检测肺炎支原体、肺炎衣原体及腺病毒的引物探针组合及检测试剂盒

摘要

本发明涉及生物技术领域，特别涉及检测肺炎支原体、肺炎衣原体及腺病毒的引物探针组合及检测试剂盒。该引物探针组合包括：如SEQ ID NO：1～2所示的肺炎支原体的特异性引物对；如SEQ ID NO：3所示的肺炎支原体的特异性探针；如SEQ ID NO：4～5所示的肺炎衣原体的特异性引物对；如SEQ ID NO：6所示的肺炎衣原体的特异性探针；如SEQ ID NO：7～8所示的腺病毒的特异性引物对；如SEQ ID NO：9所示的腺病毒的特异性探针。本发明提供的引物和探针具有良好的特异性，结合real time PCR检测方法，能够实现对MP、CP和ADV的快速、准确、灵敏的鉴定。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及检测肺炎支原体、肺炎衣原体及腺病毒的引物探针组合及检测试剂盒。

背景技术

肺炎支原体(MP)是人类支原体肺炎的病原体。支原体肺炎的病理改变以间质性肺炎为主，有时并发支气管肺炎，称为原发性非典型性肺炎。主要经飞沫传染，潜伏期2～3周，发病率以青少年最高。临床症状较轻，甚至根本无症状，若有也只是头痛、咽痛、发热、咳嗽等一般的呼吸道症状，但也有个别死亡报道。一年四季均可发生，但多在秋冬时节。

肺炎衣原体(CP)根据遗传性和生物学特性，可分为TWAR、考拉和马3个生物变种。人类肺炎衣原体感染呈世界性流行，不分地域、不受种族和年龄限制。

腺病毒(ADV)有6个亚型(A～F)和55个不同的血清型(按病毒基因组分型)。已知约20余种血清型可感染人类。病毒为直径70～80纳米的20面体衣壳，内核含双股DNA。对热和酸不稳定。由于不含脂质，对胆盐等脂质溶解剂抵抗力强，故能在肠道中存活。不同亚型可引起不同感染。

MP、CP和ADV的检测方法多种多样，分离培养是微生物检测的“金标准”，该法虽然可靠，但耗时、费力不能满足快速检测的需要，常用的免疫荧光法虽然具有一定特异性和敏感性，但由于抗体的种类和浓度的影响，结果不稳定，有时会出现假阳性。为克服上述问题，多重荧光定量RT-PCR技术被用来诊断MP、CP和ADV的感染，这种方法具有快速、敏感、特异性强等特点，探针具有高度保守型，大大地提高了检测效率。

但是目前，针对MP、CP和ADV鉴定的基因片段的选择和引物探针的涉及存在不合理的现象，导致多数检测试剂无法实现准确、快速、灵敏的检测。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了检测肺炎支原体、肺炎衣原体及腺病毒的引物探针组合及检测试剂盒。该引物探针组合能够准确、快速、灵敏的实现对MP、CP和ADV的鉴定。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种引物探针组合，其该组合包括：

如SEQ ID NO：1～2所示的肺炎支原体的特异性引物对；

如SEQ ID NO：3所示的肺炎支原体的特异性探针；

如SEQ ID NO：4～5所示的肺炎衣原体的特异性引物对；

如SEQ ID NO：6所示的肺炎衣原体的特异性探针；

如SEQ ID NO：7～8所示的腺病毒的特异性引物对；

如SEQ ID NO：9所示的腺病毒的特异性探针。

本发明提供的引物和探针能够在一个反应体系中，同时检测多个靶标，具有良好的准确性、特异性和灵敏度，并且能够节约成本。由于本发明采用了特异性较高的探针应用于该试剂盒，可以对未知样本中的肺炎支原体、肺炎衣原体及腺病毒核酸进行快速检测，为诊断肺炎支原体、肺炎衣原体及腺病毒核酸提供可靠的实验依据，解决了现有试剂盒效率低、特异性差和灵敏度低的技术问题。

