一种热提取结合分散固相萃取测定鲜烟叶中硝酸根与亚硝酸根的方法

摘要

本发明公开了一种热提取结合分散固相萃取测定鲜烟叶中硝酸根与亚硝酸根的方法，包括如下步骤：鲜烟叶低温冷冻干燥后将其研磨成粉末，鲜烟叶中的硝酸根与亚硝酸利用稀碱性溶液与分散固相萃取进行同步萃取与净化，提取净化液离心过滤后直接利用离子相互作用反相液相色谱‑二极管阵列检测器进行定性与定量分析，采用保留时间定性，外标法定量。本发明与其他分析方法相比，具有分离能力强、分析速度快、干扰低、准确度与灵敏度高的特点，特别是水浴加热与涡旋振荡提取结合能有效减少方法前处理的提取时间与提取效率，稀碱性溶液能有效稳定亚硝酸根，活性炭分散固相萃取基质能有效去除干扰物，从而提高其分析准确性，离子相互作用反相液相色谱的应用，也有效增加了目标物的分离能力与保留能力。

说明书

技术领域

本发明涉及鲜烟叶中硝酸根与亚硝酸根的测定方法，特别指出一种稀碱性溶液热提取结合分散固相萃取净化的前处理方法。

背景技术

氮素的吸收、同化与利用在烟草的代谢中有着极其重要的地位，关系着烟草的生长、发育、产量和品质。氮素的同化过程是烟草最基本的同化过程之一。烟草利用的氮源一般可分为硝态氮和氨态氮两种。烟草可以直接吸收氨态氮，也可以在吸收硝态氮后将其还原成氨态氮。硝酸盐是烟草生长重要的氮素来源，通过硝酸还原酶的作用转变为亚硝酸盐，再通过亚硝酸还原酶的作用转变成氮循环的重要原料-铵，然后被同化成氨基酸再参与体内的各种代谢生理活动，从而调节氮代谢，并影响到光合碳代谢，进而影响烟草的生长。同时硝酸盐和亚硝酸盐作为烟草中一类重要的含氮化合物，其含量的多少不但直接影响烟叶的吃味和品质还会影响其他含氮化合物的形成和含量。其中，亚硝酸盐的含量与主流烟气中氨的释放量成显著正相关，从而影响烟气的pH值；亚硝酸盐也是烟草特有亚硝胺的直接前体物，它的含量与烟草特有亚硝胺的含量呈显著相关。目前，对硝酸根与亚硝酸根定量分析的研究主要集中在对不同类型烟叶、烟用香精香料与卷烟纸等基质进行检测，而对鲜烟叶中硝酸根与亚硝酸根的定量检测技术方法未见报道，鲜烟叶中的硝酸根与亚硝酸根不仅与氮素吸收相关，同时也决定这烤烟中特有亚硝胺、烟气pH值等关键指标。因此，同时测定鲜烟叶中硝酸根与亚硝酸根含量具有十分重要的意义。

现有对硝酸根与亚硝酸根的检测方法主要有光谱法、色谱法、电化学法与极谱法等，其中色谱法具有专一性强、稳定性好，灵敏度高，结果准确可靠的特点。色谱法中主要包括液相色谱，离子色谱与气相色谱等。在液相色谱流动相中添加剂选择合适的情况下，高效液相色谱的理论柱效率要优于离子色谱，且离子色谱易出现不对称峰形与受到氯离子的干扰。气相色谱法需要复杂的衍生程序，耗时且试剂成本较高。在样品前处理方面，硝酸根与亚硝酸根一般采用水提取，有机溶剂萃取与滤膜净化，但亚硝酸根在中性与酸性提取条件下稳定性低，易转化为硝酸根与一氧化氮，且有机溶剂萃取与滤膜净化的能力相对较差。因此非常必要建立一套有效的样品前处理与检测方法同时测定鲜烟叶中的硝酸根与亚硝酸根，该方法具有分离能力强、分析速度快、干扰低、准确度与灵敏度高的特点，能够为烟叶的氮素转化与烟草安全性评价等提供科学依据。

发明内容

针对现有技术存在的不足之处，本发明提供一种稀碱性溶液热提取结合分散固相萃取净化，离子相互作用反相液相色谱-二极管阵列检测器同时分离、定量硝酸根与亚硝酸根的方法。该方法解决了亚硝酸根在中性与酸性提取条件下稳定性低，样品净化效果差的前处理技术问题，结合离子相互作用反相液相色谱检测，该方法具有分离能力强、分析速度快、干扰低、准确度与灵敏度高的特点，能同时定性与定量分析鲜烟叶中的硝酸根与亚硝酸根。

