉眼不能辨别结构的那些微小的生物，是除了大型多细胞生物以外的生物。“靶标微生物”是指利用本发明所述的细菌或微生物制剂进行分解的微生物。作为这样的微生物，可以举出细菌，真菌等，其中优选为细菌，更优选为构成剩余污泥的细菌。靶标微生物可以为活菌也可以为死菌。

“靶标细菌”是指成为靶标微生物的细菌，可以为活菌也可以为死菌，也可以包含活菌及死菌。活菌是指活着的细菌，例如在进行代谢的细菌。“靶标死细菌”是指，靶标细菌中死去的细菌，例如不进行代谢的细菌。活菌与死菌可以使用例如碘化丙啶(PI)等染料而辨别。从利用细菌的分解效率的观点出发，靶标细菌优选为死菌。剩余污泥中微生物的约50％为死细菌。靶标死细菌也可以通过例如对于靶标细菌进行加热，高压蒸汽灭菌，紫外线照射，福尔马林处理，酸处理等而获得。另外，靶标死细菌也可以是经粉碎而成的。

作为靶标微生物，可列举例如微球菌(Micrococcus)属细菌，芽孢杆菌(Bacillus)属细菌，葡萄球菌(Staphylococcus)属细菌，类芽孢杆菌(Paenibacillus)属细菌，乳杆菌(Lactobacillus)属细菌等革兰氏阳性菌，埃希氏菌(Escherichia)属细菌，醋杆菌(Acetobacter)属细菌等革兰氏阴性菌。

在本说明书中，“靶标微生物分解能力”是指将对靶标微生物进行代谢，构成靶标微生物的生物体分子的一部分或全部转换为不同的分子的能力。作为生物体分子，可列举例如糖，蛋白质，核酸，脂质等。

(本发明所述的细菌)

本发明所述的细菌具有包含与SEQ ID No：1记载的碱基序列具有98.2％以上同一性或同源性的碱基序列的16S rRNA基因，且具有靶标微生物分解能力。在本发明中，16SrRNA基因优选为细菌原本就具有的内源性的16S rRNA基因。也可以为人工地引起突变的16S rRNA。作为具有包含与SEQ ID No：1记载的碱基序列具有98.2％以上同一性的碱基序列的16SrRNA基因的细菌，可列举膨胀芽孢杆菌(Tumebacillus)属细菌。

作为本发明所述的细菌的一个实施方案，可列举具有包含SEQ ID No：1记载的碱基序列的16S rRNA基因，且具有靶标微生物分解能力的细菌。

作为具有包含SEQ ID No：1记载的碱基序列的16S rRNA基因细菌的代表性菌株，可列举作为膨胀芽孢杆菌属物种(Tumebacillus sp.)(保藏号NITE BP-02779，原保藏日：2018年9月11日)的，基于布达佩斯条约保藏于独立行政法人制品评价技术基础机构专利微生物保藏中心(NPMD，地址：邮政编码292-0818千叶县木更津市上总镰足2-5-8122号室)的菌株。关于该菌株的细菌学性质示于后述表1～4中。

本发明所述的细菌可以具有包含与SEQ ID No：1记载的碱基序列相比，同一性或同源性为98.5％以上的碱基序列的16S rRNA基因，可以具有包含同一性或同源性为98.8％以上的碱基序列的16S rRNA基因，可以具有包含同一性或同源性为99.0％以上的碱基序列的16S rRNA基因，可以具有包含同一性或同源性为99.3％以上的碱基序列的16S rRNA基因，可以具有包含同一性或同源性为99.5％以上的碱基序列的16S rRNA基因，可以具有包含同一性或同源性为99.8％以上的碱基序列的16S rRNA基因。本发明所述的细菌可以为以保藏号NITE BP-02779保藏的细菌。

另外，本发明所述的细菌可以具有包含与SEQ ID No：1记载的碱基序列相比，发生了1个碱基或数个碱基的取代，缺失或添加的碱基序列的16SrRNA基因。1个碱基或数个碱基是指可以为例如1～25个碱基、优选为1～10个碱基，更优选为1～5个碱基。所述突变为不失去16S rRNA的表达及功能的突变。

本发明所述的细菌可以具有16S rRNA基因，所述16S rRNA基因中包含与在SEQ IDNo：1记载的碱基序列中包含的约15个碱基以上、优选为约18～约500个碱基，更优选为约18～约200个碱基，进一步优选为约18～约50个碱基的连续的序列或其互补序列在严格的条件下进行杂交的碱基序列。严格的条件是指不形成非特异性杂交的条件，可列举例如在60℃，1×SSC，0.1％SDS、优选为68℃，0.1×SSC，0.1％SDS中洗涤1次以上的条件等。