作为优选，SEQ ID NO：1～2所示引物对扩增的片段如SEQ ID NO:13所示；

SEQ ID NO：4～5所示引物对扩增的片段如SEQ ID NO:14所示；

SEQ ID NO：7～8所示引物对扩增的片段如SEQ ID NO:15所示。

作为优选，该组合还包括：

如SEQ ID NO：10～11所示的内标扩增引物对；

如SEQ ID NO：12所示的内标探针。

作为优选，探针的3’端连接淬灭基团，5’端连接荧光基团；其中：

如SEQ ID NO：3所示探针的5’端连接FAM荧光基团；

如SEQ ID NO：6所示探针的5’端连接CY5荧光基团；

如SEQ ID NO：9所示探针的5’端连接ROX荧光基团；

如SEQ ID NO：12所示探针的5’端连接HEX荧光基团。

本发明还提供了该引物探针组合在制备检测肺炎支原体、肺炎衣原体及腺病毒的试剂盒中的应用。

本发明还提供了一种肺炎支原体、肺炎衣原体及腺病毒的检测试剂盒，包括上述引物探针组合及Real time PCR反应试剂。

作为优选，Real time PCR反应试剂包括dNTPs、UDG酶、Taq酶、MgCl

其中，dNTPs的浓度为1～20mM、UDG酶的浓度为0.5～10U/μL、Taq酶的浓度为1～10U/μL、MgCl

优选地，dNTPs的浓度为10mM、UDG酶的浓度为1U/μL、Taq酶的浓度为5U/μL、MgCl

作为优选，该检测试剂盒还包括阴性对照和阳性对照；其中，阴性对照为无菌水，阳性对照为人工合成的浓度1×10

作为优选，Real time PCR的反应体系为：

优选地，Real time PCR的反应体系为：

作为优选，Real time PCR的反应程序为：

本发明还提供了一种非诊断或治疗目的检测肺炎支原体、肺炎衣原体及腺病毒的方法：采用本发明中的引物探针组合对样品进行检测Real time PCR，根据检测的Ct值判断样品是否被肺炎支原体、肺炎衣原体或者腺病毒中的一种或多种感染；

所述判断包括：

SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6与SEQ ID NO：9所示探针通道CT值＞36或者无CT值，且SEQ ID NO：12所示探针通道的CT值≤35，报告检测结果为阴性；

SEQ ID NO：3所示探针通道的CT值≤38，但SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：9所示探针通道CT值＞38，报告为肺炎支原体阳性；

SEQ ID NO：6所示探针通道的CT值≤36，但SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：9所示探针通道CT值＞36，报告为肺炎衣原体阳性；

SEQ ID NO：9所示探针通道的CT值≤36，但SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：6所示探针通道CT值＞36，报告为腺病毒阳性；

当SEQ ID NO：12所示探针通道CT值＞35，出现阴性对照有CT值或呈典型S扩增曲线、阳性对照无CT值或无扩增曲线两种情况中的任一种时，该检测结果无效，应查找并排除原因，并重复试验。

本发明提供了检测肺炎支原体、肺炎衣原体及腺病毒的引物探针组合及检测试剂盒。该引物探针组合包括：如SEQ ID NO：1～2所示的肺炎支原体的特异性引物对；如SEQ IDNO：3所示的肺炎支原体的特异性探针；如SEQ ID NO：4～5所示的肺炎衣原体的特异性引物对；如SEQ ID NO：6所示的肺炎衣原体的特异性探针；如SEQ ID NO：7～8所示的腺病毒的特异性引物对；如SEQ ID NO：9所示的腺病毒的特异性探针。本发明具有如下技术效果：

本发明提供的引物和探针具有良好的特异性，结合real time PCR检测方法，能够实现对MP、CP和ADV的快速、准确、灵敏的鉴定。实验表明，本发明的引物探针的检测MP的最低检测限为10copies/mL，CP的最低检测限为50copies/mL，ADV的最低检测限为20copies/mL。

