一种单侧原发性醛固酮增多症患者病理分型诊断试剂盒

摘要

本发明涉及一种单侧原发性醛固酮增多症患者病理分型诊断试剂盒，本发明实现了单侧原发性醛固酮增多症患者病理分型诊断。

说明书

技术领域

本发明属于分型诊断试剂盒领域，特别涉及一种单侧原发性醛固酮增多症患者病理分型诊断试剂盒。

背景技术

原发性醛固酮增多症(Primary Aldosteronism,PA)是由于肾上腺皮质病变(腺瘤或增生)引起，醛固酮的分泌不依赖肾素-血管紧张素系统，且不被盐负荷抑制，是一种醛固酮自主分泌过多引起的综合征。原醛症是最常见的引起继发性高血压的病因。流行病学调查显示，1级高血压中原醛症患病率为1.99％，2级高血压中原醛症患病率为8.02％，3级高血压中原醛症患病率为13.2％；难治性高血压患者中，原醛症患病率高达17％～23％。醛固酮过多是心脑功能受损和肾功能受损的重要危险因素，与原发性高血压患者相比，原醛症患者的心脑血管事件和其他并发症的发病率更高。故尽可能多的找到与临床生化指标相关联的因素至关重要，从而可以帮助预后判断及指导进一步诊疗。

单侧原醛症(unilateral hyperaldosteronism,UHA)主要包括醛固酮瘤和单侧肾上腺皮质增生，双侧原醛症(bilateral hyperaldosteronism,BHA)主要是特发性醛固酮增多症，UHA和BHA是原醛症的最常见两种亚型，所占比例超过90％。原醛症的分型诊断在临床上很重要，在很大程度上影响了治疗方案的选择，UHA的一线治疗是单侧肾上腺切除术，而BHA的一线治疗是药物治疗。双侧肾上腺静脉采血(adrenal venous sampling,AVS)是目前公认的原醛症分型诊断的“金标准”。

对于PA的定位分型诊断，首选检查是肾上腺CT扫描。CT结果往往是非特异性的，可能显示增生的肾上腺，也可能显示阴性结果。肾上腺腺瘤通常在CT上表现为均质圆形的肿块，边界光滑且界限分明。而肾上腺皮质癌的影像学特征包括较大的直径(大于4厘米)，边缘不规则，不均质的内容物以及坏死，出血灶和钙化点。由于肾上腺皮质腺瘤细胞胞浆内通常富含脂质，导致CT扫描时衰减较小，因此，测量Hounsfield值有助于区分腺瘤和非腺瘤。在CT平扫时，Hounsfield值小于10的肿瘤通常可诊断为肾上腺皮质腺瘤。但是需要指出的是，当微腺瘤肿瘤直径小于CT可检出的最小阈值时，CT无法发现这一类微腺瘤，同时，CT有时也无法检出增生或确定肾上腺皮质腺瘤的功能状态，也就是说，CT无法确定肾上腺皮质腺瘤究竟是无功能腺瘤还是过度分泌类固醇激素的腺瘤。肾上腺静脉取血术(AVS)是区分单侧和双侧PA的最佳方法。在能开展AVS技术且使用严格的诊断切点值的医疗中心中，大约有三分之二的PA病例被诊断为单侧PA，而三分之一的PA患者则被诊断为双侧PA。但是，对于没有条件开展AVS技术的医院来说时，诊断情况却恰恰相反。因此，能否开展AVS极大地影响了单侧PA的识别，而这部分患者却理论上可以通过肾上腺切除术来治愈或者缓解高血压症状。单侧肾上腺切除术后，需要在病理学上进一步证实，才能对单侧PA亚型(例如APA或者UAH)做出明确的诊断。一个APA的诊断需要满足以下四个标准：(1)筛查试验中有PA的证据，ARR大于300，同时经过确诊试验的证实；(2)AVS证明醛固酮的来源是来自单侧过度分泌；(3)在病理学上发现腺瘤；而且至关重要的是，(4)单侧肾上腺切除术后可以纠正PA的临床和生化症状。但是，在病理学上，APA的诊断却非常具有挑战性与难度，因为至今为止依然没有明确的病理学诊断标准去定义在显微镜下什么样的细胞才是生成醛固酮的细胞。病理学家常规对肾上腺组织切片进行HE染色，并在显微镜下观察以发现至少1个的肾上腺皮质结节，然后根据经验来判断它是否可能是APA。之后，再鉴定结节中主要的细胞类型：球状带样的细胞(ZG-like cells,致密的小细胞)或束状带样细胞(ZF-like cells,富含泡沫的大脂质细胞)。然而，病理学家也经常发现两种细胞类型混合间杂分布在结节之中，同时甚至伴有核增大，出现核仁或者染色质增多等异形细胞的特征。腺瘤和结节之间的病理组织学区别尚不十分清楚。有研究认为，肾上腺皮质良性或恶性肿瘤通常是单克隆的，但在常规病理学诊断过程中通常不进行克隆性确定，因此用来明确定义腺瘤的严格的组织学诊断标准尚无定论。在病理诊断的过程中，通常将肾上腺皮质中存在多个结节解读多个腺瘤或者是存在肾上腺皮质结节性增生，同时，大多数APA也伴随ZG的增生。但是由于一些研究机构对此也呈不同意见，有些研究机构认为，APA伴随ZG的增生是少见的情况，因此APA的诊断在组织学上来说是比较开放同时难以统一的。然而，由于HE染色未提供有关功能表型的信息，也就是说，HE染色的结果只能告诉临床医生和病理医生是否存在结节和ZG增生，而并不能告诉哪些细胞是分泌类固醇激素的源头，因此仍不能确定与醛固酮的过量产生有关的组织结构。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种单侧原发性醛固酮增多症患者病理分型诊断试剂盒，克服了上述缺陷，本发明通过免疫化组织试剂盒实现了单侧原发性醛固酮增多症患者病理分型诊断。