本发明所述的细菌的靶标微生物分解能力根据反应条件(靶标微生物的种类及浓度，反应液的组成，温度，pH，细菌数等)而变化。

例如，将本发明所述的细菌的代表性菌株膨胀芽孢杆菌属物种(NITE BP-02779)和微球菌属细菌死菌分别制备为浊度(OD660)0.2，并以体积比1∶100混合之后，在20～35℃的温度条件下，在6.5～8.0的pH条件下进行反应，由此可以使1天之后的浊度降低50％左右，将微球菌属细菌分解。

本发明所述的细菌可以通过对象微生物的16S rRNA基因的碱基序列的分析，及靶标微生物的分解能力的测定而判定。具体而言，如果对象微生物具有与SEQ ID No：1记载的碱基序列相比，具有同源性98.2％以上的碱基序列的16S rRNA基因，且具有靶标微生物分解能力，则可判定该对象微生物为本发明所述的细菌。

16S rRNA基因的碱基序列的分析可以通过例如以下方法进行。首先，使用公知的方法从对象微生物提取基因组DNA并扩增16S rRNA基因。作为扩增16S rRNA基因的方法，没有特别的限制，可列举本领域技术人员所通常使用的使用了通用引物的PCR法等。可以将通过PCR法得到的扩增产物根据需要纯化，进行DNA测序等而确定碱基序列。进行得到的碱基序列与SEQ ID No：1记载的序列的比较。

作为检查是否具有靶标微生物分解能力的方法，可列举例如：使对象微生物和靶标微生物在适当的培养基或缓冲液中反应一定时间，之后，检查培养基或缓冲液中靶标微生物的分解的方法。对检查分解的方法没有特别限定，可列举例如测定靶标微生物的浊度的方法，利用SLP试剂检测靶标微生物的方法，利用PCR检测靶标微生物的DNA的方法，测定靶标微生物的干燥菌体重量的方法，使用高效液相色谱(HPLC)；质量分析法(MS)；薄层色谱(TLC)；核磁共振(NMR)；气相色谱(GC)等检测源自靶标微生物的分解物的方法等。

在利用浊度检查靶标微生物的分解的情况下，具有靶标微生物分解能力是指，反应后的浊度相比于反应前的浊度显著降低，例如反应后的浊度为反应前的浊度的80％以下、优选为50％以下，更优选为30％以下。在利用干燥菌体重量检查靶标微生物的分解的情况下，具有靶标微生物分解能力是指，例如反应后的干燥菌体重量相比于反应前显著降低，例如反应之后的干燥菌体重量为反应前的95％以下、优选为90％以下。

基于这些碱基序列分析及靶标微生物分解能力的测定的结果，能够判断对象微生物是否为本发明所述的细菌。

(本发明所述的微生物制剂)

本发明所述的微生物制剂包含以下的细菌(a1)。

<细菌(a1)>

细菌(a1)为具有包含与SEQ ID No：1记载的碱基序列相比，具有90％以上同一性的碱基序列的16S rRNA基因，且具有靶标微生物分解能力的细菌。作为这样的细菌，可列举膨胀芽孢杆菌属细菌。

细菌(a1)可以具有包含与SEQ ID No：1记载的碱基序列相比，同一性或同源性为92％以上的碱基序列的16S rRNA基因，可以具有包含同一性或同源性为95％以上的碱基序列的16S rRNA基因，可以具有包含同一性或同源性为98％以上的碱基序列的16S rRNA基因，可以具有包含同一性或同源性为99％以上的碱基序列的16S rRNA基因，可以具有包含同一性或同源性为99.5％以上的碱基序列的16S rRNA基因，可以具有包含同一性或同源性为99.9％以上的碱基序列的16S rRNA基因。细菌(a1)可以为以保藏号NITE BP-02779保藏的细菌。

另外，细菌(a1)可以具有包含与SEQ ID No：1记载的碱基序列相比，发生了1个碱基或数个碱基的取代，缺失或添加的碱基序列的16S rRNA基因。1个碱基或数个碱基是指可以为例如1～135个碱基、优选为1～100个碱基，更优选为1～50个碱基，进一步优选为1～25个碱基，特别优选为1～5个碱基。所述突变为不失去16S RNA的表达及功能的突变。

细菌(a1)可以具有16S rRNA基因，在所述16S rRNA基因中包含与在SEQ ID No：1记载的碱基序列中包含的约15个碱基以上、优选为约18～约500个碱基，更优选为约18～约200个碱基，进一步优选为约18～约50个碱基的连续的序列或其互补序列在严格条件下进行杂交的碱基序列。

