同时测试透析器清除率模拟液中肌酐和VB12浓度的双波长紫外分光光度法

摘要

本发明公开了一种同时测试透析器清除率模拟液中肌酐和VB12浓度的双波长紫外分光光度法：(1)配制VB12标准溶液，在232nm和361nm波长下测定吸光度，得线性方程yVB12‑232和yVB12‑361；(2)配制肌酐标准溶液，在232nm波长下测定吸光度，得线性方程y肌酐‑232；(3)测定模拟液吸光度A361混，作为A361‑VB12代入yVB12‑361计算xVB12，根据xVB12利用yVB12‑232计算出VB12在232nm波长下的吸光度值A232‑VB12；测得A232混，计算模拟液中肌酐A232‑肌酐＝A232混‑A232‑VB12，利用y肌酐‑232计算出肌酐浓度x肌酐。

说明书

技术领域

本发明涉及生化检测技术领域，具体涉及一种同时测试透析器清除率模拟液中肌酐和 VB12浓度的双波长紫外分光光度法。

背景技术

在体外循环测试透析器性能的过程中，通常采用配置一定浓度的毒素模拟液代替血液进行体外循环测试，计算其清除率，作为透析器对毒素清除能力的指标。模拟液是含有尿素、肌酐、磷酸盐和维生素B12的混合水溶液，为了计算透析器的清除率，需要测试透析前后模拟液中的物质浓度。目前，模拟液中的物质是分开检测的，肌酐单独采用生化仪酶联免疫法检测，在这样分开检测的情况下，步骤繁琐，需要的仪器昂贵、试剂多费用大，检测时间长。

发明内容

本发明的目的是针对上述问题，提供一种同时测试透析器清除率模拟液中肌酐和VB12 浓度的双波长紫外分光光度法。

本发明为了实现其目的，采用的技术方案是：

一种同时测试透析器清除率模拟液中肌酐和VB12浓度的双波长紫外分光光度法，包括如下步骤：

(1)绘制VB12标准曲线：配制VB12标准溶液，利用紫外分光光度计分别在232nm和361nm波长下测定吸光度，分别得到VB12分别在232nm和361nm处的线性方程y

(2)绘制肌酐标准曲线：配制肌酐标准溶液，利用紫外分光光度计在232nm波长下测定吸光度，得到肌酐在232nm处的线性方程y

(3)测定待测模拟液在361nm的吸光度A

所述待测模拟液中VB12浓度为2.50μmol/L—40.00μmol/L，肌酐浓度为 15.62μmol/L—250.00μmol/L。

在上述技术方案中，

VB12在361nm处的线性方程y

VB12在232nm处的线性方程y

肌酐在232nm处的线性方程y

所述步骤(3)的具体计算步骤为：

通过紫外分光光度计测得A

通过紫外分光光度计测得A

作为优选地，

所述b

所述b

所述b

本发明的有益效果是：创新性地采用双波长法同时测试透析器清除率模拟液中肌酐和 VB12浓度的方法，通过了方法学验证，证实本发明方法是科学有效的，采用此方法能节约设备投入，采用常用的紫外分光光度计即可，不需额外的试剂，检测时间短，检测精度和准确度高。

附图说明

图1是测试溶液用紫外分光光度计测得的重叠光谱图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

试剂来源如下：

实验仪器：紫外-可见光分光光度计：岛津UV-1900。

实施例1

一、溶液制备

肌酐储备液：精确称取0.1131g肌酐，纯水稀释定容至100mL。

10％NaOH溶液：称取5g氢氧化钠，用45g纯水溶解。

磷酸盐储备液：精确称取0.6805g磷酸二氢钾，用50mL纯水溶解，加入1.6mL10％NaOH 溶液稀释定容至100mL。

尿素储备液：精确称取2.1021g尿素，纯水稀释定容至100mL。

维生素储备液：精确称取0.0542g维生素B12，纯水稀释定容至100mL，避光储存备用。

肌酐标准液(肌酐浓度1000.00μmol/L)：取10mL肌酐储备液，稀释定容至100mL。

维生素标准液：取10mLVB12储备液，稀释定容至100mL，避光储存备用。

尿素标准液：取10mL尿素储备液，稀释定容至100mL。

磷酸盐标准液：取10mL磷酸盐储备液，稀释定容至100mL。

混合标准液：各取10mL肌酐、维生素B12、尿素和磷酸盐储备液，混合稀释定容至100mL。

二、专属性测试

(1)测试方法：

①稀释肌酐标准液、维生素B12标准液、尿素标准液、磷酸盐标准液和混合标准液至原浓度1/4，在190nm～800nm波长范围内，以纯水扫描基线，扫描5种溶液的光谱。

②稀释肌酐标准液、维生素B12标准液、尿素标准液、磷酸盐标准液和混合标准液至原浓度1/4，以纯水调零，分别测试5种溶液在232nm和361nm波长下吸光度的值。

③配制5组溶液，5组溶液的编号依次为1组、2组、3组、4组、5组，每组溶液中含有3种溶液：溶液1、溶液2、溶液3，溶液1中含有VB12，溶液2中含有肌酐，溶液3中含有VB12和肌酐。每种溶液中物质浓度如表1所示，分别测试其在232nm波长下的吸光度。