本发明的一种单侧原发性醛固酮增多症患者病理的分型诊断试剂盒，所述试剂盒含CYP11B2抗体。

所述试剂盒为含CYP11B2单克隆抗体的免疫组织化学试剂盒。

所述试剂盒含有DAB显色溶液、内源性过氧化物酶阻滞剂、链霉菌抗生物素过氧化物酶。所述免疫组织化学试剂盒的使用流程如下：

1、准备切片，在烘箱中烤片4-6小时。

2、脱蜡，水化：依次放入二甲苯I(15分钟)、二甲苯II(15分钟)、无水乙醇(5分钟)、95％乙醇(5分钟)、80％乙醇(5分钟)、75％乙醇(5分钟)及清水(5分钟)之中。

3、抗原修复：配制枸橼酸盐缓冲液抗原修复液，将水化后的切片放入抗原修复液中，微波炉高温煮5分钟，再中火煮10分钟，之后缓慢静置冷却至室温。

4、用组化笔圈选染色组织。PBS冲洗三遍，每遍5分钟。

5、滴加内源性过氧化物酶阻滞剂，静置10分钟。PBS冲洗三遍，每遍5分钟。

6、滴加正常非免疫动物血清封闭20分钟。

7、甩去正常非免疫动物血清，滴加一抗。4度孵育过夜。CYP11B2的稀释浓度是1：400；

8、室温下复温30分钟。PBS冲洗三遍，每遍10分钟。

9、滴加生物素标记的二抗孵育10分钟。PBS冲洗三遍，每遍5分钟。

10、滴加链霉菌抗生物素过氧化物酶溶液，静置10分钟。PBS冲洗三遍，每遍5分钟。

11、滴加DAB溶液，静置45秒以显色。

12、苏木素复染。

13、梯度脱水。

14、中心树胶封片，自然晾干。

15、显微摄影，拍片保存图像文件。

本发明通过CYP11B2免疫组化染色，结合CT影像学结果和HE染色结果，可以将134名单侧原发性醛固酮增多症患者分为以下四组：1.单侧单个APA组；2.单侧多个APA组；3.APCC组；4.未知病灶组，实现了单侧原发性醛固酮增多症患者病理分型诊断。

附图说明

图1为APA及APCC示意图(左列：100x比例尺：200μm；右列：400x比例尺：50μm)。

图2为CYP11B2染色强度示意图(左列：100x比例尺：200μm；右列：400x比例尺：50μm)。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

CYP11B2单克隆抗体(Millipore，美国)；

枸橼酸缓冲液(上海碧云天，中国)

苏木素/伊红染液(武汉谷歌生物，中国)

实施例1

一、肾上腺组织石蜡切片制备：

1、冲洗：肾上腺组织于4％多聚甲醛中充分固定48小时以上，取出放入组织脱水用小盒中，于小盒侧面写清标本名称，放入盛有清水的大烧杯中，流水下冲洗20-30分钟。

2、脱水、透明、浸蜡：将组织放入Thermo自动脱水机中，程序设置如下：75％酒精Ⅰ2小时→75％酒精Ⅱ2小时→85％酒精Ⅰ2小时→85％酒精Ⅱ2小时→95％酒精Ⅰ2小时→95％酒精Ⅱ2小时→100％酒精Ⅰ2小时→100％酒精Ⅱ2小时→二甲苯Ⅰ30分钟→二甲苯Ⅱ30分钟→浸蜡Ⅰ2小时，60度→浸蜡Ⅱ2小时，60度。

3、组织包埋：脱水结束后，将组织放入包埋模具中，滴入石蜡后快速且平稳的将蜡块放在冷却机上，等待其冷却。包埋时应尽量保证石蜡均匀的包裹住组织，以防止后续切片过程中出现组织破碎或皱缩现象，从而影响肾上腺组织切片完整性。

4、组织切片：提前将蜡块放入-30℃冰箱中冷冻30分钟，配置好30％酒精以备用。取出蜡块先使用刀片修掉四周多余石蜡，放置于切片机固定架中，调整蜡块和刀片的距离与角度。首先设置切片厚度为20微米以切除组织表面石蜡，待切至组织时，调整厚度为5微米，将切好的切片先在30％酒精中展开，在放入42℃水浴中，使用粘附型载玻片将切片捞起，尽可能使组织完整的贴服于载玻片表面，做好标记，放置于切片架上。