细菌(a1)的16S rRNA基因的碱基序列的分析，及靶标微生物分解能力的测定可以与所述本发明所述的细菌同样进行。

由于靶标微生物分解能力良好，因此，作为细菌(a1)优选本发明所述的细菌，或选自以下A组的任一种细菌，更优选为本发明所述的细菌。细菌(a1)可以为单一细菌，也可以为多种细菌。

A组：藻渣膨胀芽孢杆菌(Tumebacillus algifaecis)，鸟型膨胀芽孢杆菌(Tumebacillus avium)，鞭毛膨胀芽孢杆菌(Tumebacillus flagellates)，人参土膨胀芽孢杆菌(Tumebacillus ginsengisoli)，解脂膨胀芽孢杆菌(Tumebacillus lipolyticus)，藤黄膨胀芽孢杆菌(Tumebacillus luteolus)，永久冰冻膨胀芽孢杆菌(Tumebacilluspermanentifrigoris)，土壤膨胀芽孢杆菌(Tumebacillus soli)。

微生物制剂可以包含细菌(a1)的培养物。细菌(a1)的培养物指例如包含细菌(a1)的分泌物，代谢物等的液体培养基。具体而言，培养物中包括在受控制的条件下，在给定的液体培养基中，或包含碳源及氮源的液体培养基中增殖的细菌(a1)的培养物。在包含靶标细菌(a1)的培养物的用于分解靶标微生物的制剂中，可以包含细菌(a1)的活菌。细菌(a1)的培养物可以为培养细菌(a1)的培养上清液。培养上清液可以通过例如从培养细菌(a1)的液体培养基中通过离心分离，过滤操作等将细菌(a1)除去而得到。另外，培养物可以包含细菌(a1)的碎片。细菌(a1)的碎片也可以通过例如将细菌(a1)超声波破碎，珠磨碎，化学溶解处理而获得。

微生物制剂中除了细菌(a1)以外，可以根据需要包含细菌(a2)，添加剂(b)及载体(c)。作为微生物制剂的具体例，可列举包含细菌(a1)，细菌(a2)，添加剂(b)及载体(c)的微生物制剂。

<细菌(a2)>

细菌(a2)为与细菌(a1)不同的细菌。对细菌(a2)而言，只要是不使细菌(a1)的靶标微生物分解能力失去的那些细菌即可，没有特别的限制，可以为单一细菌，也可以为多种细菌。

细菌(a2)可以通过对象微生物的16S rRNA基因的碱基序列的分析，及靶标微生物的分解能力的测定而判定。具体而言，如果对象微生物具有包含与SEQ ID No：1记载的碱基序列相比，同一性低于90％的碱基序列的16S rRNA，或不具有微生物分解能力，则可判定该对象微生物为细菌(a2)。

对象微生物的16S rRNA基因的碱基序列的分析，及靶标微生物的分解能力的测定可以与所述本发明所述的细菌同样进行。

相对于细菌(a1)和细菌(a2)的总数，细菌(a1)数可以为0.1％以上且100％以下，可以为1％以上且100％以下，可以为10％以上且100％以下，可以为50％以上且100％以下，可以为75％以上且100％以下，可以为90％以上且100％以下，可以为95％以上且100％以下，可以为低于100％。通过为这样的比例，可以有效地分解靶标微生物。

对相对于细菌(a1)和细菌(a2)的总数的细菌(a1)数而言，是指细菌(a1)相对于微生物制剂中包含的全部细菌的比例。作为相对于细菌(a1)和细菌(a2)的总数的细菌(a1)数的计算方法，可列举通过克隆文库法，下一代测序分析，定量PCR进行计算的方法等。

作为通过克隆文库法及下一代测序分析计算细菌的存在比例的方法，具体而言从微生物制剂中包含的细菌(a1)及细菌(a2)提取基因组DNA而获得多个16S rRNA基因的碱基序列(下文中，将获得的多个碱基序列数记作前导(1ead)数)，分别确定获得的碱基序列是否为来自细菌(a1)或细菌(a2)中的任一种的碱基序列。接着，可以算出源自细菌(a1)的碱基序列数相对于前导数的比例，从而作为相对于细菌(a1)和细菌(a2)的总数的细菌(a1)数。

作为下一代测序分析中使用的下一代测序仪，只要是能够以DNA片段为模板，检测每1个碱基在再合成时的荧光强度，确定碱基序列即可，没有特别的限制。作为下一代测序仪，可列举例如：MiSeq，HiSeq 2500(Illumina公司制)，5500xl SOLiDTM，Ion ProtonTM，Ion PGMTM(Thermo Fisher Scientific公司制)，GS FLX+(Roche Diagnostics株式会社制)等。