附图说明

图1肺炎支原体梯度稀释图；

图2腺病毒梯度稀释图；

图3肺炎衣原体梯度稀释图。

具体实施方式

本发明公开了检测肺炎支原体、肺炎衣原体及腺病毒的引物探针组合及检测试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试材、仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1肺炎支原体、肺炎衣原体及腺病毒三联核酸检测试剂盒的制备

试剂盒中的引物、探针序列如下表1所示：

表1引物、探针序列

试剂盒中还包括：10mM的dNTPs，1U/μL的UDG酶，5U/μL的Taq酶，50mM的MgCl

实施例2本发明试剂盒的检测方法

本发明的检测方法为Real time RT-PCR，Real Time RT-PCR反应过程为：

每个检测体系的组成如表2：

表2检测体系

荧光检测通道选择：

(1)选择FAM通道(ReporTer：FAM，QuenCher：none)，检测肺炎支原体；(2)选择CY5通道(ReporTer：CY5，QuenCher：none)，检测肺炎衣原体；(3)选择ROX通道(ReporTer：ROX，QuenCher：none)，检测腺病毒；(4)选择HEX通道，检测内标；(5参比荧光(PAssiveReferenCe)设置为none。荧光定量实时反应条件如下表3所示。

表3：荧光定量实时PCR反应条件

反应结束后，仪器自动保存结果，利用仪器自带的软件进行自动分析或手动调节基线的开始值、结束值以及阂值线值进行分析，然后记录样本CT值和定值结果。具体测试结果分析如下：

SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：9所示探针通道无荧光值，且SEQ ID NO：12所示探针通道的CT值≤35，报告检测结果为阴性；

SEQ ID NO：3所示探针通道的CT值≤38，但SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：9所示探针通道CT值＞38，报告为肺炎支原体阳性；

SEQ ID NO：6所示探针通道的CT值≤36，但SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：9所示探针通道CT值＞36，报告为肺炎衣原体阳性；

SEQ ID NO：9所示探针通道的CT值≤36，但SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：6所示探针通道CT值＞36，报告为腺病毒阳性；

当SEQ ID NO：12所示探针通道CT值＞35，出现阴性对照有CT值或呈典型S扩增曲线、阳性对照无CT值或无扩增曲线两种情况中的任一种时，该检测结果无效，应查找并排除原因，并重复试验。

SEQ ID NO：1～2所示引物对扩增的片段如SEQ ID NO:13所示：

ACCGACCAAAAATGGTCCTACACCGACTTACAGTCGGATCAAACCAAGCTGAACCTCCCCGCTTACGGTGAGGTGAATGGGTTGTTGAATCCGGCGTTGGTGGAAACCTATTTTGGGAACACGCGAGCGG

SEQ ID NO：4～5所示引物对扩增的片段如SEQ ID NO:14所示：

AAACAAACCCAAGGGCTATAAAGGCGTTGCTTTCCCCTTGCCAACAGACGCTGGCGTAGCAACAGCTACTGGAACAAAGTCTGCGACCAT

SEQ ID NO：7～8所示引物对扩增的片段如SEQ ID NO:15所示。

AAGATGGCCACCCCATCGATGATGCCCCAATGGGCATACATGCACATCGCCGGACAGGATGCTTCGGAGTACCTGAGTCCGGGTCTGGTGCAGTTCGCCCGTGCAACAGACACCTACTTCAGTATGGGGAACAAGTTTAGAAACCCCACA

实施例3本发明试剂盒的可行性试验

1、灵敏度评估试验

(1)肺炎支原体、肺炎衣原体及腺病毒三联核酸检测试剂配制：通过采用实施例1的方法制备肺炎支原体、肺炎衣原体及腺病毒三联核酸检测。

(2)病原体样本提取

将管中5个不同浓度的肺炎支原体、肺炎衣原体及腺病毒人咽拭子洗脱液用移液器混匀，取出100μL于一个新的离心管中，12000rpm离心5min，小心弃去上清；向沉淀中加入200μL的细菌裂解液(来自北京百奥莱博科技有限公司)，充分混匀，100℃水浴5min，10000rpm离心5min备用。