5、烤片：将所有切片都切好后放入60℃烘箱中烤片12-16小时，室温保存于切片盒中。二、苏木素-伊红染色(hematoxylin-eosin staining，HE染色)

1、组织石蜡切片制备方法如上所述。

2、染色前再次将切片放入60℃烘箱中烤片20分钟。

3、取出后立即放入两缸二甲苯中分别放置30分钟以脱蜡。

4、切片依次放入100％(I)、100％(II)、95％、90％、80％、70％乙醇中，均水化处理5分钟。

5、苏木素(提前过滤)染色5分钟，放入自来水中稍水洗。

6、1％盐酸酒精中分化3秒。

7、放入清水中浸泡20分钟，返蓝。

8、伊红中复染5分钟，自来水冲洗。

9、依次放入70％、90％、95％、100％乙醇脱水，二甲苯透明切片。

10、中性树胶封片。

11、显微镜下观察拍摄

三、免疫组织化学(immunohischemistry，IHC)染色

简称IHC染色，其原理为抗原抗体反应，即通过化学反应使已标记抗体的显色剂显色，以此来确定组织细胞内抗原，对其进行定位、定性或定量研究。

1、准备切片，在烘箱中烤片4-6小时。

2、脱蜡，水化：依次放入二甲苯I(15分钟)、二甲苯II(15分钟)、无水乙醇(5分钟)、95％乙醇(5分钟)、80％乙醇(5分钟)、75％乙醇(5分钟)及清水(5分钟)之中。

3、抗原修复：配制枸橼酸盐缓冲液抗原修复液，将水化后的切片放入抗原修复液中，微波炉高温煮5分钟，再中火煮10分钟，之后缓慢静置冷却至室温。

4、用组化笔圈选染色组织。PBS冲洗三遍，每遍5分钟。

5、滴加内源性过氧化物酶阻滞剂，静置10分钟。PBS冲洗三遍，每遍5分钟。

6、滴加正常非免疫动物血清封闭20分钟。

7、甩去正常非免疫动物血清，滴加一抗。4度孵育过夜。CYP11B2的稀释浓度是1：400；

8、室温下复温30分钟。PBS冲洗三遍，每遍10分钟。

9、滴加生物素标记的二抗孵育10分钟。PBS冲洗三遍，每遍5分钟。

10、滴加链霉菌抗生物素过氧化物酶溶液，静置10分钟。PBS冲洗三遍，每遍5分钟。

11、滴加DAB溶液，静置45秒以显色。

12、苏木素复染。

13、梯度脱水。

14、中心树胶封片，自然晾干。

15、显微摄影，拍片保存图像文件。之后使用ImageJ软件分别计数500个肿瘤实质细胞，同时计数其中染色阳性细胞数量，重复三遍，计算H评分。H评分的计算公式为：染色阳性细胞/肿瘤实质细胞总数*100*染色强度。染色强度分四档，分别是强阳性(+++)、中等阳性(++)、弱阳性(+)和阴性(-)，强阳性是3分，中等阳性2分，弱阳性1分，阴性0分。

结果：

在本发明研究入组的134例患者中，通过HE染色，77.6％(104/134)的患者诊断为单侧肾上腺腺瘤，22.4％(30/134)的患者诊断为UAH。在104名通过HE染色诊断为单侧肾上腺腺瘤的患者中，91名患者通过CYP11B2免疫组化染色发现肿瘤染色阳性，1名患者没有发现肿瘤染色阳性但是在肾上腺瘤旁皮质上发现了一个APCC，1名患者既没有发现肿瘤染色阳性又没有在肾上腺瘤旁皮质上发现APCC，11名患者通过CYP11B2染色发现多个染色阳性的肿瘤(其中3名患者在CT检查中显示出多个腺瘤，而剩余8名患者在CT上只显示出单个腺瘤)。在30名HE染色诊断为UAH的患者中，通过CYP11B2免疫组化染色，27名患者发现染色阳性的肾上腺皮质结节，这27名患者应更正诊断为APA，3名患者没有发现染色阳性的皮质结节也没有发现染色弥漫阳性的增生球状带组织而是在肾上腺皮质中发现了若干个APCC，这三名患者应更正诊断为APCC。APA及APCC示意图如图1所示。综上所述，本发明通过CYP11B2免疫组化染色，结合CT影像学结果和HE染色结果，可以将134名单侧原发性醛固酮增多症患者分为以下四组：(1)118名单侧单个APA患者；(2)11名单侧多个APA患者；(2)4名APCC患者；

(4)1名阴性结果患者。

如图2所示为染色强度示意图。在所有118名单侧单个肾上腺腺瘤患者中，21.2％(25/118)的患者染色强度是强阳性，46.6％(55/118)的患者染色强度是中等阳性，32.2％(38/118)的患者染色强度是弱阳性。