一种PTP1B Y152结构肽、肽修饰的血管化骨缺损再生支架及其制备方法和应用

摘要

本发明属于骨修复材料技术领域，具体涉及一种PTP1B Y152结构肽、肽修饰的血管化骨缺损再生支架及其制备方法和应用，所述肽为38RM肽，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述血管化骨缺损再生支架上修饰有药物载体负载的38RM肽。本发明设计的38RM肽具有Tyr152和Asp181位点核心结构域序列，能够解偶联细胞与细胞的黏附，并能够促进干细胞向成骨分化，诱导了骨形成，所修饰的血管化骨缺损再生支架能实现骨缺损修复中血管生成和骨再生的有效耦联，为骨缺损修复的治疗提供了新的策略。

说明书

技术领域

本发明属于骨修复材料技术领域，具体涉及一种PTP1B Y152结构肽、肽修饰的血管化骨缺损再生支架及其制备方法和应用。

背景技术

节段性骨缺损常常发生在创伤、骨感染和骨肿瘤截骨术后的病人。节段性骨缺损的修复是骨科临床面临的重大难题，其关键在于难以获取足量的高活性骨修复材料。自体骨移植的“金标准”治疗策略存在明显的局限性和不足，寻找骨替代材料就显得格外重要。理想的骨替代材料需要具有快速的血管化能力和强大的骨诱导生物活性。目前，骨支架材料中最大的缺陷就是血管化不足，因而往往出现移植骨吸收，成骨不全等并发症。

选择性细胞滞留技术(SCR技术)是一项新型有效的组织工程技术，旨在通过机械过滤和生物吸附的原理，在术中获得患者骨髓液后，随即利用干细胞富集器将骨髓反复流经疏松多孔的支架材料，从而在术中快速创建一个包含骨髓间充质干细胞(marrow stemcell，MSCs)、血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)和相关细胞因子的微环境，实时获得高生物活性的“自体人工骨”。骨髓中含有大量有核细胞和细胞因子，包括骨髓间充质干细胞、造血干细胞、单核巨噬细胞等，这些细胞和因子在骨缺损修复治疗过程中发挥着关键作用。由此可见，滞留足够的细胞和细胞因子是SCR技术进行骨修复的必要条件。应用于SCR技术的支架材料需具备一定的条件，包括其多孔状的立体结构、良好的生物相容性、基本的骨传导性及诱导性等。脱钙骨基质(demineralized bone matrix，DBM)即是一种运用在SCR技术中的常用支架材料，是严格按照规范流程处理的同种异体骨，呈海绵状多孔立体结构，主要成分为胶原和少量细胞因子，具备较好的生物相容性和成骨诱导能力，是目前应用于临床的骨组织工程支架材料。然而由于表面电荷相斥、粘附位点较少等原因，其与细胞粘附的能力还有待提高，故有研究将通过在其表面修饰正电荷、减小的孔径和增加额外粘附位点等方式，来进一步提高其自身的成骨诱导能力和与细胞的粘附能力。此外，当前研究主要着眼于 MSCs的粘附、迁移、增殖和分化，而对EPCs的重要性不够重视，导致很多材料在实际运用中效果不佳。

PTP1B(蛋白酪氨酸磷酸酶1B)是非受体型酪氨酸磷酸酶，大部分以内质网锚定形式存在、少部分以酶切的游离形式存在，同时参与钙黏蛋白依赖的细胞间粘附和整合素依赖的细胞迁移中多个关键环节。其一，PTP1B不仅参与钙黏蛋白的胞膜转位，而且直接结合于钙黏蛋白内的结构域并持续去磷酸化β-Catenin Tyr654，进而稳定钙黏蛋白-链蛋白粘附复合体，是组成和维持钙黏蛋白粘附通路的关键酶。其二，PTP1B上调细胞前沿板状伪足中复合斑半衰期、调控复合斑成熟、促进细胞骨架重构和迁移前端的板状伪足伸出，是参与整合素依赖的细胞粘附转变至定向迁移的关键调控子。

PTP1B自身活性和功能可受磷酸化途径快速调控，PTP1B含有Ser50、Ser352、Ser378、 Ser386等丝氨酸磷酸化位点，以及Tyr66、Tyr152、Tyr153等酪氨酸磷酸化位点。PTP1B的 Tyr152位点处于磷酸化状态是其组成和稳定钙黏蛋白粘附通路的必要条件。研究显示，经 PTP1B的Tyr152结构域模拟肽干预后MSCs的整合素通路被激活并展现出活跃的细胞动力学特征，细胞粘附由钙黏蛋白和整合素的平衡向整合素粘附通路倾斜。Asp 181是保守的，位于WPD环上。酶动力学和结构研究表明，Asp181在蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)介导的催化中起着关键作用。有研究报道，Asp 181点突变能影响PTP1B活性中心的P环、WPD环区和其他残基的骨架稳定性。分子动力学模拟发现，Asp181的质子化状态和活性中心水分子的位置对 WPD环的构象稳定性和PTP1B的催化活性有很大的影响。

