一种金属@茶多酚纳米颗粒自组装生物组织及其制备方法

摘要

本发明提供了一种金属@茶多酚纳米颗粒自组装生物组织及其制备方法，属于医用生物材料领域。本发明提供了一种生物组织交联和功能化方法，包括如下步骤：步骤1，将生物组织浸泡在金属离子反应液中，震荡2天～10天，得金属离子自组装生物组织；步骤2，将所述金属离子自组装生物组织置于茶多酚溶液中，30℃‑40℃下震荡6～20小时，即得金属@茶多酚纳米颗粒自组装生物组织。本发明提供的金属@茶多酚纳米颗粒自组装脱细胞基质补片交联程度高，生物力学和生物稳定性能显著提高，生物相容性好、钙化潜力低；所制备的金属@茶多酚纳米颗粒自组装脱细胞基质补片具有抗菌功能；当金属为铜时，所制备的基质补片还具有促血管形成功能。

说明书

技术领域

本发明涉及医用生物材料领域，具体涉及一种金属@茶多酚纳米颗粒自组装生物组织及其制备方法。

背景技术

医用外科补片材料按照来源可分为合成高分子材料(如聚氨酯、聚酯、聚乳酸等)、天然高分子材料(如胶原、丝蛋白、纤维素、壳聚糖等)、天然生物组织材料(如自体、异体、异种生物组织和器官等)。其中生物组织因具有天然三维构型和生物力学性能，在维持人体动态修复和替换中具有重要的作用和功能。各种动物来源的生物补片，如牛心包、猪心包、猪小肠粘膜下层等异种生物组织因来源广泛、无伦理学限制、易于塑形缝合、具有良好的柔韧性和延展性等特点，是最常用的补片材料，并广泛应用于心血管外科、普通外科、妇产科、脑外科等诸多医学领域。

为解决异种生物补片植入人体后的免疫原性等问题，最广泛应用的方法仍旧是戊二醛化学交联改性。但戊二醛细胞毒性大，交联组织再生修复能力差；而且戊二醛交联后残留的醛基易结合钙盐，导致生物组织补片耐久性差。随着组织工程技术的不断发展，现有的研究表明脱细胞是去除异种生物组织免疫原性、减少钙化的重要方式。与人工合成材料、化学交联的生物材料相比，脱细胞生物组织生物相容性好，其三维空间结构及保留的生物活性成分和生长因子更利于细胞化和再生修复，因而被认为是组织工程领域中具广泛应用前景的材料之一。但是，未交联的生物组织力学性能低、生物稳定性差，特别是在心血管外科应用时，易发生动脉瘤等并发症。因此，目前商品化的脱细胞基质仍多采用戊二醛交联处理以提高其抗酶解能力和力学性能。

构建功能化补片是未来生物材料发展方向并是当今研究的热点。例如有研究通过在合成高分子材料或天然高分子材料中掺入金属或金属基纳米颗粒以赋予生物材料抗菌等功能。但是金属基纳米颗粒的合成通常需要高温高压环境，并且采用有毒化学试剂作为还原剂和稳定剂。而天然生物材料不耐高温、不能用有害化学试剂处理，目前在天然生物材料上负载金属基纳米颗粒的研究报导较少。

发明内容

本发明是为了解决上述问题而进行的，目的在于提供一种金属@茶多酚纳米颗粒自组装生物组织及其制备方法，金属@茶多酚纳米颗粒自组装生物组织可用于心血管疾病(如心脏瓣膜修复，心脏缺损修补，心肌梗死等原因所导致的坏死室壁修复，血管瘤、血管狭窄等原因造成的血管瘘口修补等)、腹部疾病(如因腹部肿瘤切除致腹部缺损修补、无张力疝修补等)、妇科疾病(如盆腔脏器脱垂、压力性尿失禁等盆底修复及重建)等外科手术治疗的修补或重构材料。

本发明提供了一种金属@茶多酚纳米颗粒自组装生物组织的制备方法，具有这样的特征，用于制备金属@茶多酚纳米颗粒自组装生物组织，其特征在于，包括如下步骤：步骤1，将生物组织浸泡在金属离子反应液中，震荡2～10天，得金属离子自组装生物组织；步骤2，将所述金属离子自组装生物组织置于茶多酚溶液中，30℃-40℃下震荡6～20小时，即得金属@茶多酚纳米颗粒自组装生物组织。

