一种增生型糖尿病视网膜病变的大鼠模型构建方法

摘要

本发明属于糖尿病动物模型建模技术领域，具体涉及一种增生型糖尿病视网膜病变的ZDF大鼠模型构建方法。本发明提供的增生型糖尿病视网膜病变(PDR)建模方法为：对糖尿病肥胖大鼠进行高脂高糖饮食喂养，诱导高血糖形成和脂代谢异常，得到增生型糖尿病视网膜病变的大鼠模型。实验发现本发明方法可以成功建模得到的大鼠模型，得到的模型血糖明显升高、脂代谢异常、眼底血管造影FFA示视网膜新生血管、玻璃体混浊，OCT示视网膜内层变薄，病理示视网膜内层变薄，神经节细胞显著减少及外核层出现花环样缺失改变，且建模时间短，应用前景优良。

说明书

技术领域

本发明属于糖尿病动物模型建模技术领域，具体涉及一种增生型糖尿病视网膜病变的大鼠模型构建方法。

背景技术

糖尿病及其并发症在全球的患病率仍在持续上升，严重威胁人类健康。其中糖尿病视网膜病变(DR)是糖尿病最常见的眼部并发症，也是全球工作年龄段人群最重要的致盲疾病。由于DR发病机制仍未完全阐明，使得其防治仍然困难重重。根据病变的严重程度,DR分为非增生型DR(NPDR)和增生型DR(PDR)，前者以微血管病变为主，表现为微血管瘤、硬性渗出、棉绒斑、静脉扩张出血和视网膜内微血管异常；而视网膜的新生血管化则是PDR标志性特点。糖尿病性黄斑水肿作为引起视力丧失的主要原因，可发生在NPDR或PDR的任意阶段。

目前研究认为早期视网膜神经功能受损早于血管病变出现，因此DR应是一种神经血管性疾病。但是高血糖对视网膜作用的调控机制尚不完全清楚。早期对糖尿病患者进行DR的筛查和防治对阻止视力丧失至关重要。然而长期的高血糖亦可引起视网膜不可逆的病理改变，进而导致伴有视网膜新生血管以及黄斑水肿的PDR。随着对病因和发病机制研究的深入，DR的治疗效果也在逐步提高；但是由于医学伦理的限制，多数对DR在视网膜结构、功能及生化方面的研究不能直接以人作为研究对象。因此需要选择合适的动物疾病模型来指导今后的研究，通过模拟人DR的结构、功能及代谢特征来探索其发病机制和开发新型治疗以期阻止或者延缓DR进程。

相较于体外实验，体内动物模型更能够模拟人病变的生理病理过程及特点，因此需要建立和改进体内DR动物模型以及选择合适的动物模型来指导DR今后的研究。如何建立可靠的DR实验模型仍是目前DR研究的一个重点问题。近二十年来，动物模型已在糖尿病研究中广泛运用。迄今为止，很多物种，如小鼠、大鼠、犬、猪和非人灵长类已作为实验模型均为糖尿病及其并发症的细胞和分子机制研究提供了很多有价值的信息。通常使用腹腔内注射化学药物、手术切除胰腺、选择性饮食喂养以及基因工程技术来诱导动物性糖尿病模型。

可是由于DR发病机制复杂、病程长及临床病变多样性，目前没有任何动物模型可以重现人DR的所有表现。尤其是至今还未有能够模拟PDR病变特征的动物模型，这些都给建立DR动物模型带来了挑战。

最常见的啮齿类动物模型，主要是用于早期非增生性DR的模型构建，但是目前所报道糖尿病对视网膜的影响在不同品种，甚至相同品系之间都有很大差异。有研究比较了Sprague Dawley、Lewis和Wistar STZ诱导型糖尿病大鼠在DR早期病变的差异，结果显示在糖尿病8个月时，Lewis大鼠丧失了较多的视网膜毛细血管和神经节细胞，Wistar大鼠出现视网膜毛细血管的变性，但未见明显的神经细胞受损，而SD大鼠视网膜却未显示任何病。此外，由于啮齿动物寿命短，在能检测到PDR病变之前，这些糖尿病模型动物已经死亡，所以这类模型大多用于阐明DR早期病变，而无法用于研究PDR。

