一种磁微粒化学发光法测定细胞角蛋白19片段含量的试剂盒

摘要

本发明提供了一种磁微粒化学发光法测定细胞角蛋白19片段含量的试剂盒，所述试剂盒包括细胞角蛋白19片段抗体标记的磁微粒试剂、细胞角蛋白19片段抗体标记的碱性磷酸酶试剂；所述细胞角蛋白19片段抗体标记的磁微粒试剂中，细胞角蛋白19片段抗体标记的磁微粒的浓度为0.05‑1mg/ml；所述细胞角蛋白19片段抗体标记的碱性磷酸酶试剂中，细胞角蛋白19片段抗体标记的碱性磷酸酶浓度为0.05‑2μg/ml。本发明采用抗体直接标记磁微粒方式，有效避免内源性生物素对测试结果的干扰，提高试剂盒分析灵敏度及精密度。

说明书

技术领域

本发明属于体外检测技术领域，涉及一种磁微粒化学发光法测定细胞角蛋白19片段含量的试剂盒。

背景技术

细胞角蛋白19片段(CYFRA21-1)是一种主要用于肺癌辅助诊断的肿瘤标志物。尤其对非小细胞肺癌具有较高的诊断价值，对各类非小细胞肺癌的阳性检出率可达到70％-85％。当患者血清中CYFRA21-1的浓度超过30ng/mL且影像学检测显示肺部存在不清晰的环形阴影时，则诊断为原发性支气管肺癌的可能性较高。

血清中CYFRA21-1的浓度水平高低，通常与肿瘤的治疗效果及临床分期呈正相关，治疗成功的标志是血清CYFRA21-1的浓度迅速下降，反之则表示疾病的复发或病灶未完全清除，所以CYFRA21-1可作为肺癌患者手术治疗效果评价、预后复发监测的有效指标之一。

目前，非小细胞肺癌相关抗原CYFRA21-1的检测方法主要以电化学发光法和化学发光法免疫分析法为主，2种方法具有高敏感性、高特异性、高稳定性等优点，但是95％以上的市场份额都被国外品牌所占领，且试剂盒成本昂贵。因此，开发具有自主知识产权，评估并使用性能稳定、优良的国产CYFRA21-1化学发光法免疫分析试剂盒是打破国外品牌长期垄断局面的有效途径，能大大降低临床检验CYFRA21-的成本，降低医疗费用。

目前市场上电化学发光法的厂家主要为罗氏，其主要使用生物素-链霉亲和素系统，两株抗体分别标记生物素和三联吡啶钌，链霉亲和素包被磁性颗粒；直接发光厂家主要为雅培，采用抗体直接包被磁珠，另一株抗体标记吖啶酯的反应方式；国产试剂迈瑞，采用抗体直接标记磁性颗粒，另一株抗体标记碱性磷酸酶的方式；国产试剂万泰凯瑞采用直接发光法，两种抗体分别包被磁珠和吖啶酯。其他厂家多采用板式发光，标记物多采用抗体标记辣根过氧化物酶(HRP)的模式。管式发光较板式发光，操作更简便，反应时间更短，自动化更高，可以做单一测试，对成本节约优势明显。因此管式发光因其具有反应时间短，灵敏度高，精密性好，线性范围更宽等优势，被更多的应用在发光试剂的开发中。目前市面上使用磁性颗粒的厂家，生物素系统因无法消除人体内源性生物素造成的干扰，常会出现测试结果异常的情况；使用抗FITC抗体，多来源于羊抗或者鼠抗，标记后效价低，对试剂的灵敏度影响较大。采用抗体直包磁珠的方式，因不同方法的使用，抗体磁性颗粒连接物状态均不可很好的控制，多会出现磁性颗粒聚团难以分散，对测试结果有影响的情况。因此常会出现批间差较大，稳定性偏差，特异性需要进一步提高等问题。并且抗体的使用率普遍较低，生产成本很高。