在本发明提供的金属@茶多酚纳米颗粒自组装生物组织的制备方法中，还可以具有这样的特征：其中，所述金属离子反应液为金属阳离子的水溶液。

在本发明提供的金属@茶多酚纳米颗粒自组装生物组织的制备方法中，还可以具有这样的特征：其中，所述金属阳离子的水溶液为铜离子水溶液(优选为硫酸铜、醋酸铜、氯化铜、氯化亚铜等含铜离子的化合物中的任意一种或多种的水溶液)、锌离子水溶液(优选为硫酸锌、氯化锌、醋酸锌等含锌离子的化合物中的任意一种或多种)、银离子水溶液(优选为硝酸银、氯化银、氢氧化银、硫酸银等含银离子的化合物中的任意一种或多种)以及镁离子水溶液(优选为硫酸镁、氯化镁、硝酸镁、醋酸镁等含镁离子的化合物中的任意一种或多种)。

在本发明提供的金属@茶多酚纳米颗粒自组装生物组织的制备方法中，还可以具有这样的特征：其中，所述茶多酚水溶液为脱咖啡碱的绿茶浸提液或绿茶多酚提取物溶液。

在本发明提供的金属@茶多酚纳米颗粒自组装生物组织的制备方法中，还可以具有这样的特征：其中，所述茶多酚水溶液的浓度为0.5～3mg/mL。

在本发明提供的金属@茶多酚纳米颗粒自组装生物组织的制备方法中，还可以具有这样的特征：其中，所述脱咖啡碱的绿茶浸提液的制备方法包括如下步骤：步骤1，称取干茶叶，以料液比1g:(15-25)mL加入预热至90℃-100的水，水浴下漂洗5分钟，得脱咖啡碱茶叶；步骤2，将所述脱咖啡碱茶叶烘干，碾磨成粉末，按0.5～1.5g:10mL料液比加入水50℃-80℃加热50-70分钟，冷却，离心，过滤，取滤液，即得所述脱咖啡碱的绿茶浸提液。

在本发明提供的金属@茶多酚纳米颗粒自组装生物组织的制备方法中，还可以具有这样的特征：其中，所述绿茶多酚提取物溶液的制备方法包括如下步骤：称取绿茶多酚提取物，以料液比(0.5～3)mg:1mL加入水，搅拌混匀，离心，过滤，取滤液，即得所述绿茶多酚提取物溶液。

在本发明提供的金属@茶多酚纳米颗粒自组装生物组织的制备方法中，还可以具有这样的特征：其中，所述生物组织为脱细胞基质。

在本发明提供的生物组织交联和功能化方法中，还可以具有这样的特征：其中，所述脱细胞基质为牛心包、猪心包、牛主动脉瓣、猪主动脉瓣、牛小肠粘膜下层或猪小肠粘膜下层中的任意一种。

本发明还提供了一种金属@茶多酚纳米颗粒自组装生物组织，由上述任意一种生物组织交联和功能化方法制成。

在本发明提供的金属@茶多酚纳米颗粒自组装生物组织中，还可以具有这样的特征：金属@茶多酚纳米颗粒自组装生物组织的原料包括：脱细胞质基质，具有脱细胞基质纤维；茶多酚，通过氢键自组装结合到所述脱细胞基质上；金属离子，通过静电结合自组装结合到所述脱细胞基质上，用于与所述茶多酚螯合，并在茶多酚的还原作用下，在脱细胞基质纤维上原位生成具有核@壳样结构的金属@茶多酚纳米颗粒。

在本发明提供的金属@茶多酚纳米颗粒自组装生物组织中，还可以具有这样的特征：其中，金属纳米颗粒的粒径为10nm-30nm，优选为直径为20nm的大小均一的球形。

发明的作用与效果

根据本发明所涉及的生物组织交联和功能化方法，因为反应条件温和，无需使用有害化学试剂，所以，本发明是一种绿色制备方法,制备工艺简单、成本低。

根据本发明所涉及的金属@茶多酚纳米颗粒自组装生物组织，因为采用了生物组织交联和功能化方法制备，所以制备的金属@茶多酚纳米颗粒自组装脱细胞基质补片交联度高，生物力学和生物稳定性能显著提高，生物相容性好、钙化潜力低，所制备的金属@茶多酚纳米颗粒自组装脱细胞基质补片具有抗菌和促血管形成的功能。

