一种基于尿液外泌体PLA2R检测IMN的方法、试剂盒及其应用

摘要

本发明公开一种基于尿液外泌体PLA2R检测IMN的方法、试剂盒及其应用,检测IMN的方法包括以下步骤：采集受试者的生物样品进行分离，得到待测样品；所述待测样品是尿液经差速离心和超速离心得到的尿液外泌体；尿液外泌体的鉴定，采用透射电镜及粒径分析观察尿液外泌体的形态及粒径分布；检测待测样品中PLA2R的表达水平，基于免疫反应和酶促反应，检测尿液外泌体中的PLA2R。本发明检测IMN的方法无创、特异、高效、快捷地对IMN进行有效评估，可作为是否需要进行肾活检的依据，减少肾活检这一有创检查的实施率，适用于有肾活检禁忌症的患者；适用于IMN患者的病情监测及疗效评价，推动IMN的诊治进展。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体是一种基于尿液外泌体PLA2R检测IMN的方法、试剂盒及其应用。

背景技术

膜性肾病(MN)是一种累及肾小球的非炎性自身免疫性疾病，是继IgA肾病之后最常见的肾小球疾病病理类型。约70％-80％的MN患者无法找到明确的病因，称为特发性MN(IMN)；20％左右的MN与其他疾病或危险因素暴露有关，称为继发性MN(SMN)。IMN是成人肾病综合征的首要病因，约占20％-37％，40％左右的IMN患者将在10年内进展为终末期肾病。

目前肾活组织病理检查依然是诊断IMN的金标准。然而，肾活检为有创性检查，有活动性出血等严重并发症。因此，急需开发新型无创诊断技术。2009年，Beck等人发现M型磷脂酶A2受体(PLA2R)是IMN中主要的足细胞抗原。随后的研究证实，血清PLA2R抗体在IMN中的阳性率为52％-86％。

在正常和非IMN病变的肾小球中，PLA2R仅在足细胞中微弱表达，而在IMN患者中，PLA2R的表达水平显著增加。多个研究发现，IMN中肾小球原位PLA2R的阳性率大于血清PLA2R抗体，部分血清PLA2R抗体阴性的患者亦可在肾组织中发现PLA2R的沉积。说明肾脏足细胞PLA2R阳性是优选的IMN标志物，启示我们寻找与肾组织PLA2R表达一致性更好的无创生物标志物和诊断方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于尿液外泌体PLA2R检测IMN的方法、试剂盒及其应用,检测IMN的方法无创、特异、高效、快捷地对IMN进行有效评估，可作为是否需要进行肾活检的依据，减少肾活检这一有创检查的实施率，适用于有肾活检禁忌症的患者；检测IMN的方法适用于IMN患者的病情监测及疗效评价，推动IMN的诊治进展。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种基于尿液外泌体PLA2R检测IMN的方法，检测IMN的方法包括以下步骤：

S1：从健康对照、IMN患者和非IMN患者的晨尿中分别获得尿液外泌体；

尿液外泌体通过晨尿经多次离心后获得；

S2：尿液外泌体的鉴定

鉴定所制备的尿液外泌体是否符合外泌体的形态、粒径特征；

S3：制备相同上样量的尿液外泌体蛋白样品

S4：采用免疫印迹法检测尿液外泌体的PLA2R蛋白

S5：结果判定：以正常对照免疫印迹灰度值的最高值为截断值，超过截断值的指示为IMN。

进一步的，所述S1中获得尿液外泌体具体包括以下步骤：将受试者晨尿第一次经2000g离心20min去除脱落细胞及碎片，所获上清第二次经13500g离心30min去除微粒，所获上清经200000g超速离心2h，得到的半透明沉淀物即为尿液外泌体。

