一种甲型副伤寒沙门氏菌多糖修饰的纳米颗粒及其应用

摘要

本发明公开了一种甲型副伤寒沙门氏菌多糖修饰的纳米颗粒及其应用，所述纳米颗粒为甲型副伤寒沙门氏菌多糖修饰的蛋白质，蛋白质为a)或b)或c)或d)：a)由SEQ ID No.3的氨基酸序列组成的蛋白质；b)在a)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白；c)将SEQ ID No.3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的蛋白质。本发明的动物实验表明抗体水平及保护效果较单独的多糖和与CTB连接多糖明显提高。表明利用生物法制可制备更具潜力的纳米级多糖结合疫苗，为下一步多糖结合疫苗的发展提供了方向。

说明书

技术领域

本发明涉及一种可自组装为蛋白纳米颗粒的融合蛋白及其应用，属于生物医药领域。

背景技术

疫苗在病原细菌感染预防方面发挥着重要的作用。新一代疫苗产品(亚单位疫苗)由于成分更加单一明确，使其产品安全性更高，但这些疫苗常常具有较低的免疫原性， 注射后在体内会被体液快速稀释以及被迅速降解，因此往往需要一些佐剂和合适的输 送系统来促进最大的免疫应答。近年来研究不断的发现，通过将疫苗尺寸扩大到纳米 级后能明显的提高免疫效果，尤其是以纳米为载体的疫苗，已得到了不断地应用，其 最主要的特点是能够替代佐剂，能够同时激发细胞免疫和体液免疫，尤其是针对较弱 抗原表位，能够产生理想的免疫效果，这对未来疫苗发展提供了一个很好的方向。。

甲型副伤寒沙门氏菌表面多糖的抗体对预防其感染具有十分重要的作用，但单独的多糖抗原免疫后不能有效地激发机体反应，无法产生有效的免疫应答。将细菌表面 多糖与载体蛋白连接制备而成的多糖结合疫苗，由于同时激发了T细胞依赖和非依赖 免疫应答，免疫效果大大增强，尤其是对老人和婴幼儿能够产生有效的抗体，被认为 是目前最成功的疫苗形式之一。

目前还没有甲型副伤寒沙门氏菌疫苗上市，而当前研究中常用的制备多糖结合疫苗的方法是化学方法，即通过将甲型副伤寒沙门氏菌多糖提取并活化，只后和表达纯 化并同样活化的载体蛋白进行化学交联，这种方法过程复杂，成本高昂，导致价格普 遍较高，且产品不均一，导致质控困难。另外由于是通过化学反应完成疫苗的制备， 常常是用的是单体蛋白，载体蛋白很难使疫苗达到纳米级。因此如果能够利用生物法 制备纳米级甲型副伤寒沙门氏菌多糖结合疫苗，将会进一步提高免疫效果，达到理想 的保护效果。

发明内容

本发明所解决的技术问题在于，提供一种纳米级别的甲型副伤寒沙门氏菌多糖修饰的蛋白。

一种纳米级糖基化蛋白质，所述糖基化蛋白为由甲型副伤寒沙门氏菌多糖修饰的蛋白质，所述蛋白质为a)或b)或c)：

a)由SEQ ID No.3的氨基酸序列组成的蛋白质；

b)在a)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白；

c)将SEQ ID No.3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的蛋白质。

一种所述的蛋白质的编码基因，所述蛋白质的编码基因为如下1)或2)或3)或 4)所示的基因：

1)编码序列是SEQ ID No.4所示的DNA分子；

2)编码序列是SEQ ID No.4的第178-792位所示的DNA分子；

3)与1)或2)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述蛋白质。

一种制备所述蛋白质的方法，包括使蛋白质的编码基因在生物中进行表达得到所述蛋白质的步骤；所述生物为微生物、植物或非人动物。

所述使蛋白质的编码基因在生物中进行表达包括将所述蛋白质的编码基因导入受 体微生物，得到表达所述蛋白质的重组微生物，培养所述重组微生物，表达得到所述 蛋白质。

所述重组微生物为将pET28-tacpglL-tacCTBTri4573导入50973DW/cldLT感受态细胞得到的表达氨基酸序列是SEQ ID No.5的蛋白质的重组微生物，所述重组微生物 命名为50973DW/cldLT、pET28-tacpglL-tacCTBTri4573，所述载体 pET28-tacpglL-tacCTBTri4573为将pET28-tacpglL的SacI和XhoI识别位点之间的序 列替换为SEQ IDNo.4的第7-792位核苷酸，并保持其他序列不变的重组载体；所述 pET28-tacpglL为将pET28a(+)的XbaI和XhoI识别位点之间的序列替换为SEQ ID No.2 第7-2485核苷酸序列后得到的重组载体。