虽然很多研究尝试建立DR的晚期病变模型，但是仍无法复制出视网膜无灌注和新生血管等严重的DR病变。因此，一些非糖尿病动物模型常用来研究PDR。目前广泛用于研究视网膜新生血管化的PDR鼠类模型有以下几种：Kimba小鼠[基于光感受器细胞过表达血管内皮生长因子165(vascular endothelial growth factor 165，VEGF165)蛋白使视网膜出现新生血管化、血管渗漏增加、周细胞和内皮细胞损失、血管迂曲、白细胞淤滞等]、视网膜过表达IGF1的转基因小鼠(视网膜出现类似DR病变、包括周细胞损失、毛细血管基膜增厚、视网膜内微血管异常改变及新生血管形成)、氧诱导的DR、视网膜分支静脉阻塞模型。但上述模型经过基因编辑后与人PDR的病理生理过程差异较大，也会对研究结果产生一定影响。

因此，急需提供一种能够模拟人类糖尿病视网膜病变的模型的建立方法。

发明内容

针对增生型糖尿病视网膜病变(PDR)动物模型建立的困难，本发明提供一种增生型糖尿病视网膜病变的大鼠模型构建方法，其目的在于：建立一种动物模型，能够模拟DR的自然病程及PDR的相应表型，从而在相对短期内得到PDR的动物疾病模型。

一种增生型糖尿病视网膜病变的大鼠模型构建方法，对糖尿病肥胖大鼠进行高脂高糖饮食喂养，得到增生型糖尿病视网膜病变的大鼠模型。

优选的，所述糖尿病肥胖大鼠为Zucker Diabetic Fatty rat。

优选的，所述糖尿病肥胖大鼠为5-6周龄。

优选的，所述糖尿病肥胖大鼠进行喂养前体重为120.3-135.9g。

优选的，所述高脂高糖饮食由如下质量分数的成分构成：蛋白质25-27％，脂肪15-17％，碳水化物55-57％。

优选的，所述高脂高糖饮食由如下质量分数的成分构成：蛋白质26.85％，脂肪16.71％，碳水化物56.44％。

优选的，所述高脂高糖饮食为Purina5008饲料。Purina5008饲料是一种市售高脂高糖饲料，由如下质量分数的成分构成：蛋白质26.85％，脂肪16.71％，碳水化物56.44％。

优选的，所述高脂高糖饮食喂养的时间为2-6个月。

优选的，所述高脂高糖饮食喂养的时间为5-6个月。

本发明还提供一种增生型糖尿病视网膜病变药物的筛选方法，它是采用上述模型构建方法得到的增生型糖尿病视网膜病变的大鼠模型为动物模型，进行药物筛选。

本发明中，所述“糖尿病肥胖大鼠”是指是在肥胖型大鼠中发现的，由于基因缺陷容易被诱导糖尿病的大鼠。

由于DR病因复杂、病程长及临床病变多样，目前还没有任何动物模型可以重现人DR所有表型；尤其至今还未有能够模拟PDR特征的体内动物模型。这些都给建立晚期DR动物模型带来了挑战。

本发明方法构建的ZDF大鼠模型能够模拟DR的自然病程及增生性DR(PDR)的相应表型，即：眼底血管造影FFA示视网膜新生血管、玻璃体混浊，OCT示视网膜内层变薄，病理示视网膜内层变薄，神经节细胞显著减少及外核层出现花环样缺失改变。而本发明的方法诱导ZDF大鼠出现2型糖尿病后，成功诱导视网膜出现了病理性新生血管的增殖性改变，符合PDR的表型特征。因此，本发明可在相对短期内得到PDR的体内动物疾病模型。并且本发明方法成本低，可重复性良好。我们建立的PDR体内模型能为这类疾病的药效学和病理机制研究提供一个强有力的工具，应用前景广泛。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为实验组(ZDF)和对照组(CON)的体重在喂养期间的变化趋势；