骨缺损处血供差，处于缺氧和高PH值微环境，不利于MSCs和EPCs的存活，解决这一问题往往是在支架材料上植入干细胞，连同材料植入体内，但这些细胞进入体内后会在短期内死亡，新近的支架材料也有使用负载细胞因子，比如VEGF、BMP2等，但这些细胞因子本身是蛋白质大分子，在体外加载到支架材料上本身就很困难，稳定性也很差，在体内会在短期内迅速降解或释放，实际运用的效果也不佳。

发明内容

有鉴于此，本发明目的之一在于提供一种PTP1B Y152结构肽。本发明目的之二在于提供一种肽在骨修复中的应用。本发明目的之三在于提供一种肽修饰的血管化骨缺损再生支架。本发明目的之四在于提供一种肽修饰的血管化骨缺损再生支架的制备方法。本发明目的之五在于提供一种肽修饰的血管化骨缺损再生支架在作为骨修复材料中的应用。为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、一种PTP1B Y152结构肽，所述肽为38RM肽，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2、一种PTP1B Y152结构肽在骨修复中的应用。

3、一种PTP1B Y152结构肽修饰的血管化骨缺损再生支架，所述支架上修饰有药物载体负载的肽，所述肽为38RM肽，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

4、一种肽修饰的血管化骨缺损再生支架的制备方法，所述制备方法为：将药物载体在含有BSA的PBS缓冲液中重悬、超声，放入血管化骨缺损再生支架至浸没，震荡、烘干，再放入38RM肽溶液中，震荡、干燥。

作为优选的技术方案之一，所述血管化骨缺损再生支架为DBM支架。

作为优选的技术方案之一，所述药物载体为脂质体、水凝胶或纳米载体中至少一种。

作为优选的技术方案之一，所述纳米载体为介孔二氧化硅纳米颗粒。

作为优选技术方案之一，所述PBS缓冲液中BSA的质量分数为1-2％。

作为优选的技术方案之一，所述肽溶液中38RM肽的终浓度为10-100μM。

作为优选技术方案之一，所述干燥为氮气干燥，时间为30min。

5、一种肽修饰的血管化骨缺损再生支架在作为骨修复材料中的应用。

本发明的有益效果在于：

本发明设计的38RM肽具有Tyr152和Asp181位点核心结构域序列，能够解偶联细胞与细胞的黏附，促进间充质干细胞从干细胞龛中脱离，募集迁移至骨缺损支架部位，并能够促进干细胞向成骨分化，诱导了骨形成。同时，38RM也能募集内皮祖细胞，促进支架内血管新生。从而有效偶联了骨再生与血管生成，促进了骨缺损的修复。DBM-MSN/38RM支架的优点是能够有效偶联骨生成和血管生成，赋予了支架材料血管化表面的特点。

附图说明

图1：介孔二氧化硅纳米颗粒(MSN)逐层组装的DBM-MSN/38RM支架的制备过程。

图2：DBM、DBM-MSN、DBM/38RM、DBM-MSN/38RM支架环境电镜扫描。

图3：DBM、DBM-MSN、DBM/38RM、DBM-MSN/38RM支架对MSCs细胞的活力的影响。

图4：DBM-MSN/38RM和DBM/38RM支架上38RM肽的释放曲线。

图5：38RM肽对EPCs管腔形成的影响，A为EPCs管腔形成结果，B为管腔累积长度结果。

图6：DBM、DBM-MSN、DBM/38RM、DBM-MSN/38RM支架对MSCs的迁移影响。

图7：DBM支架和DBM-MSN/38RM支架上的MSCs中细胞迁移特异性基因的相对mRNA表达水平。

图8：DBM、DBM-MSN、DBM/38RM、DBM-MSN/38RM支架上MSCs的延展性。

图9：38RM肽的成骨分化能力检测。

图10：DBM、DBM-MSN/38RM支架对EPCs迁移的影响。

图11：DBM、DBM-MSN/38RM支架上EPCs细胞迁移特异性基因相对mRNA表达水平。

图12：DBM、DBM-MSN、DBM/38RM、DBM-MSN/38RM支架对骨缺损部位修复的 Micro-CT扫描结果，A为Micro-CT三维重建骨缺损部位图，B为骨缺损部位BV/TV、Tb.N 和Tb.Sp定量分析结果。

