一种血小板功能检测试剂盒及血小板活化程度检测方法

摘要

本发明公开了一种血小板功能检测试剂盒，包括3种试剂：试剂1、试剂2、试剂3；试剂1采用单抗标记的磁珠、单抗选用抗血小板膜P‑选组素单抗SZ‑51或抗血小板膜GPIIb/IIIa单抗7E3；试剂2采用发光标记物标记的抗人血小板抗体；试剂3为诱导剂。本发明通过直接进行血小板活化数量测定，进行血小板活化程度绝对值评价，有效消除患者血小板数量不同带来的影响，准确反应血小板功能上的差异。

说明书

技术领域

本发明属于血液检测领域，具体涉及一种新的血小板功能检测试剂盒。

背景技术

血小板功能分析仪通过血小板聚集功能检测，在临床上主要用于辅助血栓性疾病的诊断与治疗。依据WHO数据：在2015年，全球约1500万人死于缺血性心脏病和卒中。近15年来，血栓性疾病一直是人类健康的头号杀手。研究表明，血小板功能的高低与血栓性疾病的发生和发展密切相关：对于已出现血管损伤/狭窄的患者，血小板功能越高，其血栓发生的概率越高，反之，发生出血的概率越高。血小板功能检测作为一种行之有效的血栓性疾病发生/复发的预测手段，已在国内外多个大规模临床实验中获得证实。

目前，通常采用血小板聚集率评价血小板的功能水平。聚集率作为活化血小板与总血小板数量的比值，活化的血小板占比越高，聚集率越高，反之则越低。然而，由于不同患者间血小板数量上差异较大，聚集率并不能反映由患者血小板数量不同带来的血小板功能上的差异。因此，建立一种评价血小板活化程度绝对值的方法，可以消除患者血小板数量不同带来的影响。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺陷，提供一种能够更加准确反映血小板功能差异的方法。

为了达到上述目的，本发明提供了一种血小板功能检测试剂盒，包括3种试剂：试剂1、试剂2、试剂3；试剂1采用单抗标记的磁珠、单抗选用抗血小板膜P-选组素单抗SZ-51或抗血小板膜GPIIb/IIIa单抗7E3；试剂2采用发光标记物标记的抗人血小板抗体；试剂3为诱导剂。

本发明还提供了一种血小板活化程度检测方法，该检测方法通过对血小板活化程度绝对值进行检测计算，具体方法为：对样本进行血小板活化诱导处理，加入单抗标记的磁珠，与样本中已被活化的血小板结合形成活化血小板-磁珠复合物，采用磁分离的方法将活化血小板-磁珠复合物分离出来后，加入发光标记物标记的抗人血小板抗体后，激发发光标记物发光，通过测定发光标记物的发光量计算活化血小板数量。

上述检测方法的具体步骤如下：

第一步：使用抗血小板膜P-选组素单抗SZ-51或抗血小板膜GPIIb/IIIa单抗7E3标记磁珠。

第二步：用发光标记物(如吖啶酯)标记抗人血小板抗体。

第三步：向将抗凝全血或富血小板血浆(PRP)中加入诱导剂，使血小板活化。同时加入标记好的磁珠。活化后的血小板与磁珠标记的抗血小板膜P-选组素单抗SZ-51或抗血小板膜GPIIb/IIIa单抗7E3结合。未活化的血小板不与磁珠结合。

第四步：混匀后，采用磁分离的方法将“活化血小板-磁珠”复合物与“未活化的血小板”分离开来。此时，“活化血小板-磁珠”复合物被磁铁牢牢的吸在试管壁上。

第五步：将试管中的溶液全部弃去。取走磁铁后，向试管中加入缓冲液，使试管壁上的“活化血小板-磁珠”复合物重悬。

第六步：向试管中加入吖啶酯-标记的抗人血小板抗体。形成“吖啶酯-抗人血小板抗体-活化血小板-磁珠”复合物。

第七步：再向其中加入过氧化氢和碱液，激发吖啶酯发光。此时，测定吖啶酯的发光量。吖啶酯的发光量与活化的血小板数量成正比。通过测定吖啶酯的发光量来计算活化的血小板数量。

其中发光标记物可以是吖啶酯、鲁米诺或其他常见化学发光标记物。诱导剂可以是二磷酸腺苷、花生四烯酸、肾上腺素、胶原等常见的血小板激活剂。

在部分实施例中，作为优选的，步骤(1)采用抗血小板膜P-选组素单抗SZ-51标记磁珠；所述发光标记物采用吖啶酯；所述诱导剂采用二磷酸腺苷；所述步骤(3)中待测样本抗凝全血用量为0.2mL，诱导剂用量为0.02mL，标记后的磁珠用量为0.2mL；所述步骤(5)中发光标记物标记的抗人血小板抗体用量为0.1mL。