所述50973DW/cldLT感受态细胞为缺失O-抗原连接酶基因waaL且糖链延长的甲型副伤寒沙门氏菌50973DW/cldLT。

与所述蛋白质相关的生物材料，所述生物材料为下述B1)至B12)中的任一种：

B1)编码所述蛋白质的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；

B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；

B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；

B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；

B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；

B9)含有B1)所述核酸分子的转基因动物细胞系；

B10)含有B2)所述表达盒的转基因动物细胞系；

B11)含有B3)所述重组载体的转基因动物细胞系；

B12)含有B4)所述重组载体的转基因动物细胞系。

一种预防甲型副伤寒沙门氏菌的疫苗，所述疫苗包含所述的蛋白质或所述的生物材料。

下述任一种应用也应在本发明的保护范围之内：

Y1)权利要求1中所述蛋白质在制备甲型副伤寒沙门氏菌疫苗中的应用；

Y2)权利要求7中所述生物材料在制备甲型副伤寒沙门氏菌疫苗中的应用；

Y3)权利要求3-6中任一所述的方法在制备甲型副伤寒沙门氏菌疫苗中的应用；

Y4)权利要求1中所述蛋白质在制备甲型副伤寒沙门氏菌诊断抗原中的应用；

Y5)权利要求1中所述蛋白质在制备单克隆抗体中的应用。

本发明将已知的原核生物天然存在的五聚体蛋白霍乱毒素B亚单位CTB与一段 可形成三聚的肽段进行融合表达，进一步利用糖基化系统将志贺氏菌的多糖连入其中， 成功得到了纳米级的糖蛋白，动物实验表明抗体水平及保护效果较单独的多糖和与 CTB连接多糖明显提高。表明利用生物法制可制备更具潜力的纳米级多糖结合疫苗， 为下一步多糖结合疫苗的发展提供了方向。利用糖基转移酶宽松的底物特异性，通过 在菌体中的一步催化反应，从而使多糖在糖基转移酶的催化下转移到底物蛋白，只需 一步纯化即可得到糖蛋白，很好的解决的化学法的不足。此外生物法还有一个特点在 于其开放性，可根据设计，在基因水平上操作，合成不同新的载体蛋白，从而最大可 能的提高疫苗的应答能力。其中糖基转移酶PglL由于具有宽松的底物特异性，几乎可 以识别所有的聚糖，而被应用。

附图说明

图1为CTBTri4573-OPS表达检测；

图2为糖蛋白过分子筛后考马斯亮蓝染色；

图3为糖蛋白经过分子纯化后考马斯亮蓝染色及WB分析；

图4为糖蛋白颗粒动态光散射检测粒径大小及透射电镜分析；

图5为小鼠免疫前后特异性IgG抗体效价；

图6为小鼠免疫后攻毒；

图7为食蟹猴免疫后特异性IgG抗体效价；

图8为免疫前后的食蟹猴的血清的杀菌率对比图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域 普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用 的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用 的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的缺失O-抗原连接酶基因waaL且糖链延长的甲型副伤寒沙门氏菌50973DW/CldLT2和甲型副伤寒沙门氏菌CMCC 50973在文献Design andproduction ofconjugate vaccines against S.Paratyphi A using an O-linked glycosylationsystem in vivo. NPJ Vaccines.2018,3:4中公开，公众可从中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 生物工程研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用 途使用。