作为通过定量PCR计算细菌的存在比例的方法，具体而言，分别算出对象微生物制剂中包含的细菌(a1)的16S rRNA基因拷贝数，以及细菌(a1)和细菌(a2)的16S rRNA基因拷贝数。接着，可以算出相对于细菌(a1)及细菌(a2)的16S rRNA基因拷贝数而言的细菌(a1)的16SrRNA基因拷贝数，作为相对于细菌(a1)和细菌(a2)的总数的细菌(a1)数。通过这样的方法能够判定对象微生物制剂为本发明所述的微生物制剂。

作为用于定量PCR使用的实时PCR装置，具备能够通过PCR扩增DNA的热循环仪和用于检测扩增产物的分光荧光光度计即可，没有特别的限制。作为实时PCR装置，可列举例如：StepOnePlus(Applied Biosystems公司制)，Thermal Cycler Dice Real Time System(TAKARABio株式会社制)，LightCycler 96System(Roche Diagnostics株式会社制)等。

作为定量PCR中使用的反应混合物(Master mix)，可列举Fast SYBRGreen MasterMix，Power SYBR Green Master Mix，SYBR Select Master Mix，PowerUp SYBR GreenMaster Mix(Thermo Fisher Scientific公司制)等。

<添加剂(b)>

作为添加剂(b)，可列举例如表面活性剂，分散剂，辅助剂，保护剂等。添加剂(b)的种类及浓度可以在不杀灭细菌(a1)，或不失去该细菌具有的靶标微生物分解能力的条件下适当确定。

<载体(c)>

作为载体(c)，可列举例如无机微粒载体。作为无机微粒载体，可以为金属及其无机盐类或氧化物，也可以为即使含有碳但化学上被分类为无机物的那些。另外，也可以为有机态碳的含量低于1％左右的纯物质或混合物。

无机微粒载体的中心粒径优选为1μm～100μm，更优选为4μm～75μm，进一步优选为13μm～25μm。在中心粒径为这样的范围的情况下，具有细菌(a1)容易负载在无机微粒载体的倾向。这里，中心粒径是指在基于激光衍射、光散射法的体积基准的粒度分布中的中位粒径(D50)。

无机微粒载体的比重没有特别限制，优选为1.2～3.5。

为了提高培养初期的成品率，也可以根据需要，使用各种凝聚剂而使无机微粒载体凝聚。作为凝聚剂，可列举例如非离子性、阳离子性、阴离子性的高分子凝聚剂等。

作为微生物制剂的制造方法，可列举例如将细菌(a1)和无机微粒载体混合，将细菌(a1)负载于无机微粒载体上，并进行培养而将得到的微生物制剂回收的方法。

作为培养方法，可以使用分批，半分批，补料分批，连续中的任一种方式。作为培养方法，例如从将增殖慢而菌体产率低的微生物进行有效地制备的观点出发，可以使用如日本特开平9-187272号公报中记载的那样，使得向培养微生物的容器(下文中，称为反应槽)中供给的对象化合物的浓度随培养时间的经过而对数增加的连续培养方式。

在本发明中，对于将微生物制备成制剂的办法，只要不失去细菌(a1)的靶标微生物分解能力即可，没有特别限定，可以利用公知的制备成制剂的办法。作为微生物制剂的形态，可以为液体或固体(包括胶囊包封体，琼脂状，粉末状等)，也可以为它们的冷冻体，冷冻干燥体等。当微生物制剂为液体时，也可以为悬浊在培养基，缓冲液，生理盐水等中的细菌悬浊液形式。当微生物制剂为固体或冷冻干燥体时，也可以例如在将经培养的细菌浓缩之后，进行适当的干燥或冷冻干燥而成为固体或冷冻干燥体形式。此时也可以添加赋型剂等。

(本发明所述的分解方法)

本发明所述的分解方法中，包括使本发明所述的细菌或本发明所述的微生物制剂与靶标微生物进行作用的工序。

使本发明所述的细菌或本发明所述的微生物制剂与靶标微生物进行作用是指：使例如本发明所述的细菌或者本发明所述的微生物制剂或它们悬浊而成的溶液与靶标微生物进行接触。通过使本发明所述的细菌或本发明所述的微生物制剂与靶标微生物进行作用，靶标微生物被分解。

对使本发明所述的细菌或本发明所述的微生物制剂与靶标微生物进行作用的工序而言，只要为不杀灭本发明所述的细菌或细菌(a1)，或不失去该细菌具有的靶标微生物分解能力的条件即可，没有特别的限制。该工序例如可以在温度为20～35℃的条件下，也可以在25～30℃的条件下。另外，可以在pH为6.5～8.0的条件下，也可以在7.0～7.5的条件下。