发明内容

本发明针对现有技术中CYFRA21-1检测存在的缺陷，提供一种磁微粒化学发光法测定细胞角蛋白19片段含量的试剂盒，采用抗体直接标记磁微粒方式，有效避免内源性生物素对测试结果的干扰，提高试剂盒分析灵敏度及精密度。

本发明的提供了一种磁微粒化学发光法测定细胞角蛋白19片段含量的试剂盒，所述试剂盒包括细胞角蛋白19片段抗体标记的磁微粒试剂、细胞角蛋白19片段抗体标记的碱性磷酸酶试剂；所述细胞角蛋白19片段抗体标记的磁微粒试剂中，细胞角蛋白19片段抗体标记的磁微粒的浓度为0.05-1mg/ml；所述细胞角蛋白19片段抗体标记的碱性磷酸酶试剂中，细胞角蛋白19片段抗体标记的碱性磷酸酶浓度为0.05-2μg/ml。

所述细胞角蛋白19片段抗体优选为细胞角蛋白19片段单克隆抗体。

作为优选，所述细胞角蛋白19片段抗体标记的磁微粒试剂的制备方法包括以下步骤：磁微粒重悬后加入细胞角蛋白19片段抗体，再加入反应催化剂，在24-42℃下混悬反应4-24h，然后加入封闭剂于24-42℃条件下混悬反应6-24小时进行封闭，清洗后，加入磁微粒保存液重悬获得细胞角蛋白19片段抗体标记的磁微粒试剂。

磁微粒指的是磁性纳米粒子与有机分子或无机分子结合形成的可均匀分散于一定基液中具有高稳定性的胶态复合材料，磁微粒表面含有甲苯磺酰基、氨基、羧基、羟基、环氧乙烷等一种或多种活性功能基团。

作为优选，本发明采用的磁微粒为Fe

本发明的细胞角蛋白19片段抗体标记的磁微粒试剂的制备方法中，磁微粒与抗体反应的温度范围更广，可以在更高的温度下进行标记，而高温度可以有效提高抗体与磁微粒的结合效率。使用反应催化剂可以起到促进抗体与磁微粒上的基团加速反应的效果。标记过程中使用封闭剂可以将磁微粒上未结合位点进行填充，达到封闭的作用，在反应的时候，待测物不会直接与磁微粒进行反应，产生非特异吸附。

所述细胞角蛋白19片段抗体标记的磁微粒试剂的制备方法具体包括：磁微粒用pH5.0-9.5、0.05-0.3mol/L的缓冲液重悬，缓冲液可以为Hepes、MES、硼酸、磷酸盐缓冲液中的一种或多种，重悬后磁微粒的浓度为5-10mg/ml；加入细胞角蛋白19片段抗体，使得细胞角蛋白19片段抗体与磁微粒的质量比为(0.1-2)：100，混匀后，加入反应催化剂，反应催化剂可以为0.5-4mol/L的硫酸铵溶液，反应催化剂的加入体积量为磁微粒和细胞角蛋白19片段抗体总和的0.5-2倍，在24-42℃下混悬反应4-24h；然后加入封闭剂，按照每10mg磁性颗粒，加入0.05-0.25ml封闭剂，于24-42℃条件下混悬反应6-24小时；然后用缓冲液进行清洗，缓冲液可以为Tris缓冲液和硼酸溶液，加入0.05-2％Tween20、SDS、Tween80中的一种或多种，缓冲液加入体积为总体积的0.5-2倍，清洗2-5次；清洗后，加入磁微粒保存液重悬获得细胞角蛋白19片段抗体标记的磁微粒试剂备用，细胞角蛋白19片段抗体标记的磁微粒的浓度为5-10mg/ml；然后再用磁微粒保存液稀释细胞角蛋白19片段抗体标记的磁微粒试剂，使得细胞角蛋白19片段抗体标记的磁微粒的浓度为0.05-1mg/ml。

作为优选，细胞角蛋白19片段抗体标记的磁微粒试剂的制备方法中，采用的封闭剂为0.5-3wt％的牛血清蛋白溶液、0.5-3wt％的酪蛋白溶液、Blockmaster