下述实施例中的pET28a(+)购自Novagen。

下述实施例中的HRP标记的Anti-His抗体为Abmart产品，货号为M20020。

下述实施例中的兔源沙门氏菌O2血清为日本生研株式会社产品，货号为210227。

下述实施例中的HRP标记的山羊抗兔为TransGen公司产品，编号为HS-101-01。

下述实施例中的HRP标记的驴抗小鼠IgG为Abcom公司产品，货号为ab6820)。

下述实施例中作为对照的OPS和CTB4573-OPS疫苗以及LPS均在文献Designandproduction ofconjugate vaccines against S.ParatyphiAusing an O-linkedglycosylation system in vivo.NPJ Vaccines.2018,3:4中记载，公众可从中国人民解放军 军事科学院军事医学研究院生物工程研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

实施例1.生物法制备纳米级细菌多糖结合疫苗

1)可糖基化的融合蛋白CTBTri4573的表达载体的构建

脑膜炎奈瑟球菌糖基转移酶PglL表达载体的构建：脑膜炎奈瑟球菌糖基转移酶PglL(GeneBank：JN200826.1)的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，其编码序列如SEQ IDNo.2的第180-1994位核苷酸所示。SEQ ID No.2的第1-6位核苷酸为XbaI识别位 点，SEQ IDNo.2的第105-2240位核苷酸为PglL表达盒的序列，PglL表达盒中，PglL 的表达由tac启动子启动，将该表达盒命名为tacpglL。其中，SEQ ID No.2的第105-133 位核苷酸为tac启动子的序列，第180-1994位核苷酸为脑膜炎奈瑟球菌糖基转移酶 PglL的编码序列，第2475-2480位核苷酸为SacI识别序列，第2486-2491位核苷酸为 XhoI识别位点。

通过全基因合成方法合成如具有如SEQ ID No.2所示序列的PglL的编码序列，用XbaI和XhoI酶切SEQ ID No.2所示的DNA分子，得到基因片段；用XbaI和XhoI酶 切pET28a(+)，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到含有SEQ ID No.21 所示的DNA分子的重组载体，将该重组载体命名为pET28-tacpglL。所述pET28-tacpglL 为将pET28a(+)的XbaI和XhoI识别位点之间的序列替换为SEQ ID No.2第7-2485核 苷酸序列后得到的重组载体。

CTBTri4573的编码氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，基因序列如SEQ ID No.4的第178-816所示，SEQ ID No.4的第1-6位核苷酸为XbaI识别位点，103-131位核苷酸 为tac启动子的序列，第178-792位核苷酸为CTBTri4573的编码序列，第793-798位 核苷酸为XhoI识别序列，第799-816位核苷酸为His标签。序列中，CTBTri4573序 列为CTBTri的C末端融合O糖基化位点4573；其中，为了避免CTB与Tri之间有空 间位阻效应，CTB和Tri之间由4个柔性氨基酸连接GGSG；4573为糖基化修饰序列， 为菌毛蛋白PilE第45-73位的29个氨基酸组成的肽段。

用XbaI和XhoI酶切SEQ ID No.4所示的DNA分子，得到基因片段；用XbaI和 XhoI酶切pET28a(+)，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组载 体，将该重组载体命名为pET28-tacCTBTri4573，所述载体pET28-tacCTBTri4573为将 pET28a(+)上XbaI和XhoI识别位点之间的序列替换为SEQ ID No.4的第7-792位核苷 酸，并保持其他序列不变的重组载体。

构建CTBTri4573糖基化表达载体具体方法为：

利用引物：SacI-UP：gagctctgcataattcgtgtcgctcaaggcgcactc

/XhoI-Down:ccgctcgagcttgatctcactgcttgtggccacg扩增pET28-tacCTBTri4573，并将得到的 扩增产物用SacI和XhoI双酶切得到DNA片段；用SacI和XhoI双酶切pET28-tacpglL， 得到载体大片段；将DNA片段与载体大片段连接，得到重组质粒，命名为 pET28-tacpglL-tacCTBTri4573,所述载体pET28-tacpglL-tacCTBTri4573为将 pET28-tacpglL的SacI和XhoI识别位点之间的序列替换为SEQ ID No.4的第7-792位 核苷酸，并保持其他序列不变的重组载体。其中，CTBTri4573的编码基因组成的表 达盒(即tacCTBTri4573)位于pglL表达盒(tacpglL)下游，将重组质粒送测序， 结果均正确。