附图说明

图1是本发明的实施例中金属@茶多酚纳米颗粒自组装生物组织中纳米颗粒的透射电子显微镜图；

图2是本发明的实施例中金属@茶多酚纳米颗粒自组装生物组织的抽提细胞毒性检测结果；

图3是本发明的实施例中金属@茶多酚纳米颗粒自组装生物组织的溶血实验结果；

图4是本发明的实施例中金属@茶多酚纳米颗粒自组装生物组织的生物组织交联度检测结果；

图5是本发明的实施例中金属@茶多酚纳米颗粒自组装生物组织的生物组织生物力学检测结果；

图6是本发明的实施例中金属@茶多酚纳米颗粒自组装生物组织的生物组织Thermal变性温度检测结果；

图7是本发明的实施例中金属@茶多酚纳米颗粒自组装生物组织的生物组织抗酶解的能力的检测结果；

图8是本发明的实施例中金属@茶多酚纳米颗粒自组装生物组织的钙含量定量检测结果；

图9本发明的实施例中金属@茶多酚纳米颗粒自组装生物组织的抗菌实验结果；

图10本发明的实施例中茶多酚/金属纳米颗粒自组装生物组织的促血管生成的结果；

图11是本发明的实施例二中0.2mg/mL硫酸铜水溶液制备的金属@茶多酚纳米颗粒自组装生物组织的抽提细胞毒性检测结果；

图12是本发明的实施例二中0.3mg/mL硫酸铜水溶液制备的金属@茶多酚纳米颗粒自组装生物组织的抽提细胞毒性检测结果；

图13是本发明的实施例二中0.4mg/mL硫酸铜水溶液制备的金属@茶多酚纳米颗粒自组装生物组织的抽提细胞毒性检测结果；以及

图14是本发明的实施例二中0.5mg/mL硫酸铜水溶液制备的金属@茶多酚纳米颗粒自组装生物组织的抽提细胞毒性检测结果。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，以下结合实施例及附图对本发明作具体阐述。

下述实施例中使用的脱细胞牛心包来源如下：

在本实施例中，脱细胞牛心包的制备方法包括如下步骤：在真空条件下，将牛心包置于脱细胞缓冲液中冷冻2～5小时，其中脱细胞缓冲液为含有1％(V/V)Triton x-100、0.5％(W/V)脱氧胆酸钠的Tris缓冲液(pH值为7.6)；冷冻结束后，将冷冻后的牛心包置于37℃水浴溶解；重复上述步骤3次，将牛心包进行多次冻融；去离子水漂洗后，将反复冻融后的牛心包放置于脱细胞缓冲液中，并在37℃摇床中处理震荡48小时；用磷酸盐溶液对无菌去离子水清洗后的牛心包震荡清洗96小时后，得到脱细胞牛心包。

在别的实施方式中，脱细胞牛心包亦可采用其它脱细胞方法获得。

<实施例一>

一种金属@茶多酚纳米颗粒自组装生物组织，其制备方法包括如下步骤：

步骤1，将脱细胞牛心包浸泡在浓度为0.1mg/mL的硫酸铜水溶液中，震荡7天，得金属离子自组装生物组织；

步骤2，将金属离子自组装生物组织置于浓度为2.89mg/mL茶多酚溶液中，40℃下震荡12小时，即得金属@茶多酚纳米颗粒自组装生物组织。

在本实施例中，硫酸铜水溶液的浓度是0.1mg/mL；茶多酚溶液为脱咖啡碱的绿茶浸提液，其制备方法包括如下步骤：称取干茶叶，以料液比1:20(g/mL)加入预热至100℃的双蒸水，恒温水浴下漂洗5分钟；脱咖啡碱茶叶置于70℃烤箱烘干；烘干茶叶碾磨成粉末，按1:10(g/mL)料液比加入双蒸水60℃加热60分钟，冷却，离心，过滤，取滤液过滤灭菌即得。

图1是本发明的实施例中金属@茶多酚纳米颗粒自组装生物组织中纳米颗粒的透射电子显微镜图(图中标尺为100nm)。

如图1所示，在透射电子显微镜下对本实施例提供的金属@茶多酚纳米颗粒自组装生物组织中原位生成的金属纳米颗粒大小约为20nm，大小均匀，形状为球形，为核@壳样结构，且与脱细胞基质纤维结合紧密。

<对照例>

对照例分别为脱细胞牛心包和戊二醛交联的脱细胞牛心包。

脱细胞牛心包制备方法：在真空条件下，将牛心包置于脱细胞缓冲液中冷冻2～5小时，其中脱细胞缓冲液为含有1％(V/V)Triton x-100、0.5％(W/V)脱氧胆酸钠的Tris缓冲液(pH值为7.6)；冷冻结束后，将冷冻后的牛心包置于37℃水浴溶解；重复上述步骤3次，将牛心包进行多次冻融；去离子水漂洗后，将反复冻融后的牛心包放置于脱细胞缓冲液中，并在37℃摇床中处理震荡48小时；用磷酸盐溶液对无菌去离子水清洗后的牛心包震荡清洗96小时后，得到脱细胞牛心包。