进一步优选，细胞角蛋白19片段抗体标记的磁微粒试剂的制备方法中，采用的封闭剂为0.5-3wt％的酪蛋白溶液、Blockmaster

CE210中的PEG分子量为2000，CE510中的PEG分子量为5000，因磁微粒表面的位点大小不一，采用不同的分子量封闭剂混合使用，可以更有效的封闭磁性颗粒表面上暴露的所有位点。酪蛋白与CE210和CE510的混合使用，还可以提高磁微粒的分散稳定性，有利于试剂盒灵敏性、精密性和准确性提升。

作为优选，磁微粒保存液pH为6-9，包括：0.01-0.2mol/L Tris缓冲液，0.1-0.5mol氯化钠，0.1-10wt％的牛血清蛋白、酪蛋白、γ球蛋白(牛)中的一种或几种，1.0-5wt％Triton X-405，0.01-5wt％表面活性剂S9，0.5-5wt％的表面活性剂RPE1740、表面活性剂RPE2520的一种或两种，0.5-10wt％PEG2000、PEG4000、PEG6000、PEG8000、PEG10000、PEG20000中的一种或几种，0.5-10wt％葡聚糖，0.5-10wt％明胶，0.1-5.0wt％十六烷基三甲基溴化铵和/或月桂基三甲基溴化铵，0.05-5.0wt％Proclin系列防腐剂和/或叠氮钠。Proclin系列防腐剂包括Proclin 150、Proclin 200、Proclin 300、Proclin 5000中的一种或多种。

本发明磁微粒保存液中的Triton X-405、表面活性剂S9、表面活性剂RPE1740、表面活性剂RPE2520，可以有效降低磁微粒之间因电荷效应产生的团聚现象，且表面活性剂具有复性蛋白的作用，可以降低抗体的非特异性结合，提高特异性的识别能力。本发明磁微粒保存液中的PEG2000～20000中的一种或几种、葡聚糖、明胶(来源于猪或鱼皮中的一种或几种)可以显著提高试剂盒的特异性及精密性，对于相同工作浓度的磁微粒，加入上述物质，发光信号和精密度得到大大提升。本发明磁微粒保存液中的十六烷基三甲基溴化铵或月桂基三甲基溴化铵，可以有效降低磁微粒在清洗环节中产生的气泡，气泡可在5-10秒内快速消除，可有效避免因气泡造成清洗环节不彻底，磁微粒丢失，反应管壁被污染的情况，对结果的可靠性、精密性的提升效果显著。

作为优选，细胞角蛋白19片段抗体标记的碱性磷酸酶试剂的制备方法包括以下步骤：

S1、活化抗体：将细胞角蛋白19片段抗体过脱盐柱，用pH7.0-7.5、0.01-0.05mol/LHepes缓冲液洗脱浓缩至2-4mg/ml；加入二硫苏糖醇(DTT)或三(2-羰基乙基)磷盐酸盐(TCEP)，20-30℃下反应10-30min；加入pH7.0-7.4、0.5-2mol/L甘氨酸溶液，继续反应5-10min，过脱盐柱，用pH8.0-9.0、0.01-0.05mol/L Hepes缓冲液洗脱浓缩至2-4mg/ml，得活化的细胞角蛋白19片段抗体溶液；

S2、活化碱性磷酸酶：将碱性磷酸酶过脱盐柱，用pH7.0-7.5、0.01-0.05mol/LHepes缓冲液洗脱浓缩至2-4mg/ml；将LC-SMCC溶解于有机溶剂中，得5-8mg/ml的LC-SMCC溶液，有机溶剂为二甲基甲酰胺或二甲基亚砜，在洗脱液中加入LC-SMCC溶液，按碱性磷酸酶每毫克加入2.5-7.5μL LC-SMCC溶液，20-30℃下反应10-30min；加入pH 7.0-7.4、0.5-2mol/L的甘氨酸溶液，按碱性磷酸酶每毫克加入2.5～7.5μL甘氨酸溶液，继续反应10-20min，过脱盐柱，用pH8.0-9.0、0.01-0.05mol/L Hepes缓冲液洗脱浓缩至2-4mg/ml，得活化的碱性磷酸酶溶液；