2)50973DW/CldLT2感受态细胞的制备

将缺失O-抗原连接酶基因waaL且糖链延长的甲型副伤寒沙门氏菌 50973DW/CldLT2接种于LB液体培养基中，由于细菌缺失了O-抗原连接酶，因此可 以产生游离的O-抗原，经30℃过夜培养后，将1ml培养液转接到100mL低盐LB液 体培养基中，30℃培养至OD

3)表达菌株的构建

将质粒pET28-tacpglL-tacCTBTri4573电击转化入上述感受态细胞中，涂布含有终浓度为50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基，阳性克隆即得到的菌株 50973DW/CldLT2、pET28-tacpglL-tacCTBTri4573。

4)蛋白表达与检测

挑取50973DW/CldLT2、pET28-tacpglL-tacCTBTri4573菌株，接种于含有终浓 度为50μg/mL卡那霉素的LB培养基，37℃培养至OD

次日取上述30℃诱导10h的菌液1mL，离心取菌体，用1×Loading Buffer(50 mMpH 6.8Tris-HCl,1.6％SDS,0.02％溴酚蓝，8％甘油，20mM DTT)悬起，沸 水浴10分钟，用12％的SDS-PAGE电泳，电泳完毕后用Bio-Lab半干转转印仪将 蛋白转至PVDF膜上，20V恒压转印1小时，用鼠源HRP-Anti-His tag单克隆抗体 检测，结果如图1所示，全菌样品经SDS-PAGE后进行WB检测，在共表达PglL 和CTBTri4573时,由于细菌本身的O-抗原多糖在糖基转移酶催化下转移到载体蛋 白，因此WB条带可以看到分子量大小的向上迁移，同时，另外，由于细菌多糖为 串联重复结构，因此呈现出典型的糖基化梯状条带，表明蛋白被糖基化，连入了细 菌多糖，说明上述表达出的蛋白为甲型副伤寒沙门氏菌多糖修饰的蛋白CTBTri4573-OPS，而在对照组无PglL的载体作为对照时只有载体蛋白表达。

5)蛋白纯化

将50973DW/CldLT2、pET28-tacpglL-tacCTBTri4573接种于含有终浓度为50 μg/mL卡那霉素的LB培养基，37℃，220转/分钟培养10小时后转接于5L LB培 养基37℃，220转/分钟培养至OD

样品处理：取上述30℃诱导10小时的菌体，加入400mL上样缓冲液(20mM pH7.5Tris-HCl、0.2M NaCl、10mM咪唑)，超声破菌(超声3s暂停5s，累计超声时间 30分钟)，12000g离心，收集上清。

样品纯化：首先用0.5M的NaOH的水溶液冲洗柱床至少3个柱床体积，然后用 去离子水平衡至pH中性，然后用0.5M的NiSO

结果如图2所示，可得到纯度大于90％的糖蛋白样品。

6)颗粒特异性与大小表征

取100微升纯化样品，加入等体积2×Loading Buffer(100mM pH 6.8Tris-HCl,3.2％SDS,0.04％溴酚蓝，16％甘油，40mM DTT)悬起，沸水浴10分钟，用12％ 的SDS-PAGE电泳，电泳完毕后用Bio-Lab半干转转印仪将蛋白转至PVDF膜上， 20V恒压转印1小时，用鼠源HRP-Anti-His tag单克隆抗体和甲型副伤寒沙门氏菌 特异性O-抗原血清检测，结果如图3所示。

之后利用动态光散射检测样品粒径，将样品装入截留分子量14kDa的透析袋中，用双蒸水透析，置于4℃约24小时，期间每隔大约8小时换一次双蒸水，之后取1mL 透析的样品利用马尔文粒度仪进行动态光散射检测，结果如图4A所示，样品为约 25-50nm的糖蛋白颗粒，之后对样品进行透射电镜观察，用2％磷钨酸负染后电镜观察， 结果如图4B所示，尺寸与动态光散射结果一致(图4B)。