(3)样本检测

将25μL处理好的标本上清加入到肺炎支原体、肺炎衣原体及腺病毒三联核酸检测试剂反应管中，每个浓度3个复孔，同时加入25μL纯净水到检测液中作为阴性对照，按照实施例2中检测方法进行检测。

(4)结果分析

通过采用实施例1制备的试剂盒和采用实施例2的检测方法对肺炎支原体、肺炎衣原体及腺病毒三联核酸检测试剂各浓度梯度(图1-3)的样本进行检测，表明本检测方法的检测灵敏度(LOD)肺炎支原体为10copies/mL，肺炎衣原体为50copies/mL，腺病毒为20copies/mL，具体数据表4、表5、表6。

表4：肺炎支原体检测限评估

表5:腺病毒检测限评估

表6:肺炎衣原体检测限评估

2、与其它疾病的交叉反应情况

(1)肺炎支原体、肺炎衣原体及腺病毒三联核酸检测试剂配制，通过采用实施例1的方法制备肺炎支原体、肺炎衣原体及腺病毒三联核酸检测试剂。

(2)交叉病原体样本提取

将管中的肺炎支原体、肺炎衣原体、腺病毒、金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌、变性杆菌、肺炎链球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌咽拭子洗脱液用移液器混匀，取出100μL于一个新的离心管中，12000rpm离心5min，小心弃去上清；向沉淀中加入200μL的病毒裂解液，充分混匀，100℃水浴5min，10000rpm离心5min备用。

(3)样本检测

将25μL处理好的标本上清加入到肺炎支原体、肺炎衣原体及腺病毒三联核酸检测反应管中，同时加入25μL纯净水到检测液中作为阴性对照，提取的肺炎支原体、肺炎衣原体、腺病毒作为阳性对照试验，按照实施例2中检测方法进行检测。

(4)结果分析

通过采用实施例1制备的试剂盒和采用实施例2的检测方法对肺炎支原体、肺炎衣原体、腺病毒以外的其它病原体进行检测，结果表明：本发明试剂盒对肺炎支原体、肺炎衣原体、腺病毒阳性对照为阳性，阴性对照为阴性，金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌、变性杆菌、肺炎链球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌等病原体感染样本无交叉反应，表明其具有高特异性，具体结果如表6。

表6：交叉反应实验

3、对潜在外源物质的抗干扰性

(1)肺炎支原体、肺炎衣原体及腺病毒三联核酸检测试剂配制：通过采用实施例1的方法制备肺炎支原体、肺炎衣原体及腺病毒三联核酸检测试剂配制。

(2)样本处理

选取肺炎支原体、肺炎衣原体及腺病毒低值样本，浓度值均为100copies/mL。同时将干扰物质以3倍的峰值浓度(Cmax)加入到对应病毒样本中，采用实施例3中交叉反应方法处理样本，按照实施例2中检测方法进行检测。

(3)结果分析

干扰判断：干扰率％小于项目所在行标允许的正确度偏倚(设定为10％)，即可判断为通过。

干扰率计算公式：(干扰样本浓度-对照样本浓度)/对照样本浓度×100％。

试验表明，当样本中含有利巴韦林、薄荷脑、替诺福韦、拉米夫定、苯唑卡因、阿德福韦醋，地塞米松，恩替卡韦、肾上腺素、扎那米韦(200μg/mL)等常见的抗病毒药物时，本发明试剂盒的检测灵敏度不会受到明显干扰，具体见表7。

表7：外源物质的抗干扰性实验

4、对潜在内源物质的抗干扰性

(1)肺炎支原体、肺炎衣原体及腺病毒三联核酸检测试剂配制：通过采用实施例1的方法制备肺炎支原体、肺炎衣原体及腺病毒三联核酸检测试剂。

(2)样本处理

选取肺炎支原体、肺炎衣原体及腺病毒低值样本，浓度值均为100copies/mL。同时将干扰物质以3倍的峰值浓度(Cmax)加入到对应病毒样本中，采用实施例3中交叉反应方法处理样本，按照实施例2中检测方法进行检测。同时将200mg/dL血红蛋白、3000mg/dL甘油三酯、20mg/dL胆红素等干扰物质浓度加入到对应病毒样本中，采用实施例3中交叉反应方法处理样本，按照实施例2中检测方法进行检测。