S3、按细胞角蛋白19片段抗体和碱性磷酸酶质量比1：(0.5-2)将活化的细胞角蛋白19片段抗体溶液和活化的碱性磷酸酶溶液混合，加入0.1-0.5mol/L氯化镁溶液，每毫升反应体积加入1-5μL氯化镁溶液，2-8℃反应8-20h；

S4、将连接物纯化，如将连接物过superdex200分子筛柱，根据蛋白出峰情况，进行收集，纯化后用缓冲液为pH7.0-7.5、0.01-0.05mol/L Hepes稀释备用。

步骤S1和步骤S2采用的脱盐柱举例为PD-10脱盐柱，过脱盐柱以除盐，并更换缓冲液。

步骤S1中加入的DTT或TCEP为溶液形式，用pH8.0-9.00.01-0.05mol/L Hepes缓冲液溶解DTT溶液或TCEP溶液浓度为10-50mmol/L，按每毫克抗体质量加入0.5-2.5微升的体积量。步骤S1和S2中甘氨酸溶液的加入体积量同DTT溶液或TCEP溶液的加入体积量。

本发明采用的碱性磷酸酶优选为以下碱性磷酸酶、热敏碱性磷酸酶、小牛肠碱性磷酸酶中的一种或多种。

作为优选，所述试剂盒还包括抗体缓冲液，所述抗体缓冲液pH为7.0-9.0，包括牛血清蛋白、酪蛋白、海藻糖、阻断剂中的一种或几种。

作为优选，所述试剂盒还包括细胞角蛋白19片段系列校准品，所述细胞角蛋白19片段系列校准品为细胞角蛋白19片段用校准品缓冲液稀释到多个系列浓度而得。

作为优选，所述校准品缓冲液包括1-10g/L HEPES、20-60g/L牛血清蛋白、5-10g/L氯化钠、0.05-0.2ml 0.5-2mol/L的氯化镁溶液、0.05-0.2ml0.1-0.5mol/L的氯化锌溶液、1-4g/L防腐剂、水，调节缓冲液的pH为7.0-8.0。

作为优选，所述试剂盒还包括细胞角蛋白19片段质控品，细胞角蛋白19片段质控品为细胞角蛋白19片段用质控品稀释液稀释成及几种浓度而得。所述质控品稀释液包括：1-10g/L HEPES、20-60g/L牛血清蛋白、5-10g/L氯化钠、0.05-0.2ml 0.5-2mol/L的氯化镁溶液、0.05-0.2ml 0.1-0.5mol/L的氯化锌溶液、1-4g/L防腐剂、水，调节缓冲液的pH为7.0-8.0。

本发明提供的试剂盒检测细胞角蛋白19片段含量的检测方法，包括以下步骤：

将待测样本、细胞角蛋白19片段抗体标记的磁微粒试剂、细胞角蛋白19片段抗体标记的碱性磷酸酶试剂、抗体缓冲液混合，待测样本、细胞角蛋白19片段抗体标记的磁微粒试剂、细胞角蛋白19片段抗体标记的碱性磷酸酶试剂、抗体缓冲液的体积比为1：(2-5)：(2-5)：(2-5)，35-42℃下反应5-15min，形成夹心复合物磁性悬浮液；

将所述的夹心复合物磁性悬浮液置于磁场内，在磁场中沉降2-4min，去除上清液，然后用清洗液反复清洗磁性抗原-抗体复合物；

向洗涤后的磁性抗原-抗体复合物中加入化学发底物液，混悬2-5s，然后用发光检测仪进行检测。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明的细胞角蛋白19片段磁微粒化学发光检测试剂盒，采用抗体直包磁微粒的模式，较其他厂家采用生物素系统的模式，可以有效避免内源性生物素对检测结果的干扰，直包方式比标记生物素等，连接物效价更高，灵敏度提升明显；