本发明的技术方案是：一种热提取结合分散固相萃取测定鲜烟叶中硝酸根与亚硝酸根的方法，包括以下步骤：

S1鲜烟叶样品的预处理：先将采集的鲜烟叶样品进行液氮速冻处理，然后采用低温冷冻干燥法干燥，干燥后将其研磨成粉末，得鲜烟叶样品粉末备用；

S2鲜烟叶样品中硝酸根与亚硝酸根的提取与净化：称取一定量的鲜烟叶样品，同时加入稀碱性溶液与分散固相萃取基质，采用热提取结合分散固相萃取的方法同时进行提取与净化样品中的硝酸根与亚硝酸根；

S3硝酸根与亚硝酸的测定方法：将提取液采用离子相互作用反相液相色谱-二极管阵列检测器进行分离与定量，以保留时间定性，外标法定量。

进一步说，鲜烟叶样品中硝酸根与亚硝酸根的提取与净化方法为：称取50-100mg鲜烟叶粉末于10mL玻璃离心管中，准确加入50-100mg分散固相萃取基质后再加入4-8mL稀碱性溶液，放入60℃水浴中加热提取10-20min，再放入涡旋振荡器中涡旋，分散固相萃取净化10-20min后3000rpm离心5min，将上层清液过0.22μm水系滤膜后进行色谱分析。

进一步说，所述的稀碱性溶液为0.05M氢氧化钠溶液；

进一步说，所述的分散固相萃取基质为～100目活性炭粉末；

进一步说，硝酸根与亚硝酸的测定方法为：超高效液相色谱-二极管阵列检测器，色谱柱为UPLC HSS T3色谱柱，(2.1mm×100mm,1.8μm,)，液相色谱流速为0.15mL/min，色谱柱温度为35℃，检测波长210nm，进样量为1μL，运行时间8min。流动相组成30％甲醇水溶液，加入特定量与比例的离子相互作用试剂，pH为6.0-6.5。二极管阵列检测器测定为全波长扫描200-400nm，分辨率1.2nm。在此色谱条件下，亚硝酸与硝酸根的保留时间分别为3.68与4.12min；

进一步说，所述的特定量与比例的离子相互作用试剂为辛胺+正磷酸(85％)：30％甲醇水溶液(v/v)＝0.259％，辛胺：正磷酸(85％)(v/v)＝763:273。

上述技术方案的有益之处在于：

本发明的有益效果是：建立了一种稀碱性溶液热提取结合分散固相萃取净化，离子相互作用反相液相色谱-二极管阵列检测器同时分离、定量硝酸根与亚硝酸根的方法。本发明的优点是：1)60℃水浴加热与涡旋振荡提取结合能有效减少方法提取时间与提高提取效率；2)亚硝酸根在稀碱性溶液中稳定，消除了亚硝酸根的降解反应；3)活性炭分散固相萃取基质能有效去除干扰物；4)离子相互作用试剂辛胺与正磷酸的添加有效增加了目标物的分离能力与保留能力；5)离子相互作用反相液相色谱-二极管阵列检测器分离速度快、线性范围宽、灵敏度高。因此，该方法具有分离能力强、分析速度快、干扰低、准确度与灵敏度高的特点，能同时定性与定量分析鲜烟叶中的硝酸根与亚硝酸根。

附图说明

图1标样稳定性试验色谱图(上图为标样色谱图，下图为进样100个样品后相同的标样色谱图)

图2鲜烟叶中亚硝酸根与硝酸根的标样(A)、样品(B)及标样在样品的添加回收(C)色谱图

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

一种热提取结合分散固相萃取测定鲜烟叶中硝酸根与亚硝酸根的方法，该方法包括样品干燥、样品前处理和分析检测步骤：所述的鲜烟叶样品干燥是先将采集的鲜烟叶样品进行液氮速冻处理，然后采用低温冷冻干燥法干燥，干燥后将其研磨成粉末，得烟叶样品粉末备用；所述的鲜烟叶样品前处理为硝酸根与亚硝酸根的提取与净化，称取一定量的鲜烟叶样品，同时加入稀碱性溶液与分散固相萃取基质，采用热提取结合分散固相萃取的方法同时提取与净化样品中的硝酸根与亚硝酸根；所述的硝酸根与亚硝酸根的分析检测是将提取净化液进行离子相互作用反相液相色谱-二极管阵列检测器的分离与定量，以保留时间定性，外标法定量。

本发明优选的实施方式如下：

实施例1：鲜烟叶中硝酸根与亚硝酸的同时分析方法

根据本发明实施例中一种热提取结合分散固相萃取测定鲜烟叶中硝酸根与亚硝酸根的方法，包括以下步骤：

A、鲜烟叶样品的干燥：先将采集的鲜烟叶样品进行放入液氮中进行速冻处理，然后采用冷冻干燥法干燥，干燥后将其研磨成粉末，得烟叶样品粉末备用。具体冷冻干燥法处理步骤为：

a、烟叶样品预冻：将液氮冷冻后的烟叶样品在真空冷冻干燥仪中-20℃保持5h；

b、第一阶段升华：在0℃下干燥15h；

c、第二阶段升华：在20℃下干燥直至样品恒重。

B、鲜烟叶样品的前处理：称取50mg鲜烟叶粉末于10mL玻璃离心管中，加入50mg的～100目活性炭分散固相萃取基质后再加入4mL 0.05M的氢氧化钠溶液，放入60℃水浴中加热提取10min，再放入涡旋振荡器中分散固相萃取净化20min提取后3000rpm离心5min，将上层清液过0.22μm水系滤膜后得萃取液。