实施例2.动物免疫评价

1)免疫小鼠后血清效价

取40只6周龄雌性Balb/c小鼠，随机分为4组，分别为PBS组(10只)、OPS 组(10只)、CTB4573-OPS组(10只)和CTBTri4573-OPS组(10只)。分别向OPS 组、CTB4573-OPS组、CTBTri4573-OPS组的雌性Balb/c小鼠注射OPS(Design and production ofconjugatevaccines against S.ParatyphiAusing an O-linked glycosylation system invivo.NPJ Vaccines.2018,3:4)、CTB4573-OPS(Design andproduction of conjugatevaccines against S.ParatyphiAusing an O-linked glycosylation system in vivo.NPJ Vaccines.2018,3:4)和CTBTri4573-OPS(对应实施例1中的步骤5)中得到的 糖基化蛋白)；每组小鼠皮下分别注射，以多糖含量计量，均皮下注射2.5μg的多 糖；分别在第1、15、29天免疫，末次免疫后10天取尾血，用间接ELISA法测各 组小鼠血清中甲型副伤寒沙门氏菌中抗O-多糖的抗体滴度。用提取的甲型副伤寒沙 门氏菌CMCC 50973株的LPS包被酶联板，每孔包被10μg的LPS(Design and production ofconjugate vaccines againstS.ParatyphiAusing an O-linked glycosylation system in vivo.NPJ Vaccines.2018,3:4)，其他操作步骤参见《精编分子生物学实验指 南》。结果如图5所示，从图5中可以看出，相比于OPS组和CTB4573-OPS组， CTBTri4573-OPS免疫小鼠后产生多糖特异性的总IgG滴度显著升高，有效激发机体 的免疫应答，证明多糖抗原连在纳米载体上之后能够更好的刺激机体，提高免疫应答 水平。

2)免疫小鼠后保护性评价

为了进一步确定上述效果，末次免疫后两周，小鼠按照2倍半数致死量腹腔注 射甲型副伤寒沙门氏菌CMCC 50973，剂量为200μl(5.76×10

3)免疫食蟹猴后抗体效价

9只3.5±0.5kg的雄性食蟹猴，随机分为3组(OPS组(3只)、CTB4573-OPS 组(3只)、CTBTri4573-OPS组(3只))。分别向OPS组、CTB4573-OPS组、 CTBTri4573-OPS组的雄性食蟹猴注射OPS、CTB4573-OPS和CTBTri4573-OPS； 以多糖含量计量，均上臂肌肉注射5μg的多糖；分别在第1、15、29天免疫，每次 免疫后7天静脉取血，以每只猴子免疫前血清作为阴性对照，用间接ELISA法检测 每只猴子血清中甲型副伤寒沙门氏菌中抗O-多糖的抗体滴度。用提取的甲型副伤寒 沙门氏菌CMCC50973株的LPS包被酶联板，每孔包被10μg的LPS，其他操作步 骤参见《精编分子生物学实验指南》。结果如图7所示，图7中的OPS表示OPS组， C-OPS表示CTB4573-OPS组，NP-OPS表示CTB4573-OPS组，从图7中可以看出， 相比于OPS组和CTB4573-OPS组，CTBTri4573-OPS组食蟹猴中血清IgG效价显著升 高，证明，与之前小鼠实验结果一致，表明这种纳米疫苗在灵长类动物中同样具有很 好的免疫应答能力。

4)免疫食蟹猴后血清杀菌活性

甲型副伤寒沙门氏菌野生株CMCC 50973培养于LB液体培养基中，37℃摇床220转/分钟培养至OD

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨 和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较 宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发 明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本 发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的 改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> 一种甲型副伤寒沙门氏菌多糖修饰的纳米颗粒及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 604

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Pro Ala Glu Thr Thr Val Ser Gly Ala His Pro Ala Ala Lys Leu