图2为实验组(ZDF)和对照组(CON)血糖值在喂养期间的变化趋势；

图3为实验组(ZDF)和对照组(CON)的血清总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)在喂养期间的变化趋势；

图4为实验组(ZDF)和对照组(CON)在适应期和喂养第五个月后的炫彩照(Multicolor)和FFA结果；

图5为实验组(ZDF)和对照组(CON)建模后的OCT检查结果；

图6为实验组(ZDF)和对照组(CON)建模后的免疫荧光染色结果(标尺＝100μm)；

图7为实验组(ZDF)和对照组(CON)建模后的全视网膜铺片染色的显微镜采图(标尺＝100μm)及经节细胞计数结果。

其中，Pre test是指适应期。

具体实施方式

以下实施例中，所用的雄性肥胖型ZDF大鼠和雄性Zucker瘦型大鼠购于维通利华实验动物技术有限公司，Purina5008饲料购于北京科澳协力饲料有限公司。

实施例1增生型糖尿病视网膜病变的ZDF大鼠模型构建

建模方法：选择5-6周龄，体重128.1±7.8g的雄性肥胖型ZDF大鼠(ZuckerDiabetic Fatty rat)15只，适应期1-2周，在实验环境下用普通维持饲料喂养，使动物在正式实验前适应环境。进入模型期后，用Purina5008饲料喂养2-6月，即得。其中，Purina5008饲料配方中主要营养成分的质量百分数为：蛋白质26.85％，脂肪16.71％，碳水化物56.44％。

对比例1

建模方法：选择5-6周龄，体重115.5±5.6g的雄性Zucker瘦型大鼠15只，适应期1-2周，在实验环境下用普通维持饲料喂养，使动物在正式实验前适应环境。进入模型期后，用Purina5008饲料喂养2-6月，即得。其中，Purina5008饲料配方中主要营养成分的质量百分数为：蛋白质26.85％，脂肪16.71％，碳水化物56.44％。

实验例1

1、试剂、仪器和器械：

实验所用抗体列表：

表1

实验所用仪器

表2

实验所用主要计算机软件或数据系统

表3

2、检测方法

本实验例中，将实施例1建模的ZDF大鼠模型记为实验组(ZDF)，将对比例1建模的Zucker瘦型大鼠模型记为对照组(CON)。

1)体重

测定动物：各组所有存活大鼠；

测定时间：1次/周；

2)血糖(GLU)

测定动物：各组所有存活大鼠；

测定时间：适应期期间检测1次，模型期1次/周；

测定方法：采样检测前禁食至少8小时，不禁水。自尾静脉穿刺取血10微升，罗氏血糖仪(卓越型))虹吸芯片吸取检测(大鼠血糖超过仪器检测上限，则以血糖最高检测值33.3mol/L为标准进行分析，下同)。以空腹血浆血糖(FPC：Fasting Plasma Glucose)≥7.0mmol/L或口服糖耐量试验(OGTT：Oral G lucose Tolerance Test)2小时血浆葡萄糖≥11.1mmol/L诊断为糖尿病。

3)血液生化(总胆固醇TC、甘油三酯TG)

测定动物：各组所有存活大鼠；

测定时间：1次/月；

测定方法：采样前至少禁食8小时，不禁水，自大鼠颈静脉采血0.8mL，不抗凝；

样本处理：血液样本(不抗凝)15～25℃离心10分钟，分离血清检验。上述样本15～25℃存放，24小时内完成检测；2～8℃存放，3天内完成检测。总胆固醇(TC)≥5.2mmol/L和\或甘油三酯(TG)≥1.7mmol\L诊断为血脂异常。

4)葡萄糖耐量试验(OGTT)