C、离子相互作用反相液相色谱-二极管阵列检测器的定性与定量分析：AcquityUPLC H-CLASS超高效液相色谱仪，配二极管阵列检测器，色谱柱为Acquity UPLC HSS T3色谱柱，(2.1mm×100mm,1.8μm,)(无预柱组成)，液相色谱流速为0.15mL/min，色谱柱温度为35℃，检测波长210nm，进样量为1μL，运行时间8min。流动相组成30％甲醇水溶液(400mL)，加入763μL辛胺，再加入273μL正磷酸，pH为6.0-6.5。二极管阵列检测器测定为全波长扫描200-400nm，分辨率1.2nm。在此色谱条件下，亚硝酸与硝酸根的保留时间分别为3.68与4.12min。采用保留时间定性，外标法标准曲线法定量，同时利用190-500nm全扫描光谱图验证是否有干扰物存在影响硝酸与硝酸根的定量。

实施例2：本发明方法的线性、回收率、精密度与灵敏度验证

外标法建立硝酸根与亚硝酸根的标准曲线，以峰面积为y，硝酸根与亚硝酸根的浓度为x，建立y＝ax+b的线性方程。鲜烟叶中硝酸根与亚硝酸根的线性范围分别为0.5-50μg/mL与0.03-3μg/mL，当浓度为0.05μg/mL的条件下进行色谱分析，以3倍信噪比计算方法LOD，10倍信噪比计算方法LOQ。从下表1可以看到，方法的线性相关较好，相关回归系数R

表1硝酸根与亚硝酸根的线性关系与检测限

方法回收率的验证采用标样添加法，添加一定量的硝酸根与亚硝酸根于样品中，混匀后4℃下放置过夜后进行提取净化及色谱分析。回收率为添加后样品中对应目标物的含量减去空白样品中目标物的含量除以添加的目标物含量。添加浓度大约为样品中本身含量的一半与一倍，由于硝酸根含量较高，添加含量大约为本身含量的1/4与一半。分别向烟叶中添加亚硝酸根25与50μg/g，硝酸根500与1000μg/g。方法的精密度为将二个浓度添加在同一天内重复5次，为其日内精密度，在5天内重复5次为日间精密度。检测样品的稳定性测试为在常温条件下放置0、6、12、18、24、36、48h后进行峰面积的测定比较，得到对应的相对标准偏差。结果如下表2所示：亚硝酸根与硝酸根的回收率分别为94.9％-101.2％与93.6％-95.7％，日内精密度分别为4.06％-4.87％与2.67％-3.11％，日间精密度分别为5.48％-6.65％与3.48％-4.79％，二者的稳定性分别为1.07％-0.56％。上述结果表明该方法符合严格的定量要求。由于流动相为等梯度洗脱，且甲醇相对较低，因此，进样一段时间后可能会导致分析物保留时间变化或杂质干扰，通过第一针进标样，中间进100针左右的样品，再进相同的标样，结果如图1所示，分析物保留时间与峰面积类似，未有杂质干扰。图2为亚硝酸与硝酸根的标样、样品及添加色谱图。

表2亚硝酸根与硝酸根的回收率，精密度与稳定性验证

实施例3：测量鲜烟叶中硝酸根与亚硝酸的含量组成

为了研究不同施氮量与不同留叶数烟叶中硝酸根与亚硝酸的变化趋势，以主栽品种K326为研究对象，施用不同氮肥与保留不同留叶数，其他栽培措施都按照常规栽培要求进行。按照实施例1中的方法对不同施氮量(3与6公斤/亩)与不同留叶数(12与16片叶)的鲜烟叶进行硝酸根与亚硝酸的含量分析。测定结果如表3。

表3不同施氮量与留叶数对鲜烟叶中硝酸根与亚硝酸的含量组成影响

注：N3和N6分别为3和6公斤氮；Y12与Y16分别为留12与16片叶

将不同施氮量与留叶数的鲜烟叶进行硝酸根与亚硝酸的含量分析，结果表明鲜烟叶中硝酸根的含量随着施氮量的增加显著增加，随着留叶数的增加而显著降低，且亚硝酸根也有类似的变化趋势。施氮量与留叶数相比较，施氮量更能影响鲜烟叶中硝酸根与亚硝酸的含量组成。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。