进一步的，所述S2中尿液外泌体的形态采用透射电镜观察，具体包括以下步骤：

S21：吸取5ul尿液外泌体与5ul 4％的戊二醛混合固定20min；

S22：滴加到200目的载样铜网上，室温静置10min，用滤纸洗掉多余液体；

S23：用2％磷钨酸5ul染色5min，用滤纸洗掉多余液体；

S24：干燥后于透射电镜下成像拍照。

进一步的，所述S2中尿液外泌体的粒径分布采用纳米颗粒跟踪分析仪测定。

进一步的，所述S3中制备相同上样量的尿液外泌体蛋白样品具体包括以下步骤：用蛋白裂解液在冰上裂解外泌体30min，12000g离心30min，将所获上层清液移至干净1.5mlEp管内，采用BCA法测定蛋白浓度；根据蛋白浓度，用裂解液稀释，加入上样缓冲液，配置成20μl体积、1μg/μl浓度的蛋白样品，充分混匀，100℃煮沸5min，冷却至室温后，样品制备成功。

进一步的，所述S4中采用免疫印迹法检测尿液外泌体PLA2R蛋白，具体步骤包括：进行SDS-PAGE电泳；将胶上的蛋白转移至PVDF膜上；5％BSA封闭1h；然后予试剂盒中的抗体室温孵育2h；TBS-T洗膜三次，每次10min；剂盒中的抗兔二抗室温孵育1h；TBS-T洗膜三次，每次10min；采用ECL化学发光液显影，以Tanon曝光机定时曝光30s所得条带为灰度值测定条带；采用image J测定目的条带灰度值。

一种基于尿液外泌体PLA2R检测IMN的试剂盒，所述试剂盒中的抗体为：针对尿液外泌体PLA2R的特异性抗体；试剂盒中的抗兔二抗为：针对PLA2R特异性抗体的二抗。

一种基于尿液外泌体PLA2R检测IMN的试剂盒的应用，所述试剂盒的应用包括以下步骤：

S10：在第一时间点测定IMN患者的尿液外泌体中PLA2R的水平；

S20：在第二时间点测定所述IMN患者的尿液外泌体中PLA2R的水平，第二时间点晚于第一时间点；

S30：比较两个时间点尿液外泌体PLA2R水平，与第一时间点相比，第二时间点尿液外泌体PLA2R水平下降表明治疗有效，水平不变或增加表明治疗无效。

本发明的有益效果：

1、本发明检测IMN的方法无创、特异、高效、快捷地对IMN进行有效评估，可作为是否需要进行肾活检的依据，减少肾活检这一有创检查的实施率，适用于有肾活检禁忌症的患者；

2、本发明检测IMN的方法适用于IMN患者的病情监测及疗效评价，推动IMN的诊治进展。

附图说明

下面结合附图对本发明作进一步的说明。

图1是本发明尿液外泌体提取示意图；

图2是本发明透射电镜观察尿液外泌体形态示意图；

图3是本发明尿液外泌体的粒径分布图；

图4是本发明western blot检测部分正常对照与IMN患者尿液外泌体PLA2R展示图；

图5是本发明western blot检测部分IMN与非IMN患者尿液外泌体PLA2R展示图；

图6是本发明正常对照、非IMN及IMN患者尿液外泌体PLA2R灰度值分析示意图；

图7是本发明高效液相色谱联合质谱鉴定尿液外泌体PLA2R特异肽段示意图；

图8是本发明17例IMN患者治疗前后尿液外泌体PLA2R与24小时尿蛋白定量的相关性分析图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种基于尿液外泌体PLA2R检测IMN的方法,检测IMN的方法包括以下步骤：

S1：采集受试者的生物样品进行分离，得到待测样品；

生物样品为25ml晨尿；所述待测样品是尿液经差速离心和超速离心得到的尿液外泌体。

将25ml晨尿经一次离心(2000g离心20min)去除脱落细胞及碎片，一次离心的上清经二次离心(13500g离心30min)去除微粒，二次离心的上清经三次离心(200000g超速离心2h)，得到的半透明沉淀物即为尿液外泌体，如图1所示。