图13：DBM、DBM-MSN/38RM支架对骨缺损部位修复中Notch通路的激活和成骨分化标志(Runx2和OCN)的影响。

图14：DBM、DBM-MSN、DBM/38RM、DBM-MSN/38RM支架对骨再生的影响，A为二甲酚橙和钙黄绿素双标记新骨再生结果图，B为骨形成速率(BFR/BS)和矿质沉积率(MAR) 检测结果。

图15：DBM、DBM-MSN、DBM/38RM、DBM-MSN/38RM支架对骨缺损部位修复的 Micro-CT血管造影、骨血管的体积和表面积定量分析结果。

具体实施方式

以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。通过实施例，科研人员可以对本发明有更清楚的了解，可以在此基础上对本发明做出一定的变更和修改，以获得不同的研究效果下述实施例中的实验方法，如无特殊说明均为常规方法。实验过程中涉及到的试剂均为常规试剂，使用均参照产品使用说明书使用。

实施例1

制备38RM肽及DBM-MSN/38RM支架

根据Tyr152和Asp181位点序列，设计38个氨基酸的多肽(以下简称38RM肽)抑制两个位点活性，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。采用固相合成法合成38RM肽，将MSNs 重悬于含2％BSA的PBS溶液中，超声3-5min，将DBM支架置入溶液中，室温下将该混合液震荡24h，氮气干燥30min，得到DBM-MSN支架。然后将38RM肽溶于含2％BSA的PBS 溶液中，工作浓度为100μM。将DBM-MSN支架放入38RM肽溶液中，4℃震荡24h，氮气干燥30min。重复三个循环，得到DBM-MSN/38RM支架，构建过程如图1所示。

实施例2

DBM-MSN/38RM支架性能检测

(1)DBM-MSN/38RM支架的环境电镜扫描

按照实施例1的方法，构建DBM-MSN、DBM/38RM、DBM-MSN/38RM三组支架，以空白DBM支架为对照，调整每组支架尺寸为0.5×0.5×0.3cm，分别置于环境扫描电镜的样品扫描仓中进行扫描。扫描条件为：低真空模式，25kV加速电压、3.5电子束斑，放大扫描倍数：100×。获得图像后，测量每个孔的横向最小和最大直径得到孔径平均值，每个样品测量 10个孔。结果如图2所示，DBM-MSN/38RM支架的表面微粗糙度增加，表明MSN和38RM 纳米晶成功修饰在DBM支架表面。

(2)DBM-MSN/38RM支架上MSCs细胞活力的影响

按照实施例1的方法，构建DBM-MSN、DBM/38RM、DBM-MSN/38RM三组支架，以空白DBM支架为对照，调整每组支架尺寸为0.5×0.5×0.3cm，分别放置在干细胞富集器内。调整EPCs细胞密度为1×10

(3)DBM-MSN/38RM支架上38RM肽的释放曲线

用1ml磷酸缓冲液(pH＝6.8)制备浓度为1mg/mL的DBM-MSN/38RM和DBM/38RM，37℃下搅拌溶解2、6、12、24、48、72、96、120、144、168和192h小时，5000g高速离心取上清液，1ml磷酸缓冲液重悬沉淀，采用BCA法测定38RM肽的含量。结果如图4所示， DBM-MSN/38RM支架在5天内有缓慢和连续的释放曲线，随后是相对缓慢的释放状态。38RM 的持续释放不仅可以增强MSCs和EPC

(4)38RM肽对EPCs管腔形成的影响

将38RM肽加入RPIM1640培养基中，使终浓度为200nM，用此培养基体外培养EPC

(5)DBM-MSN/38RM支架的MSCs迁移实验

按照实施例1的方法，构建DBM-MSN、DBM/38RM、DBM-MSN/38RM三组支架，以空白DBM支架为对照，调整每组支架尺寸为1×1×0.3cm，12孔板下方分别放置各组支架材料，上方小室内放入浓度为10

(6)按照实施例1的方法，构建DBM-MSN、DBM/38RM、DBM-MSN/38RM三组支架，以空白DBM支架为对照，调整每组支架尺寸为1×1×0.3cm，按照(5)中所述方法将各组支架与MSCs共培养，于第7天将各组支架材料取出，PBS漂洗后固定30分钟。再以PBS 缓冲液轻柔漂洗3次，而后分别放置在24孔板内。以0.5％Triton X-100浸泡10分钟，PBS 缓冲液漂洗，以3％BSA溶液封闭。2小时后，每孔加入1.5mL罗丹明标记的鬼笔环肽工作液(25mg/ml)，使各组材料浸没，并4℃避光孵育过夜。PBS缓冲溶液漂洗3次，DAPI工作液染色5分钟，再以PBS缓冲溶液漂洗3次，随后在激光共聚焦显微镜下扫描并三维重建。结果如图8所示，DBM-MSN/38RM支架上MSCs具有更强的延展性。