测定动物：所有存活大鼠；

测定时间：高糖高脂饲喂养结束后检测

测定方法：采样前至少禁食8小时，不禁水，每只大鼠以2g/kg剂量，按10mL/kg灌服20％葡萄糖溶液后120分钟，自大鼠颈静脉采血0.8mL，进行检测。

5)眼科检查

检测时间：建模前及建模后1次/月；

检测项目：眼底炫彩照相(multicolor)，荧光素血管造影(FFA)，光学相干断层扫描(OCT)。

6)全视网膜铺片免疫荧光染色

取各组大鼠视网膜进行4％多聚甲醛固定、抗原封闭、全视网膜一抗染色(Brn3a)、二抗染色、铺片与封片、荧光显微镜及激光共聚焦显微镜采图

7)显微镜采图及神经节细胞计数

摘除各组大鼠眼球，沿角巩膜缘穿刺一小口，置于改良的Davidson′s固定液中4度过夜固定用于石蜡切片制备。将各组切片进行苏木精-伊红染色及及其它免疫荧光染色(相关抗体见表1)，并行显微镜检查和计数分析。

图像采集：切片和铺片使用荧光显微镜和激光共聚焦显微镜进行扫描，观察视网膜各指标染色情况及各层次的血管形态并拍照。

结果评价：运用ImageJ15.0b软件(https://imagej.nih.gov/ij/)对染色阳性细胞进行手动计数。计数范围为细胞染色铺片，每组至少3个视网膜样本，每个视网膜至少3个相同面积的不同区域(150um×150um)进行计数，所有纳入计数的图像均为显微镜(物镜20×放大倍率)拍摄。

3、结果分析

1)体重

图1给出了实验组(ZDF)和对照组(CON)体重值在喂养期间的变化趋势。从图中可以看到，实验组体重于喂养1月左右开始较对照组增高

2)血糖(GLU)

图2给出了实验组(ZDF)和对照组(CON)血糖值在喂养期间的变化趋势。从图中可以看到，实验组血糖值于喂养30天左右开始升高，第180天血糖及OGTT的AUC值明显高于对照组(*，P<0.05)。

3)血液生化(总胆固醇TC、甘油三酯TG)

图3给出了实验组(ZDF)和对照组(CON)的血清总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)在喂养期间的变化趋势。从图中可以看到，实验组血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)于高脂高糖饮食喂养60天起开始明显较对照组升高，并一直持续到喂养6个月。

4)眼科检查

图4给出了实验组(ZDF)和对照组(CON)在适应期和喂养第五个月后的炫彩照(Multicolor)和FFA结果。从图中可以看出，对照组玻璃体和视网膜正常；而实验组的炫彩照显示实验组玻璃体混浊，FFA显示造影晚期视网膜周边有无血管区及多处新生血管样荧光渗漏区(箭头处)。

图5给出了实验组(ZDF)和对照组(CON)建模后的OCT检查结果，从图中可以看出，实验组的RPE及OPL(外丛状层)出现间断不连续，局部视网膜脱离(箭头处)，视网膜较对照组变薄。

5)全视网膜铺片免疫荧光染色

图6给出了实验组(ZDF)和对照组(CON)建模后的免疫荧光染色结果(标尺＝100μm)，从图中可以看出，实验组视网膜全层变薄，尤其视网膜内层(内核层至神经节细胞层)变薄明显(黄色箭头示)，外核层细胞排列紊乱出现花环样缺失(蓝色箭头示)，RPE出现中断，形态不规则(红色箭头示)。

6)显微镜采图及神经节细胞(RGC)计数

图7给出了实验组(ZDF)和对照组(CON)建模后的全视网膜铺片染色的显微镜采图(标尺＝100μm)及经节细胞计数结果，从图中可以看出，实验组的神经节细胞(显微镜采图中为Brn3a，绿色)明显减少(*，P<0.05；单因素方差分析及Bonferroni检验)。

综上所述，实验结果证明，本发明方法制备得到的模型血糖明显升高、脂代谢异常、眼底血管造影FFA示视网膜新生血管、玻璃体混浊，OCT示视网膜内层变薄，病理示视网膜内层变薄，神经节细胞显著减少及外核层出现花环样缺失改变，证明本发明增生型糖尿病视网膜病变的大鼠模型建模成功。通过实验例1中实验组和对照组建模结果的对比可以知道，对于Zucker瘦型大鼠，即使采用与本发明方法相同的建模过程，也无法得到PDR的体内动物疾病模型。

上述实施例和实验例证明了本发明的方法可在相对短期内得到PDR的体内动物疾病模型。