表1

(2)测试结果：

①重叠光谱图如图1所示。

②在232nm和361nm波长下吸光度的值,具体数据见表2。

表2

③溶液在232nm波长下的吸光度值，具体数据见表3。

表3

结果显示在232nm波长下，肌酐和维生素B12都有吸收，且混合液在该波长下的吸收等于肌酐和维生素B12吸收之和；而维生素B12在232nm波长下的吸光度值在浓度 2.50μmol/L—40.00μmol/L范围成线性，且在361nm波长下只有维生素B12有吸收，混合液中的尿素和磷酸盐在232nm和361nm波长下均不影响肌酐和维生素B12的吸收，那么可以通过在361nm波长下测得维生素B12浓度，计算出维生素B12在232nm波长下的吸光度，用混合液在232nm的吸光度减去维生素B12在232nm波长下的吸光度，即为肌酐在232nm下的吸光度。

三、线性范围

(1)肌酐曲线

测试方法：吸取肌酐样液(肌酐浓度1000μmol/L)，分别稀释成15.62μmol/L，31.25μmol/L， 62.50μmol/L，125.00μmol/L，250.00μmol/L，5个浓度系列的溶液，在232nm波长下测定其吸光度值。

测试结果如下表，具体数据见表4。

表4

结果显示肌酐在232nm波长下的吸光度值在浓度15.62μmol/L—250.00μmol/L范围内线性良好。

(2)VB12曲线

测试方法：吸取维生素B12标准液(维生素B12浓度40.00μmol/L)，分别配制成2.50μmol/L，5.00μmol/L，10.00μmol/L，20.00μmol/L，40.00μmol/L，5个浓度系列的溶液，以纯水调零，在232nm和361nm波长下测定其吸光度值。

测试结果如表5所示：

表5

结果显示维生素B12在232nm和361nm波长下的吸光度值在浓度 2.50μmol/L—40.00μmol/L范围内线性良好。

四、精密度测试

(1)重复性

测试方法：由同一分析人员取肌酐标准液和维生素B12标准液，配制维生素B12浓度为 10.00μmol/L、肌酐浓度分别为31.25μmol/L、62.50μmol/L和125.00μmol/L的三种混合溶液，以纯水调零，测试其在232nm和361nm波长下吸光度的值并用本发明方法计算其肌酐浓度。

测试结果如表6所示：

表6

结果显示同一分析人员测定所得结果的精密度RSD最高为1.00％，小于2％，符合要求。

(2)中间精密度

测试方法：分别由两名分析人员用肌酐标准液和维生素B12标准液配制维生素B12浓度为10.00μmol/L、肌酐浓度为62.50μmol/L的混合溶液各3份，使用相同仪器，以纯水调零，测试其在232nm和361nm波长下的吸光度的值并计算其肌酐浓度。

测试结果如表7所示：

表7

结果显示两名分析人员测定所得结果的中间精密度RSD为1.57％，小于2.00％，符合要求。

五、准确度

测试方法：以回收率表示，用肌酐标准液和维生素B12标准液配制3份维生素B12浓度为5.00μmol/L、肌酐浓度为125.00μmol/L的混合溶液，再配制肌酐浓度分别为100.00μmol/L、 125.00μmol/L和150.00μmol/L各一份分别与前混合溶液等体积混合。

测试结果如表8所示：

表8

结果显示添加肌酐浓度80％、100％和120％的样品，回收率在95.96％—103.70％之间，满足回收率要求95.00％—105.00％之间。

综合前面所有实验，通过验证，混合液在232nm波长下的吸光度值为肌酐和维生素B12 之和，维生素B12在232nm的吸光度值与浓度成正比，肌酐在232nm的吸光度值也与浓度成正比，且混合液在361nm波长下只有维生素B12有吸收。因此可通过在361nm波长下测得维生素B12浓度，计算出维生素B12在232nm波长下的吸光度，用模拟液在232nm的吸光度减去VB12在232nm波长下的吸光度，得到肌酐在232nm下的吸光度，便可计算出模拟液中肌酐浓度。该方法在肌酐浓度为15.62μmol/L—250.00μmol/L范围内线性良好，相关系数 R

实施例2

同时测试透析器清除率模拟液中肌酐和VB12浓度的双波长紫外分光光度法，按照如下步骤操作：

(1)按照实施例1中的方法绘制VB12标准曲线：配制VB12标准溶液，利用紫外分光光度计分别在232nm和361nm波长下测定吸光度，得到VB12分别在232nm和361nm处的线性方程y

(2)按照实施例1中的方法绘制肌酐标准曲线：配制肌酐标准溶液，利用紫外分光光度计在 232nm波长下测定吸光度，得到肌酐在232nm处的线性方程y

(3)利用紫外分光光度计测定待测模拟液在361nm的吸光度A

具体计算步骤为：

通过紫外分光光度计测得A

通过公式y

通过紫外分光光度计测得A