作为本发明所述的分解方法中使用的细菌，可列举例如膨胀芽孢杆菌属物种(保藏号NITE BP-02779)。

对在与靶标微生物进行作用时的本发明所述的细菌或本发明所述的微生物制剂的量而言，可以考虑靶标微生物的浓度，反应体系的容积等而适当设定。

在本发明所述的分解方法中，对确认靶标微生物发生分解的方法没有特别的限制，可以通过本领域技术人员通常可使用的方法进行。作为这样的确认方法，可列举例如所述靶标微生物分解能力的测定方法。

如上所述，本发明所述的细菌及本发明所述的微生物制剂具有靶标微生物分解能力，因此，在包含靶标微生物的剩余污泥的处理中有用。另外，由于通过使靶标微生物与本发明所述的细菌或微生物制剂进行作用而使靶标微生物被分解，因此，本发明所述的分解方法在包含靶标微生物的剩余污泥处理中有用。

(本发明所述的分解装置)

作为装置没有特别限定，是能使用本发明所述的细菌或本发明所述的微生物制剂将剩余污泥缩减的装置即可，可以将例如产生剩余污泥的污泥处理装置，排水处理装置等作为分解装置使用。另外，也可以在例如存在有剩余污泥的现有的污泥处理装置，排水处理装置等中添加本发明所述的细菌或本发明所述的微生物制剂而作为靶标微生物的分解装置。

实施例

[实验1.具有靶标微生物分解能力的微生物的探索]

(方法)

通过使用将微球菌(Micrococcus)属细菌作为碳源的培养基而培养了环境(水)中存在的微生物群，由此富集培养了分解微球菌(Micrococcus)属细菌的微生物。然后，从经富集培养的微生物群中分离出增殖良好的数种菌株。

(结果)

对分离出的每个菌株检查了微球菌属细菌分解能力，结果在1个菌株中确认了微球菌属细菌分解能力。下文中，有时将确认到微球菌属细菌分解能力的菌株记作“菌株A”。

[实验2.具有微球菌属细菌分解能力的菌株的16S rRNA基因的碱基序列分析]

(材料)

·R2A培养基：相对于1000mL的超纯水，以3.2g的比例溶解了R2A肉汤培养基，DAIGO(日本制药株式会社制)，并进行了高压蒸汽灭菌的培养基

·克隆用正向引物(27f：SEQ ID No：2)

·克隆用反向引物(1492r：SEQ ID No：3)

·测序分析用引物(339F：SEQ ID No：4，536R：SEQ ID No：5，907F：SEQ ID No：6)

(方法)

使用DNA简易提取试剂盒(Easy Extract for DNA)(AMR株式会社制)从菌株A提取DNA，作为用于通过PCR扩增16S rRNA基因的模板DNA。

PCR通过以下条件进行。25.0μL的用于KOD FX的2×PCR缓冲液，(东洋纺株式会社制)，10.0μL的dNTP mix(2mM)，1.5μL的克隆用正向引物及克隆用反向引物(分别为10pmol/μL)，0.58μL的模板DNA，10.4μL的灭菌水，1.0μL的DNA聚合酶(KOD FX，1U/μL，东洋纺株式会社制)，加到微型管中并混合。将微型管装载于PCR装置，进行模板DNA的扩增反应。反应以(1)94℃，2分钟，(2)98℃，10秒，(3)50℃，30秒，(4)68℃，1.5分钟进行，并将(2)～(4)的工序反复进行35个循环。将PCR之后的扩增产物进行纯化。

将相当于150ng量的经纯化的PCR之后的扩增产物与测序分析用引物(10μM)0.32μL，以及BigDye Terminator v 3.1(Applied Biosystems公司制)8.0μL进行混合，向其中加入灭菌超纯水使液量为20.0μL，制备了反应液。将该反应液用于PCR装置，进行扩增反应。反应以(1)96℃，1分钟，(2)96℃，10秒，(3)50℃，5秒，(4)60℃，4分钟进行，并将(2)～(4)的工序反复进行25个循环。将得到的反应液纯化，对纯化液进行DNA测序分析(3730xl DNA分析仪)，确定了从菌株A提取的模板DNA的16S rRNA基因的碱基序列。

(结果)

将得到的碱基序列对照于国际碱基序列数据库(DDBJ/ENA(EMBL)/GenBank)进行同源性分析。在基准株中，对比永久冰冻膨胀芽孢杆菌(Tumebacilluspermanentifrigoris)Eurl_9.5的16S rRNA基因的碱基序列，显示同一性为98.1％。但是，并没有存在具有与得到的碱基序列完全一致的16S rRNA基因的微生物。

将得到的16S rRNA基因的碱基序列示于SEQ ID No：1。由此，启示具备具有SEQ IDNo：1记载的碱基序列的16S rRNA基因的细菌具有微生物分解能力。

[实验3.具备具有SEQ ID No：1记载的碱基序列的16S rRNA基因的膨胀芽孢杆菌属细菌的形态观察及生理、生化的性状测试]