1 5 10 15

Pro Ile Tyr Ile Leu Pro Cys Phe Leu Trp Ile Gly Ile Val Pro Phe

20 25 30

Thr Phe Ala Leu Lys Leu Lys Pro Ser Pro Asp Phe Tyr His Asp Ala

35 40 45

Ala Ala Ala Ala Gly Leu Ile Val Leu Leu Phe Leu Thr Ala Gly Lys

50 55 60

Lys Leu Phe Asp Val Lys Ile Pro Ala Ile Ser Phe Leu Leu Phe Ala

65 70 75 80

Met Ala Ala Phe Trp Tyr Leu Gln Ala Arg Leu Met Asn Leu Ile Tyr

85 90 95

Pro Gly Met Asn Asp Ile Val Ser Trp Ile Phe Ile Leu Leu Ala Val

100 105 110

Ser Ala Trp Ala Cys Arg Ser Leu Val Ala His Phe Gly Gln Glu Arg

115 120 125

Ile Val Thr Leu Phe Ala Trp Ser Leu Leu Ile Gly Ser Leu Leu Gln

130 135 140

Ser Cys Ile Val Val Ile Gln Phe Ala Gly Trp Glu Asp Thr Pro Leu

145 150 155 160

Phe Gln Asn Ile Ile Val Tyr Ser Gly Gln Gly Val Ile Gly His Ile

165 170 175

Gly Gln Arg Asn Asn Leu Gly His Tyr Leu Met Trp Gly Ile Leu Ala

180 185 190

Ala Ala Tyr Leu Asn Gly Gln Arg Lys Ile Pro Ala Ala Leu Gly Val

195 200 205

Ile Cys Leu Ile Met Gln Thr Ala Val Leu Gly Leu Val Asn Ser Arg

210 215 220

Thr Ile Leu Thr Tyr Ile Ala Ala Ile Ala Leu Ile Leu Pro Phe Trp

225 230 235 240

Tyr Phe Arg Ser Asp Lys Ser Asn Arg Arg Thr Met Leu Gly Ile Ala

245 250 255

Ala Ala Val Phe Leu Thr Ala Leu Phe Gln Phe Ser Met Asn Thr Ile

260 265 270

Leu Glu Thr Phe Thr Gly Ile Arg Tyr Glu Thr Ala Val Glu Arg Val

275 280 285

Ala Asn Gly Gly Phe Thr Asp Leu Pro Arg Gln Ile Glu Trp Asn Lys

290 295 300

Ala Leu Ala Ala Phe Gln Ser Ala Pro Ile Phe Gly His Gly Trp Asn

305 310 315 320

Ser Phe Ala Gln Gln Thr Phe Leu Ile Asn Ala Glu Gln His Asn Ile

325 330 335

Tyr Asp Asn Leu Leu Ser Asn Leu Phe Thr His Ser His Asn Ile Val

340 345 350

Leu Gln Leu Leu Ala Glu Met Gly Ile Ser Gly Thr Leu Leu Val Ala

355 360 365

Ala Thr Leu Leu Thr Gly Ile Ala Gly Leu Leu Lys Arg Pro Leu Thr

370 375 380

Pro Ala Ser Leu Phe Leu Ile Cys Thr Leu Ala Val Ser Met Cys His

385 390 395 400

Ser Met Leu Glu Tyr Pro Leu Trp Tyr Val Tyr Phe Leu Ile Pro Phe

405 410 415

Gly Leu Met Leu Phe Leu Ser Pro Ala Glu Ala Ser Asp Gly Ile Ala

420 425 430

Phe Lys Lys Ala Ala Asn Leu Gly Ile Leu Thr Ala Ser Ala Ala Ile

435 440 445

Phe Ala Gly Leu Leu His Leu Asp Trp Thr Tyr Thr Arg Leu Val Asn

450 455 460

Ala Phe Ser Pro Ala Thr Asp Asp Ser Ala Lys Thr Leu Asn Arg Lys

465 470 475 480

Ile Asn Glu Leu Arg Tyr Ile Ser Ala Asn Ser Pro Met Leu Ser Phe

485 490 495

Tyr Ala Asp Phe Ser Leu Val Asn Phe Ala Leu Pro Glu Tyr Pro Glu

500 505 510

Thr Gln Thr Trp Ala Glu Glu Ala Thr Leu Lys Ser Leu Lys Tyr Arg

515 520 525

Pro His Ser Ala Thr Tyr Arg Ile Ala Leu Tyr Leu Met Arg Gln Gly

530 535 540

Lys Val Ala Glu Ala Lys Gln Trp Met Arg Ala Thr Gln Ser Tyr Tyr

545 550 555 560

Pro Tyr Leu Met Pro Arg Tyr Ala Asp Glu Ile Arg Lys Leu Pro Val

565 570 575

Trp Ala Pro Leu Leu Pro Glu Leu Leu Lys Asp Cys Lys Ala Phe Ala

580 585 590

Ala Ala Pro Gly His Pro Glu Ala Lys Pro Cys Lys

595 600

<210> 2

<211> 2491

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tctagaactg cataattcgt gtcgctcaag gcgcactccc gttctggata atgttttttg 60