戊二醛交联的脱细胞牛细胞制备方法：将脱细胞牛心包浸泡在浓度为0.6％戊二醛溶液中，震荡1天；将所得生物组织浸泡在0.2％戊二醛溶液中震荡6天；磷酸盐缓冲液清洗，去除未结合的戊二醛。

<测试例1>

毒性检测

对实施例提供的金属@茶多酚纳米颗粒自组装生物组织进行毒性检测，检测方法采用抽提细胞毒性实验，无毒性标准参照ISO10993-5标准进行，检测结果如图2所示。如图2所示，金属@茶多酚纳米颗粒自组装脱细胞基质补片生物相容具有良好的生物相容性，抽提细胞毒性检测表明L929细胞的存活率符合医疗器械生物相容性标准。

<测试例2>

溶血实验

对实施例提供的金属@茶多酚纳米颗粒自组装生物组织进行血液相容性检测，检测方法为溶血实验，安全标准参照ISO 10993-4：2002标准进行，检测结果如图3所示。如图3所示，金属@茶多酚纳米颗粒自组装脱细胞基质补片符合医疗器械生物相容性标准。

其中，图中阳性对照为去离子水。

阴性对照为磷酸盐缓冲液。

<测试例3>

生物组织交联程度

对实施例以及对照例提供的生物组织进行交联程度检测，检测方法为茚三酮比色法，检测结果如图4所示。

如图4所示，以未交联的脱细胞牛心包为100％游离氨基酸对照，金属@茶多酚纳米颗粒自组装脱细胞基质补片的交联程度为82％。戊二醛交联的脱细胞基质补片的交联程度为85％，两者的交联程度无差异(P>0.05)

<测试例4>

生物力学测试

对实施例以及对照例提供的生物组织以及未交联的脱细胞基质进行生物力学测试，采用拉力测试仪检测。

检测结果如图5所示。

如图5所示，金属@茶多酚纳米颗粒自组装脱细胞基质补片的最大载荷、最大应力、弹性模量等生物力学性能指标与戊二醛交联的脱细胞基质无显著差异，均远高于未交联的脱细胞基质。

<测试例5>

Thermal变性温度测试

对实施例以及对照例提供的生物组织以及未交联的脱细胞基质进行Thermal变性温度测试，采用差示扫描量仪检测，

检测结果如图6所示。

如图6所示，金属@茶多酚纳米颗粒自组装脱细胞基质补片的胶原变性温度可达到81℃，接近戊二醛交联的脱细胞基质(85℃)，两者均远高于未交联的脱细胞基质。

<测试例6>

抗胶原酶降解的能力测试

对实施例以及对照例提供的生物组织以及未交联的脱细胞基质进行抗胶原酶降解的能力测试，检测方法为酶失重实验。

检测结果如图7所示。

如图7所示，金属@茶多酚纳米颗粒自组装脱细胞基质补片的胶原酶降解速度与戊二醛交联的脱细胞基质无显著差异，胶原酶处理14天，组织重量减少率<10％，而未交联的脱细胞基质完全消失。

<测试例7>

组织内钙含量定量检测

对实施例以及对照例提供的生物组织以及未交联的脱细胞基质进行组织内钙含量定量检测，检测方法为茜素红比色定量法。

检测结果如图8所示。

如图8所示，金属@茶多酚纳米颗粒自组装脱细胞基质补片的钙盐沉积显著低于与戊二醛交联的脱细胞基质。

<测试例8>

琼脂糖弥散抗菌实验

对实施例以及对照例提供的生物组织进行琼脂糖弥散抗菌实验。

检测结果如图9所示。

如图9所示，金属@茶多酚纳米颗粒自组装脱细胞基质补片具有抗菌功能，琼脂糖弥漫实验表明该补片周围可见透明抑菌带，未交联的脱细胞基质和戊二醛交联的脱细胞基质周围无透明抑制带。