(方法)

对菌株A进行了形态观察及生理、生化的性状测试。这些测试通过利用光学显微镜的形态观察，BARROW等的方法(Cowan and Steel’s Manual for the Identification ofMedical Bacteria 3rd Edition 1993，Cambridge University Press.)及API50CHB(bioMerieux公司制，Lyon，France)进行。将测试结果示于表1～表4。

(结果)

菌株A在10℃时不生长，但在16S rRNA基因的同源性上最高的永久冰冻膨胀芽孢杆菌Eurl_9.5中没有观察到这样的特征。因此，启示菌株A与以往的膨胀芽孢杆菌不同，为新的种。将菌株A作为膨胀芽孢杆菌属物种NITE BP-02779保藏。

[表1]

+：阳性，-：阴性，+w：反应较弱

[表2]

+：阳性、-：阴性

[表3]

+：阳性、-：阴性

[表4]

+：阳性、-：阴性

[实验4.膨胀杆菌属物种NITE BP-02779对于靶标细菌(死菌)的分解能力评价]

(材料)

·R2A培养基：相对于1000mL的超纯水，以3.2g的比例溶解R2A肉汤培养基，DAIGO(日本制药株式会社制)，并进行了高压蒸汽灭菌的培养基

·LB液体培养基：相对于500mL的超纯水，10个的比例溶解LB肉汤培养基，1.1GPER TABLET(SIGMA公司制)，并进行了高压蒸汽灭菌的培养基

·802培养基：将10g聚蛋白胨，2g酵母浸膏，1g硫酸镁七水合物溶解于超纯水中，调整pH为7.0后，制备成1000mL，并进行了高压蒸汽灭菌的培养基

·细菌用培养基：将20g葡萄糖，5g聚蛋白胨，3g酵母浸膏，3g肉浸膏，2g硫酸铵，1g磷酸二氢钾，0.5g硫酸镁七水合物溶解于超纯水中，调整pH为7.0后，制备成1000mL，并进行了高压蒸汽灭菌的培养基

·含有靶标细菌(死菌)的无机培养基：将986mL基质溶液，3.0mL A液，3.0mL B液，3.0mL C液，3.0mL D液，及1.8mL 1％磷酸进行混合的培养基

需要说明的是，作为所述基质溶液及A液～D液使用了以下这些。

基质溶液：将表5所述的靶标细菌利用该表所述的条件进行培养，收集菌及洗涤之后相对于超纯水986mL混合而使得浊度(OD660)为0.2，并进行了高压蒸汽灭菌的溶液

A液：将4.35g磷酸氢二钾，1.70g磷酸二氢钾，8.92g磷酸氢二钠12水合物，0.34g氯化铵溶解于超纯水之后，制备成200mL并进行了高压蒸汽灭菌的溶液

B液：将4.50g硫酸镁7水合物溶解于超纯水之后，制备成200mL并进行了高压蒸汽灭菌的溶液

C液：将5.50g无水氯化钙溶解于超纯水之后，制备成200mL并进行了高压蒸汽灭菌的溶液

D液：将0.05g氯化铁6水合物溶解于超纯水之后，制备成200mL并利用0.2μm的注射器过滤器进行了过滤灭菌的溶液

[表5]

(方法)

将膨胀杆菌属物种NITE BP-02779接种于R2A培养基，在25℃培养24小时～48小时。

培养结束后，将膨胀杆菌属物种NITE BP-02779培养液50μL和含有靶标细菌(死菌)的无机培养基5.0mL添加到试管中，于25℃，200rpm进行反应，利用简易浊度计(简易ODmonitor miniphoto518R，TAITEC公司制)经时地测定了试管的浊度(OD660)。算出含有靶标细菌(死菌)的无机培养基的浊度(OD660)显示阴性对照的浊度(OD660)的50％时的经过天数，通过以下基准判定分解能力的有无。

A：0天以上且低于2.0天

B：2.0天以上且低于5.0天

C：5.0天以上

需要说明的是，阴性对照使用了不添加膨胀杆菌属物种NITE BP-02779的含有靶标细菌(死菌)的无机培养基的浊度(OD660)。

(结果)

将结果示于表6。确认了通过添加膨胀杆菌属物种NITE BP-02779，含有靶标细菌(死菌)的无机培养基的浊度发生降低。因此，膨胀杆菌属物种NITE BP-02779能够分解靶标微生物(靶标死细菌)。

[表6]

[实验5.膨胀杆菌属物种NITE BP-02779对于靶标细菌(活菌)的分解能力评价]

(材料)

·含有靶标细菌(活菌)的无机培养基：986mL灭菌水，3.0mL A液，3.0mL B液，3.0mL C液，3.0mL D液，1.8mL 1％磷酸，及靶标细菌(活菌)进行混合的溶液