(2)本发明采用抗体标记甲苯磺酰基磁微粒，并摸索出适合该体系的催化剂、封闭剂及磁微粒保存液，有效解决市面上采用的羧基磁珠标记抗体，抗体使用量大，连接物活性低，成本高等问题，有效提高抗体的使用率，提高试剂盒分析灵敏度并降低试剂成本；

(3)本发明采用0.5-3wt％的酪蛋白溶液、Blockmaster

(4)本发明采用特殊的磁微粒保存液，可以使标记后的磁微粒均匀分布，无明显聚团现象，使试剂的批间差异更小，检测结果更稳定，特异性更强；

(5)本发明的抗体标记碱性磷酸酶技术，采用DTT或TCEP，可实现定向打开抗体重链之间的二硫键，实现靶向标记，标记后抗体保持较好的特异性，线性范围及灵敏度均有更好的提升，同时定向标记可有效降低标记批次之间差异。

附图说明

图1为本发明实施例1中磁微粒试剂显微镜图；

图2为本发明对比例1中磁微粒试剂显微镜图；

图3为本发明对比例2中磁微粒试剂显微镜图。

具体实施方式

下面通过具体实施例及附图，对本发明的技术方案作进一步描述说明。如果无特殊说明，本发明的实施例中所采用的原料均为本领域常用的原料，实施例中所采用的方法，均为本领域的常规方法。

磁微粒：JSR Life Science株式会社生产MS160/TOSYl磁珠

CYFRA21-1抗体：Medix公司1604

Blockmaster

Blockmaster

葡聚糖：购自Sigma；31394

明胶：购自Sigma G7041

PD-10脱盐柱：GE货号17-0851-01

碱性磷酸酶：购自BBI Solutions，货号：ALPI2G；

LC-SMCC：Thermo 22362

Superdex200分子筛柱：GE公司28-9893-35。

实施例1

本实施例的测定细胞角蛋白19片段含量的试剂盒，包括细胞角蛋白19片段抗体标记的磁微粒试剂、细胞角蛋白19片段抗体标记的碱性磷酸酶试剂、抗体缓冲液和细胞角蛋白19片段系列校准品及质控品。

细胞角蛋白19片段抗体标记的磁微粒试剂的制备过程为：

将磁微粒用0.05mol/L、pH 8.0的硼酸缓冲液重悬，重悬后磁微粒的浓度为10mg/ml；加入细胞角蛋白19片段抗体，使得细胞角蛋白19片段抗体与磁微粒的质量比为0.5：100，混匀后，加入1mol/L硫酸铵溶液，硫酸铵溶液的加入体积量为磁微粒和细胞角蛋白19片段抗体总和的2倍，然后在37℃条件下混悬反应12小时；然后按照每10mg磁性颗粒，加入0.2ml封闭剂，于37℃条件下混悬反应12小时；用含0.2％Tween20的pH 7.4硼酸缓冲液进行清洗，加入体积为总反应体积的1倍，清洗3次；清洗后，加入磁微粒保存液重悬获得10mg/ml细胞角蛋白19片段抗体标记的磁微粒试剂备用；然后再用磁微粒保存液稀释细胞角蛋白19片段抗体标记的磁微粒试剂至浓度为0.5mg/ml。

其中，封闭剂为0.2wt％酪蛋白水溶液、Blockmaster

磁微粒保存液pH为8.0，包括0.2mol/L氯化钠、0.2wt％的牛血清蛋白、1.0wt％Triton X-405、0.05wt％表面活性剂S9、0.8wt％的表面活性剂RPE1740、1.0wt％PEG2000、0.5wt％PEG10000、1wt％葡聚糖、1wt％明胶、0.5wt％十六烷基三甲基溴化铵、0.1wt％Proclin 300的0.05mol/L Tris缓冲液。