S2:尿液外泌体的鉴定

采用透射电镜观察尿液外泌体的形态，具体的鉴定方法包括：

S21：吸取5ul尿液外泌体与5ul4％的戊二醛混合固定20min；

S22：滴加到200目的载样铜网上，室温静置10min，用滤纸洗掉多余液体；

S23：用2％磷钨酸5ul染色5min，用滤纸洗掉多余液体；

S24：干燥后于透射电镜下成像拍照。

成像拍照结果如图2所示，直径约100nm的类圆形双层膜结构，证明所制备的尿液外泌体符合外泌体的形态特征。

采用PMX纳米颗粒跟踪分析仪Zetaview检测粒径分布，结果如图3所示，尿液外泌体的平均直径为138.0nm。

S3:检测待测样品中PLA2R的表达水平

基于免疫反应和酶促反应，检测尿液外泌体中的PLA2R，具体包括以下步骤：

S31：制备尿液外泌体蛋白样品：用适量蛋白裂解液裂解尿液外泌体，采用BCA法测定蛋白浓度，制备相同上样量的蛋白样品；

用适量蛋白裂解液在冰上裂解外泌体30min，12000g离心30min，转移上层清液至干净1.5ml Ep管内；采用BCA法测定样品蛋白浓度；

根据蛋白浓度，用裂解液稀释，加入适量的上样缓冲液，配置成相同体积(20ul)、相同浓度(1ug/ul)的蛋白样品，充分混匀，100℃煮沸5min，冷却至室温；

S32：采用western blot(免疫印迹)法，如图4、图5所示，使用试剂盒检测PLA2R蛋白；

进行SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶)电泳；将胶上的蛋白转移至PVDF(聚偏二氟乙烯)膜上；5％BSA(牛血清白蛋白)封闭1h；然后予试剂盒中的PLA2R特异性抗体(ATLASANTIBODIES，HPA012657,1:1000)室温孵育2h；TBS-T(缓冲溶液)洗膜三次，每次10min；试剂盒中的抗兔二抗(CST，7074,1:3000)室温孵育1h；TBS-T洗膜三次，每次10min；采用ECL(化学发光法辣根过氧化物酶(HRP)底物)化学发光液显影，以Tanon曝光机定时曝光30s所得条带为灰度值测定条带，如图6所示；采用image J测定目的条带灰度值。

S33：结果判定：以正常对照灰度值的最高值为截断值，超过截断值的定义为阳性；小于或等于截断值的定义为阴性。

S34：分析尿液外泌体PLA2R的灰度值与IMN的相关性。

通过对20例健康对照、62例IMN患者、18例非IMN患者的尿液外泌体PLA2R进行western blot检测及结果判读，结果见图6、表1所示；非IMN患者包括局灶性节段性肾小球硬化FSGS、糖尿病肾病DN、狼疮性肾炎LN和IgA肾病IgAN；如图6所示，IMN患者的尿液外泌体PLA2R灰度值明显高于正常对照和非IMN患者；如表1所示，尿液PLA2R诊断IMN的敏感度为91.9％，特异度为66.7％，诊断准确率为86.25％。

表1

对其中3例患者的尿液外泌体进行高效液相色谱-质谱联合分析，结果显示外泌体中均存在PLA2R蛋白，其特异片段如图7所示。

实施例2

基于尿液外泌体PLA2R检测IMN的试剂盒的应用。

在62例IMN患者中，收集到17例患者治疗前后的尿液样本及24h尿蛋白定量结果，western blot检测的尿液外泌体PLA2R灰度值与治疗前后24h尿蛋白定量的相关性分析，如图8所示。结果显示，17例患者中，16例患者的尿液外泌体PLA2R灰度值与24h尿蛋白定量的变化趋势一致。说明尿液外泌体PLA2R可作为有效的疗效评价指标。当尿液外泌体PLA2R下降时，患者疾病好转。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。