需要说明的是，作为A液～D液使用了与实验4相同的那些。另外，混合了靶标细菌(活菌)，使得含有靶标细菌(活菌)的无机培养基的浊度(OD660)为0.2。

(方法)

使用了含有靶标细菌(活菌)的无机培养基，除此以外，以与实验4同样的方法对膨胀杆菌属物种NITE BP-02779对于靶标细菌(活菌)的分解能力进行了评价。

(结果)

将结果示于表7。确认了通过添加膨胀杆菌属物种NITE BP-02779，含有靶标细菌(活菌)的无机培养基的浊度发生降低。因此，膨胀杆菌属物种NITE BP-02779能够分解靶标细菌(活菌)。

[表7]

[实验6.膨胀杆菌属物种NITE BP-02779对于剩余污泥(死菌)的分解能力评价(1)]

·含有剩余污泥(死菌)的无机培养基：将986mL基质溶液，3.0mL A液，3.0mL B液，3.0mL C液，3.0mL D液，及1.8mL 1％磷酸进行混合的培养基

基质溶液：将剩余污泥洗涤后，相对于超纯水986mL混合使得浊度(OD660)为0.2，并进行了高压蒸汽灭菌的溶液

作为基质溶液使用了所述基质溶液，除此以外，使用了与实验4相同的那些。

(方法)

使用了含有剩余污泥(死菌)的无机培养基，除此以外，以与实验4同样的方法对膨胀杆菌属物种NITE BP-02779对于剩余污泥(死菌)的分解能力进行了评价。

(结果)

将结果示于表8。确认了通过添加膨胀杆菌属物种NITE BP-02779，剩余污泥(死菌)的浊度发生降低。因此，膨胀杆菌属物种NITE BP-02779能够分解剩余污泥(死菌)。

[表8]

[实验7.膨胀杆菌属物种NITE BP-02779对于剩余污泥(死菌)的分解能力评价(2)]

(材料)

使用了与实验6相同的那些。

(方法)

以与实验4相同的方法进行了反应。反应以5个重复连续进行，在反应开始之后第4天，总量回收试管中残留的剩余污泥。将回收的剩余污泥干燥之后，测定剩余污泥的干燥重量，利用阴性对照组和膨胀杆菌属物种NITE BP-02779添加组进行了显著性检验(t检验，单侧)。

(结果)

将结果示于图1。确认了与阴性对照组相比，膨胀杆菌属物种NITE BP-02779添加组中剩余污泥的干燥重量发生显著的降低(p＜0.01)。因此，通过添加膨胀杆菌属物种NITEBP-02779能够缩减剩余污泥。

[实验8.用于分解靶标微生物的微生物制剂对于微球属细菌的分解能力评价]

(材料)

作为含有靶标细菌的无机培养基，准备了包含实验4中使用的微球属细菌作为靶标细菌的含有靶标细菌(死菌)的无机培养基。作为评价微生物分解能力的有无的细菌，准备了表9所示的细菌。

[表9]

(方法)

利用与实验4同样的方法，将含有靶标细菌的无机培养基和包含为评价对象的细菌培养液进行混合，对为评价对象的细菌的微生物分解能力进行了评价。算出含有靶标细菌的无机培养基的浊度(OD660)显示阴性对照的浊度(OD660)的50％时的经过天数，通过以下基准判定微生物分解能力的有无。

A：0天以上且低于1.0天

B：1.0天以上且低于4.0天

C：4.0天以上

需要说明的是，对阴性对照而言，使用了没有添加包含为评价对象的细菌的培养液且含有靶标细菌的无机培养基的浊度(OD660)。

(结果)

将结果示于表10。另外，进行表9中记载的评价对象的细菌的16S rRNA基因的碱基序列与膨胀杆菌属物种NITE BP-02779的16S rRNA基因的碱基序列(SEQ ID No：1)之间的同源性检索，将算出的同一性比例示于表10。将表10中记载的细菌的16S rRNA基因的碱基序列作为SEQ ID No：7～16示出。它们是收录在独立行政法人制品评价技术基础机构生物技术中心(NBRC)在线产品目录或国立生物工程信息中心(NCBI)数据库产品目录中的序列。

膨胀杆菌属物种NITE BP-02779及藻渣膨胀芽孢杆菌NBRC108765t为判定A，而芽孢杆菌属细菌及类芽孢杆菌属细菌为判定B或为判定C。因此，膨胀杆菌属物种NITE BP-02779及藻渣膨胀芽孢杆菌NBRC108765t与芽孢杆菌属细菌及类芽孢杆菌属细菌相比，靶标微生物(靶标死细菌)分解能力更优异。