细胞角蛋白19片段抗体标记的碱性磷酸酶试剂的制备方法为：

S1、活化抗体：将细胞角蛋白19片段抗体过PD-10脱盐柱，用pH7.30.01mol/LHepes缓冲液洗脱浓缩至3mg/ml；按每毫克抗体质量加入2.0微升的20mmol/L二硫苏糖醇溶液(用pH8.5的0.01mol/L Hepes缓冲液溶解)，25℃下反应20min；按每毫克抗体质量加入2.0微升的pH 7.3、1mol/L甘氨酸溶液，25℃下继续反应10min，过PD-10脱盐柱，用pH8.50.01mol/L Hepes缓冲液洗脱浓缩至3mg/ml，得活化的细胞角蛋白19片段抗体溶液；

S2、活化碱性磷酸酶：将碱性磷酸酶过PD-10脱盐柱，用pH7.30.01mol/L Hepes缓冲液洗脱浓缩至3mg/ml；将LC-SMCC溶解于DMF中，得6mg/ml的LC-SMCC溶液，在洗脱液中加入LC-SMCC溶液，按碱性磷酸酶每毫克加入2.5μL LC-SMCC溶液，25℃下反应20min；加入pH7.3、1mol/L的甘氨酸溶液，按碱性磷酸酶每毫克加入2.5μL甘氨酸溶液，25℃下继续反应10min，过PD-10脱盐柱，用pH8.5 0.01mol/L Hepes缓冲液洗脱浓缩至3mg/ml，得活化的碱性磷酸酶溶液；

S3、按细胞角蛋白19片段抗体和碱性磷酸酶质量比1：1将活化的细胞角蛋白19片段抗体溶液和活化的碱性磷酸酶溶液混合，加入0.2mol/L氯化镁溶液，每毫升反应液加入2μL氯化镁溶液，4℃反应18h；

S4、将连接物过superdex200分子筛柱，根据蛋白出峰情况，进行收集，然后加入缓冲液稀释至0.5μg/ml,缓冲液为pH7.4、0.02mol/L Hepes。

抗体缓冲液pH为8.0，包括5g/L的BSA、1g/L的酪蛋白、20g/L的海藻糖、5g/L的明胶、1ml/L ProClin 300的2.38g/L的Hepes缓冲液。

细胞角蛋白19片段系列校准品为细胞角蛋白19片段用校准品缓冲液稀释成0、0.5、5.0、50、500、1000ng/ml。细胞角蛋白19片段质控品为细胞角蛋白19片段用质控品缓冲液稀释成浓度为10、100ng/ml。所述校准品及质控品缓冲液pH为8.0，包括30g/L牛血清蛋白、6g/L氯化钠、0.1ml1mol/L的氯化镁溶液、0.1ml 0.1mol/L的氯化锌溶液、2g/L ProClin300的1-10g/L HEPES缓冲液。

实施例2

实施例2与实施例1的区别在于，实施例2的封闭剂为0.2wt％酪蛋白水溶液。

实施例3

实施例3与实施例1的区别在于，实施例3的封闭剂为Blockmaster

实施例4

实施例4与实施例1的区别在于，实施例4的封闭剂为Blockmaster

对比例1

对比例1与实施例1的区别在于，对比例1的磁微粒保存液pH为8.0，包括0.2mol/L氯化钠、0.2wt％的牛血清蛋白、1.0wt％Triton X-405、0.05wt％表面活性剂S9、0.8wt％的表面活性剂RPE1740、0.5wt％十六烷基三甲基溴化铵、0.1wt％Proclin 300的0.05mol/LTris缓冲液。

对比例2

对比例2与实施例1的区别在于，对比例2的磁微粒保存液pH为8.0，包括0.2mol/L氯化钠、0.2wt％的牛血清蛋白、1.0wt％Triton X-405、0.05wt％表面活性剂S9、0.8wt％的表面活性剂RPE1740、1.0wt％PEG2000、0.5wt％PEG10000、0.5wt％十六烷基三甲基溴化铵、0.1wt％Proclin 300的0.05mol/L Tris缓冲液。

对比例3

对比例3与实施例1的区别在于，对比例3的磁微粒保存液pH为8.0，包括0.2mol/L氯化钠、0.2wt％的牛血清蛋白、1.0wt％Triton X-405、0.05wt％表面活性剂S9、0.8wt％的表面活性剂RPE1740、1wt％葡聚糖、1wt％明胶、0.5wt％十六烷基三甲基溴化铵、0.1wt％Proclin 300的0.05mol/L Tris缓冲液。