cgccgacatc ataacggttc tggcaaatat tctgaaatga gctgttgaca attaatcatc 120

ggctcgtata atgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagaattca 180

tgcccgctga aacgaccgta tccggcgcgc accccgccgc caaactgccg atttacatcc 240

tgccctgctt cctttggata ggcatcgtcc cctttacctt cgcgctcaaa ctgaaaccgt 300

cgcccgactt ttaccacgat gccgccgccg cagccggcct gattgtcctg ttgttcctca 360

cggcaggaaa aaaactgttt gatgtcaaaa tccccgccat cagcttcctt ctgtttgcaa 420

tggcggcgtt ttggtatctt caggcacgcc tgatgaacct gatttacccc ggtatgaacg 480

acatcgtctc ttggattttc atcttgctcg ccgtcagcgc gtgggcctgc cggagcttgg 540

tcgcacactt cggacaagaa cgcatcgtga ccctgtttgc ctggtcgctg cttatcggct 600

ccctgcttca atcctgcatc gtcgtcatcc agtttgccgg ctgggaagac acccctctgt 660

ttcaaaacat catcgtttac agcgggcaag gcgtaatcgg acacatcggg cagcgcaaca 720

acctcggaca ctacctcatg tggggcatac tcgccgccgc ctacctcaac ggacaacgaa 780

aaatccccgc cgccctcggc gtaatctgcc tgattatgca gaccgccgtt ttaggtttgg 840

tcaactcgcg caccatcttg acctacatag ccgccatcgc cctcatcctt cccttctggt 900

atttccgttc ggacaaatcc aacaggcgga cgatgctcgg catagccgca gccgtattcc 960

ttaccgcgct gttccaattt tccatgaaca ccattctgga aacctttact ggcatccgct 1020

acgaaactgc cgtcgaacgc gtcgccaacg gcggtttcac agacttgccg cgccaaatcg 1080

aatggaataa agcccttgcc gccttccagt ccgccccgat attcgggcac ggctggaaca 1140

gttttgccca acaaaccttc ctcatcaatg ccgaacagca caacatatac gacaacctcc 1200

tcagcaactt gttcacccat tcccacaaca tcgtcctcca actccttgca gagatgggaa 1260

tcagcggcac gcttctggtt gccgcaaccc tgctgacggg cattgccggg ctgcttaaac 1320

gccccctgac ccccgcatcg cttttcctaa tctgcacgct tgccgtcagt atgtgccaca 1380

gtatgctcga atatcctttg tggtatgtct atttcctcat ccctttcgga ctgatgctct 1440

tcctgtcccc cgcagaggct tcagacggca tcgccttcaa aaaagccgcc aatctcggca 1500

tactgaccgc ctccgccgcc atattcgcag gattgctgca cttggactgg acatacaccc 1560

ggctggttaa cgccttttcc cccgccactg acgacagtgc caaaaccctc aaccggaaaa 1620

tcaacgagtt gcgctatatt tccgcaaaca gtccgatgct gtccttttat gccgacttct 1680

ccctcgtaaa cttcgccctg ccggaatacc ccgaaaccca gacttgggcg gaagaagcaa 1740

ccctcaaatc actaaaatac cgcccccact ccgccaccta ccgcatcgcc ctctacctga 1800

tgcggcaagg caaagttgca gaagcaaaac aatggatgcg ggcgacacag tcctattacc 1860

cctacctgat gccccgatac gccgacgaaa tccgcaaact gcccgtatgg gcgccgctgc 1920

tacccgaact gctcaaagac tgcaaagcct tcgccgccgc gcccggtcat ccggaagcaa 1980

aaccctgcaa atgaaagctt ggctgttttg gcggatgaga gaagattttc agcctgatac 2040

agattaaatc agaacgcaga agcggtctga taaaacagaa tttgcctggc ggcagtagcg 2100

cggtggtccc acctgacccc atgccgaact cagaagtgaa acgccgtagc gccgatggta 2160

gtgtggggtc tccccatgcg agagtaggga actgccaggc atcaaataaa acgaaaggct 2220