其中，步骤(6)中活化血小板数量的计算方法如下：对活化血小板数量与发光标记物发光量进行直线拟合，将测定发光标记物的发光量代入拟合直线中，即得所述活化血小板数量。

将计算得到的活化血小板数量与正常参考值进行比较，判断血小板活化程度；其中，正常参考值为(40～130)×10

本发明相比现有技术具有以下优点：

本发明通过直接进行血小板活化数量测定，进行血小板活化程度绝对值评价，有效消除患者血小板数量不同带来的影响，准确反应血小板功能上的差异。

本发明利用磁性分离技术将活化血小板与其它未活化血小板有效分离，同时利用发光标记物进行含量测定，能准确有效地测定血小板活化数量。

附图说明

图1为活化血小板数量与吖啶酯发光量的拟合情况。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。

本发明提供了一种血小板功能检测试剂盒。

试剂盒由3个试剂组成：试剂1为单抗标记的磁珠，用于标记磁珠的单抗可以是抗血小板膜P-选组素单抗SZ-51或抗血小板膜GPIIb/IIIa单抗7E3。试剂2为发光标记物标记的抗人血小板抗体。发光标记物可以是吖啶酯、鲁米诺或其他常见化学发光标记物。试剂3为诱导剂，诱导剂可以是二磷酸腺苷、花生四烯酸、肾上腺素、胶原等常见的血小板激活剂。

试剂操作步骤如下：

第一步：使用抗血小板膜P-选组素单抗SZ-51或抗血小板膜GPIIb/IIIa单抗7E3标记磁珠(采用现有标记方法即可)。

第二步：用发光标记物(如吖啶酯)标记抗人血小板抗体(采用现有标记方法即可)。

第三步：向将抗凝全血或富血小板血浆(PRP)中加入诱导剂，使血小板活化。同时加入标记好的磁珠。活化后的血小板与磁珠标记的抗血小板膜P-选组素单抗SZ-51或抗血小板膜GPIIb/IIIa单抗7E3结合。未活化的血小板不与磁珠结合。

第四步：混匀后，采用磁分离的方法将“活化血小板-磁珠”复合物与“未活化的血小板”分离开来。此时，“活化血小板-磁珠”复合物被磁铁牢牢的吸在试管壁上。磁铁可采用电磁铁，通过通电与否进行磁性的选择。

第五步：将试管中的溶液全部弃去。取走磁铁后，向试管中加入缓冲液，使试管壁上的“活化血小板-磁珠”复合物重悬。

第六步：向试管中加入吖啶酯-标记的抗人血小板抗体。形成“吖啶酯-抗人血小板抗体-活化血小板-磁珠”复合物。

第七步：再向其中加入过氧化氢和碱液，激发吖啶酯发光。此时，测定吖啶酯的发光量。吖啶酯的发光量与活化的血小板数量成正比。通过测定吖啶酯的发光量来计算活化的血小板数量。

活化血小板数量与吖啶酯的发光量拟合公式：

以最小二乘法直线拟合活化血小板数量和吖啶酯的发光量。以活化血小板数量为自变量(X

y＝bx+a

其中：

n：6个测试结果，n＝6

i：第i个浓度梯度，i＝1，2，3，4，5

a：直线回归方程截距

b：直线回归方程斜率

X

Y

实施例1

本实施例试剂盒由3个试剂组成：试剂1为抗血小板膜P-选组素单抗SZ-51标记的磁珠，用量0.2ml。试剂2为吖啶酯标记的抗人血小板抗体，用量0.1ml。试剂3为二磷酸腺苷，用量0.02ml。缓冲液为MES缓冲液，pH 6.8。

具体检测步骤如下：

第一步：选取待测样本，此实施例采用抗凝全血，取0.2ml。

第二步：向0.2ml抗凝全血中加入0.02ml试剂3，使血小板活化。同时加入0.2ml试剂1。活化后的血小板与磁珠标记的抗血小板膜P-选组素单抗SZ-51结合。未活化的血小板不与磁珠结合。

第三步：混匀后，对电磁铁通电，采用磁分离的方法将“活化血小板-磁珠”复合物与“未活化的血小板”分离开来。此时，“活化血小板-磁珠”复合物被磁铁牢牢的吸在试管壁上。

第五步：将试管中的溶液全部弃去。对电磁铁断电(如采用永磁铁，则直接取走磁铁)后，向试管中加入0.1ml缓冲液，使试管壁上的“活化血小板-磁珠”复合物重悬。

第六步：向试管中加入0.1ml试剂2。形成“吖啶酯-抗人血小板抗体-活化血小板-磁珠”复合物。

第七步：再向其中加入过氧化氢和碱液，激发吖啶酯发光。此时，测定吖啶酯的发光量(光子数)，再根据图1中活化血小板数量和光子数关系曲线(按直线拟合公式，已知光子数y，计算活化血小板数量x)，计算活化的血小板数量。

效果实施例二

采用本方法测量40例健康人血液样本的血小板活化率，并按照“均值±1.96倍标准差”的方法建立正常参考值：(40～130)×10

取支架内血栓患者全血样本5例，正常人全血样本5例。同时用本方法和光学比浊法(LTA法)血小板聚集仪同时测定血小板功能，结果如下：

注：LTA法血小板功能检测正常参考值：血小板聚集率<70％，血小板聚集率高于70％意味着血栓风险高。

从上述结果可知，与LAT法相比，本方法检测支架内血栓患者样本和正常人样本所得结论与实际情况更相符。支架内血栓患者样本活化血小板数量高，血小板功能高。正常人样本活化血小板数量少，血小板功能正常。

而LTA法有两例支架内血栓患者测试血小板功能为正常，一例正常人样本测试血小板功能偏高。