对比例4

对比例4与实施例1的区别在于，对比例4的磁微粒保存液pH为8.0，包括0.2mol/L氯化钠、0.2wt％的牛血清蛋白、1.0wt％Triton X-405、0.05wt％表面活性剂S9、0.8wt％的表面活性剂RPE1740、1.0wt％PEG2000、0.5wt％PEG10000、1wt％明胶、0.5wt％十六烷基三甲基溴化铵、0.1wt％Proclin300的0.05mol/L Tris缓冲液。

对比例5

对比例5与实施例1的区别在于，对比例5的磁微粒保存液pH为8.0，包括0.2mol/L氯化钠、0.2wt％的牛血清蛋白、1.0wt％Triton X-405、1.0wt％PEG2000、0.5wt％PEG10000、1wt％葡聚糖、1wt％明胶、0.5wt％十六烷基三甲基溴化铵、0.1wt％Proclin 300的0.05mol/L Tris缓冲液。

试剂盒性能指标测定

1.1检测方法

将待测样本15μL、细胞角蛋白19片段抗体标记的磁微粒试剂50μL、细胞角蛋白19片段抗体标记的碱性磷酸酶试剂50μL、抗体缓冲液50μL混合，37℃下反应10min，形成夹心复合物磁性悬浮液；

将所述的夹心复合物磁性悬浮液置于磁场内，在磁场中沉降2min，去除上清液，然后用清洗液反复清洗磁性抗原-抗体复合物3次；

向洗涤后的磁性抗原-抗体复合物中加入100μL化学发底物液，混悬3s，然后用发光检测仪进行检测。根据待测样本的相对发光强度RLU，从标准曲线上折算出样本中细胞角蛋白19片段浓度。

1.2灵敏度

用零浓度校准品作为样本进行检测，用实施例1的试剂盒重复测定20次，得出20次测量结果的发光值(RLU)，见表1。计算其平均值(M)和标准差(SD)，得出M+2SD所对应的发光值，根据零浓度校准品与相邻校准品之间的浓度-RLU值结果进行两点回归拟合得出一次方程，将M+2SD发光值带入上述方程中，求出对应的浓度值，即为最低检测限。通过计算得出试剂盒灵敏度为0.012ng/ml，同时该试剂盒的线性范围为0-1000ng/ml。

表1

1.3磁微粒分散性

显微镜观察实施例1、对比例1-2的磁微粒试剂，观察结果如图1-3所示，图1为实施例1磁微粒试剂显微镜图，图2为对比例1磁微粒试剂显微镜图，图3为对比例2磁微粒试剂显微镜图，从图中可以看出，实施例1的磁微粒分散均匀，无团聚现象，而对比例1-2均有一定程度的团聚。

1.4精密性

1.4.1将实施例1的试剂盒进行精密性及批间差评估，分别测试2ng/ml和200ng/ml的血清样本，计算精密性，结果如表2所示。

表2

实施例1的试剂盒具有优异的批内差和批间差，均可以控制在2％以内。

1.4.2将实施例1-4以及对比例1-5的试剂盒分别测试细胞角蛋白19片段系列校准品，统计发光强度，并分别测试2ng/ml血清样本，每个样本测试10次，计算精密性，结果如表3所示。

表3

实施例1试剂盒的磁微粒具有优异的分散性，发光信号及精密性相对于实施例2-3及对比例1-5具有显著提升。

1.5稳定性

将实施例1-4以及对比例1-5的试剂盒置于37℃保存，分别在3天、7天、9天进行测试，稳定性结果如表4所示。

实施例1的试剂盒表现出优异的稳定性，37℃保存9天偏差保持在8％以内，对比例1-5试剂盒的磁微粒分散不均匀，在储存过程中容易团聚，导致稳定性变差。

本文中所述具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明，并不限定本发明的保护范围。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。