<测试例9>

促血管形成功能测试

对实施例提供的生物组织进行促血管形成功能测试，检测方法为毛细血管形成实验：

检测结果如图10所示。

如图10所示，金属@茶多酚纳米颗粒自组装脱细胞基质补片具有促血管形成功能，与未交联的脱细胞基质和交联的脱细胞基质相比，其显著促进毛细血管网络形成。

实施例的作用与效果

根据实施例所涉及的生物组织交联和功能化方法，因为反应条件温和，无需使用有害化学试剂，所以，本发明是一种绿色制备方法，制备工艺简单、成本低。

根据实施例所涉及的金属@茶多酚纳米颗粒自组装生物组织，因为采用了生物组织交联和功能化方法制备，所以制备的金属@茶多酚纳米颗粒自组装脱细胞基质补片交联程度高，生物力学和生物稳定性能显著提高，生物相容性好、钙化潜力低，所制备的金属@茶多酚纳米颗粒自组装脱细胞基质补片具有抗菌和促血管形成功能。

上述实施方式为本发明的优选案例，并不用来限制本发明的保护范围。

<实施例二>

一种金属@茶多酚纳米颗粒自组装生物组织，其制备方法包括如下步骤：

步骤1，将脱细胞牛心包浸泡在不同浓度金属前驱体溶液中，震荡7天，得金属离子自组装生物组织；

步骤2，将金属离子自组装生物组织置于浓度为2.89mg/mL茶多酚溶液中，40℃下震荡12小时，即得金属@茶多酚纳米颗粒自组装生物组织。

在本实施例中，金属前驱体溶液分别采用0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL的硫酸铜水溶液；茶多酚溶液为脱咖啡碱的绿茶浸提液，其制备方法包括如下步骤：称取干茶叶，以料液比1:20(g/mL)加入预热至100℃的双蒸水，恒温水浴下漂洗5分钟；脱咖啡碱茶叶置于70℃烤箱烘干；烘干茶叶碾磨成粉末，按1:10(g/mL)料液比加入双蒸水60℃加热60分钟，冷却，离心，过滤，取滤液过滤灭菌即得。

<测试例10>

0.2mg/mL金属前驱体毒性检测

对实施例二中0.2mg/mL硫酸铜水溶液制备的金属@茶多酚纳米颗粒自组装生物组织进行毒性检测，检测方法采用抽提细胞毒性实验，无毒性标准参照ISO 10993-5标准进行，检测结果如图11所示。如图11所示，金属@茶多酚纳米颗粒自组装脱细胞基质补片生物细胞相容性差，抽提细胞毒性检测表明L929细胞的存活率在第二天开始低于医疗器械生物相容性标准。

<测试例11>

0.3mg/mL金属前驱体毒性检测

对实施例二中0.3mg/mL硫酸铜水溶液制备的金属@茶多酚纳米颗粒自组装生物组织进行毒性检测，检测方法采用抽提细胞毒性实验，无毒性标准参照ISO 10993-5标准进行，检测结果如图12所示。如图12所示，金属@茶多酚纳米颗粒自组装脱细胞基质补片生物细胞相容性差，抽提细胞毒性检测表明L929细胞的存活率在第二天开始低于医疗器械生物相容性标准。

<测试例12>

0.4mg/mL金属前驱体毒性检测

对实施例二中0.4mg/mL硫酸铜水溶液制备的金属@茶多酚纳米颗粒自组装生物组织进行毒性检测，检测方法采用抽提细胞毒性实验，无毒性标准参照ISO 10993-5标准进行，检测结果如图13所示。如图13所示，金属@茶多酚纳米颗粒自组装脱细胞基质补片生物细胞相容性差，抽提细胞毒性检测表明L929细胞在第二天、第三天基本死亡。

<测试例13>

0.5mg/mL金属前驱体毒性检测

对实施例二中0.5mg/mL硫酸铜水溶液制备的金属@茶多酚纳米颗粒自组装生物组织进行毒性检测，检测方法采用抽提细胞毒性实验，无毒性标准参照ISO 10993-5标准进行，检测结果如图14所示。如图14所示，金属@茶多酚纳米颗粒自组装脱细胞基质补片生物细胞相容性差，抽提细胞毒性检测表明L929细胞的存活率自第一天开始低于医疗器械生物相容性标准，第二天、第三天细胞基本死亡。

实施例的作用与效果

实施例二中分别采用0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL的硫酸铜水溶液制备金属@茶多酚纳米颗粒自组装生物组织，抽提细胞毒性检测表明所制备的的金属@茶多酚纳米颗粒自组装生物组织生物相容性差，具有细胞毒性。因此，在生物补片制备中需要进行细胞相容性实验，通过调控金属前驱体的浓度，控制金属离子自组装量，提高生物相容性。