cagtcgaaag actgggcctt tcgttttatc tgttgtttgt cggtgaacgc tctcctgagt 2280

aggacaaatc cgccgggagc ggatttgaac gttgcgaagc aacggcccgg agggtggcgg 2340

gcaggacgcc cgccataaac tgccaggcat caaattaagc agaaggccat cctgacggat 2400

ggcctttttg cgtttctaca aactcttttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 2460

tccgctcatg agacgagctc ggccgctcga g 2491

<210> 3

<211> 213

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Lys Lys Ile Trp Leu Ala Leu Ala Gly Leu Val Leu Ala Phe Ser

1 5 10 15

Ala Ser Ala Thr Pro Gln Asn Ile Thr Asp Leu Cys Ala Glu Tyr His

20 25 30

Asn Thr Gln Ile Tyr Thr Leu Asn Asp Lys Ile Phe Ser Tyr Thr Glu

35 40 45

Ser Leu Ala Gly Lys Arg Glu Met Ala Ile Ile Thr Phe Lys Asn Gly

50 55 60

Ala Ile Phe Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile Asp Ser Gln

65 70 75 80

Lys Lys Ala Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile Ala Tyr Leu

85 90 95

Thr Glu Ala Lys Val Glu Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys Thr Pro

100 105 110

His Ala Ile Ala Ala Ile Ser Met Ala Asn Gly Gly Ser Gly Arg Leu

115 120 125

Leu Leu Arg Leu Glu Glu Leu Glu Arg Arg Leu Glu Glu Leu Ala Lys

130 135 140

Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Val Asp Leu Glu Leu

145 150 155 160

Ala Ala Leu Arg Arg Arg Leu Glu Glu Leu Ala Arg Gly Gly Ser Gly

165 170 175

Ser Ala Val Thr Glu Tyr Tyr Leu Asn His Gly Glu Trp Pro Gly Asn

180 185 190

Asn Thr Ser Ala Gly Val Ala Thr Ser Ser Glu Ile Lys Leu Glu His

195 200 205

His His His His His

210

<210> 4

<211> 816

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tctagatgca taattcgtgt cgctcaaggc gcactcccgt tctggataat gttttttgcg 60

ccgacatcat aacggttctg gcaaatattc tgaaatgagc tgttgacaat taatcatcgg 120

ctcgtataat gtgtggaatt gtgagcggat aacaatttca cacaggaaac agaattcatg 180

aagaaaattt ggctggcctt agccggcctg gttctggcat tcagcgccag cgcaaccccg 240

cagaacatca ccgacctgtg cgccgagtac cacaacaccc aaatttatac cctgaacgac 300

aaaattttta gctacaccga gagcctggca ggcaagcgcg agatggccat catcaccttc 360

aagaacggcg ccattttcca ggtggaggtg ccgggcagcc agcacatcga cagtcagaag 420

aaggccatcg agcgcatgaa ggacaccctg cgcatcgcct acctgaccga ggccaaggtg 480

gagaagctgt gcgtgtggaa caacaagacc ccgcacgcca tcgccgcaat cagcatggcc 540

aacggcggat ccggccgcct gctgctgcgt ctggaagaac tggaacgtcg cctggaagag 600

ctggcaaagt tcgtggcagc atggaccctg aaagcggctg cggttgacct ggaactggct 660

gctctgcgtc gtcgtctgga ggagctggct cgtggcggtt ctggtagcgc cgtgaccgag 720

tactatctga accatggcga gtggccgggt aataacacca gcgccggcgt ggccacaagc 780

agtgagatca agctcgagca ccaccaccac caccac 816