(7)成骨分化检测

将MSCs细胞接种于12孔板，每孔5×10

(8)DBM-MSN/38RM支架的EPCs迁移实验

按照实施例1的方法，构建DBM-MSN/38RM支架，以空白DBM支架为对照，调整每组支架尺寸为1×1×0.3cm，12孔板下方分别放置各组支架材料，上方小室内放入10

(9)DBM-MSN/38RM支架体内修复股骨缺损

按照实施例1的方法，构建DBM-MSN、DBM/38RM、DBM-MSN/38RM三组支架，以空白DBM支架为对照，调整DBM-MSN/38RM支架和无修饰DBM支架的尺寸为5×5×10mm，将支架分别放置在干细胞富集器内。分离大鼠骨髓和胫骨，用注射器冲出全部骨髓，制备大鼠全骨髓细胞，调整全骨髓细胞密度为1×10

10周龄雄性SD大鼠，体重300g，0.5％戊巴比妥钠麻醉后，暴露股骨，在股骨外侧髁向内侧髁钻孔，直径3.8mm，钻穿两侧皮质，形成骨缺损。将上述支架分别放入股骨缺损处，术后4周取材。

a.骨缺损部位的Micro-CT扫描

对4组支架修复大鼠骨缺损部位进行Micro CT扫描，测量计算体骨积分数(BV/TV)、骨小梁数量(Tb.N)和骨小梁厚度(Tb.Th)。结果如图12中所示，A为Micro-CT三维重建骨缺损部位图，B为骨缺损部位BV/TV、Tb.N和Tb.Th定量分析结果。Micro-CT三维重建图像，显示DBM-MSN/38RM组表现出更好的新骨形成效果，DBM-MSN/38RM组中BV/TV、 Tb.N和Tb.Th的值均高于未修饰DBM组。

b.免疫荧光

对DBM-MSN/38RM支架和DBM空白支架进行股骨缺损修复的大鼠进行取材、固定、脱钙、脱水和切片。将骨切片分别与Runx2、OCN、Notch1孵育，4℃过夜。随后，用荧光偶联二抗在37℃孵育1小时。使用共聚焦激光显微镜(LSM780；Carl Zeiss)采集图像，Image J (NIH)对图像进行定量分析。结果如图13所示，DBM-MSN/38RM支架促进血管生成跟Notch 通路的激活有关。

c.DBM-MSN/38RM支架对骨再生的影响

4组支架修复的骨缺损大鼠处死前第9天注射二甲酚橙90mg/kg，第2天注射钙黄绿素 30mg/kg。荧光双标：硬组织切片依次放入乙醚乙二醇乙酸酯溶液中24h后，无水乙醇漂洗 10s封片，行激光共聚焦分析。钙黄绿素选用450-480nm波长(蓝光)激发，二甲酚橙选用510-560nm波长(绿光)激发，骨组织动态形态计量学分析指标包括骨形成速率(Boneformation rate/bone surface，BFR/BS)和矿质沉积率(Mineral apposition rate，MAR)。4 周后行二甲酚橙和钙黄绿素双荧光动态骨生成能力检测，结果如图14中A、B所示， DBM-MSN/38RM支架组骨生成能力更强。

d.血管造影

4组支架修复的骨缺损大鼠分别用2.5ml 10％水合氯醛处死后，打开胸腔，将头皮针插入左心室建立流入道，右心耳建立流出道。从左心室注射30ml肝素(100U/mL)、20ml10％中性福尔马林和20ml造影剂，4℃过夜保存，截取大鼠骨缺损的腿，4％多聚甲醛固定7天，加入 pH 7.2的EDTA溶液脱钙35天。采用Micro CT扫描图像，计算血管体积和血管表面积。结果如图15所示，Micro-CT血管造影观察发现用DBM-MSN/38RM支架修复后，大鼠骨血管更丰富，对骨血管体积和表面积定量分析，与未修饰的DBM支架修复效果相比， DBM-MSN/38RM支架修复股骨缺损后，DBM-MSN/38RM支架有更多的血管生成。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

序列表

<110> 中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院

<120> 一种PTP1B Y152结构肽、肽修饰的血管化骨缺损再生支架及其制备方法和应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 49

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Asp Ile Lys Ser Tyr Tyr Thr Val Arg Gln Leu Glu Leu Glu Asn Leu

1 5 10 15

Thr Thr Gln Glu Thr Arg Glu Ile Leu His Phe His Tyr Thr Thr Trp

20 25 30

Pro Asp Phe Gly Val Pro Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg

35 40 45

Arg