膨胀杆菌属物种NITE BP-02779的16S rRNA基因的碱基序列与藻渣膨胀芽孢杆菌NBRC108765t的16S rRNA基因的碱基序列之间的同一性为92.8％。另一方面，膨胀杆菌属物种NITE BP-02779的16S rRNA基因的碱基序列与芽孢杆菌属细菌或类芽孢杆菌属细菌的16S rRNA基因的碱基序列之间的同一性低于90％。由此认为，与膨胀杆菌属物种NITE BP-02779相比，16S rRNA基因的碱基序列的同一性为90％以上的细菌，其靶标微生物分解能力优异。藻渣膨胀芽孢杆菌NBRC108765t能够从NBRC获取，其16S rRNA基因的碱基序列在GenBank/EMBL/DDBJ数据库中以登录号JX110710收录。

[表10]

[实验9.包含膨胀杆菌属物种NITE BP-02779和大肠杆菌(Escherichia coli)的用于分解靶标微生物的微生物制剂的靶标微生物分解能力评价]

(材料)

作为含有靶标细菌的无机培养基，准备了包含实验4中使用的微球属细菌作为靶标细菌的含有靶标细菌(死菌)的无机培养基。另外，作为用于分解靶标微生物的微生物制剂，准备了包含膨胀杆菌属物种NITE BP-02779(细菌(a1))和大肠杆菌DH5α(细菌(a2))的微生物制剂。

(方法)

首先，将膨胀杆菌属物种NITE BP-02779在25℃培养24小时，大肠杆菌DH5α在37℃培养24小时。

培养之后，将膨胀杆菌属物种NITE BP-02779培养液(制备成OD660＝0.2)和大肠杆菌DH5α培养液(制备成OD660＝0.2)以表11所示的比率进行混合，准备了用于分解靶标微生物的微生物制剂。将制备的微生物制剂50μL与含有靶标细菌的无机培养基5.0mL添加到试管中，于25℃，200rpm进行反应，2天后利用简易浊度计(简易OD monitor，miniphoto518R，TAITEC公司制)测定了混合液的浊度(OD660)。将添加了微生物制剂的含有靶标细菌的无机培养基的浊度(OD660)相对于阴性对照的浊度(OD660)的比例作为靶标微生物的残留率算出，通过以下基准对靶标微生物分解能力进行了评价。

A：0％以上且低于50％

B：50％以上且低于70％

C：70％以上

需要说明的是，阴性对照使用了不添加用于分解靶标微生物的微生物制剂且含有靶标细菌的无机培养基的浊度(OD660)。

(结果)

将结果示于表11。包含膨胀杆菌属物种NITE BP-02779和大肠杆菌的用于分解靶标微生物的微生物制剂显示了良好的靶标微生物分解能力。

[表11]

T：膨胀芽孢杆菌属物种NITE BP-02779的菌数

E：大肠杆菌DH5a的菌数

靶标微生物的存留率(％)＝OD660(添加微生物制剂)/OD660(阴性对照)×100

[实验10.膨胀杆菌属物种NITE BP-02779培养物的靶标微生物分解能力评价]

(材料)

作为含有靶标细菌(活菌)的磷酸缓冲液，使用了将66mM磷酸钾缓冲液(pH6.24)10mL，及微球属细菌干燥菌体(SIGMA-ALDRICH公司制)10mg进行混合的溶液。作为用于分解靶标微生物的微生物制剂，使用了包含膨胀杆菌属物种NITE BP-02779(细菌(a1))的培养物的微生物制剂。

(方法)

首先，将膨胀杆菌属物种NITE BP-02779利用R2A培养基培养一定时间。

培养之后，将培养液离心分离，并回收除去了菌体的培养上清液。将回收的培养上清液100μL和含有靶标细菌的磷酸缓冲液100μL添加到96孔板中，使用酶标仪(MolecularDevice公司制)经时地测定了ABS 450nm。算出微球属细菌分解能力(单位/mL)，通过以下基准对靶标微生物分解能力进行了评价。

S：200(单位/mL)以上

A：100(单位/mL)以上且低于200(单位/mL)

B：20(单位/mL)以上且低于100(单位/mL)

C：低于20(单位/mL)

需要说明的是，微球属细菌分解能力(单位/mL)使用下式而算出。

微球属细菌分解能力(单位/mL)

＝{ΔABS 450nm/分钟(添加了培养上清液的含有靶标细菌的磷酸缓冲液)-ΔABS450nm/分钟(不添加培养上清液的含有靶标细菌的磷酸缓冲液)}/(0.001×0.1)

(结果)

将结果示于表12。表明将膨胀杆菌属物种NITE BP-02779培养一定时间的培养上清液具有靶标微生物分解能力。

[表12]