(3)结果分析

干扰判断：干扰率％小于项目所在行标允许的正确度偏倚(设定为10％)，即可判断为通过。

干扰率计算公式：(干扰样本浓度-对照样本浓度)/对照样本浓度×100％。

试验表明，当样本中含有200mg/dL血红蛋白、3000mg/dL甘油三酯、20mg/dL胆红素等内源性干扰物质时，本发明试剂盒的检测灵敏度不会受到明显干扰，具体见表8。

表8：内源物质的抗干扰性实验

实施例4

每个检测体系的组成、荧光检测通道选择与实施例2相同。

荧光定量实时反应条件如下表9所示。

表9：荧光定量实时PCR反应条件

检测方法：

(1)肺炎支原体、肺炎衣原体及腺病毒三联核酸检测试剂配制：通过采用实施例1的方法制备肺炎支原体、肺炎衣原体及腺病毒三联核酸检测。

(2)病原体样本提取

将管中5个不同浓度的肺炎支原体、肺炎衣原体及腺病毒人咽拭子洗脱液用移液器混匀，取出100μl于一个新的离心管中，12000rpm离心5min，小心弃去上清；向沉淀中加入200μl的细菌裂解液(来自北京百奥莱博科技有限公司)，充分混匀，100℃水浴5min，10000rpm离心5min备用。

(3)样本检测

将25μl处理好的标本上清加入到肺炎支原体、肺炎衣原体及腺病毒三联核酸检测试剂反应管中，每个浓度20个复孔，同时加入25μl纯净水到检测液中作为阴性对照，按照实施例2中检测方法进行检测。

(4)结果分析

通过采用实施例1制备的试剂盒和采用实施例4的检测方法对肺炎支原体、肺炎衣原体及腺病毒三联核酸检测试剂各浓度梯度的样本进行检测，表明本检测方法的检测灵敏度(LOD)肺炎支原体为10copies/mL，肺炎衣原体为50copies/mL，腺病毒为20copies/mL，具体数据表9、10。

表9、肺炎支原体、肺炎衣原体及腺病毒的引物探针组合

表10肺炎支原体、肺炎衣原体及腺病毒的检测限评估

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 郑州安图生物工程股份有限公司

<120> 检测肺炎支原体、肺炎衣原体及腺病毒的引物探针组合及检测试剂盒

<130> MP2019800

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggtcctac accgacttam agtcg 25

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcccaaaata ggtttccacc aacg 24

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccattcacct caccrtaagc ggggaggt 28

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gggctataaa ggcgttgctt t 21

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agactttgtt ccagtagctg ttgct 25

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccttgccaac agacgctggc gt 22

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cccatcgatg atgcccca 18

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tccccatact gaagtaggtg tct 23

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cgccggacag gatgcttcgg agtacc 26

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gaaggctcat ggcaagaaag t 21

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ctcactcagt gtggcaaagg t 21

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ccttgaggtt gtccaggtga gccag 25

<210> 13

<211> 130

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

accgaccaaa aatggtccta caccgactta cagtcggatc aaaccaagct gaacctcccc 60

gcttacggtg aggtgaatgg gttgttgaat ccggcgttgg tggaaaccta ttttgggaac 120

acgcgagcgg 130

<210> 14

<211> 90

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

aaacaaaccc aagggctata aaggcgttgc tttccccttg ccaacagacg ctggcgtagc 60

aacagctact ggaacaaagt ctgcgaccat 90

<210> 15

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

aagatggcca ccccatcgat gatgccccaa tgggcataca tgcacatcgc cggacaggat 60

gcttcggagt acctgagtcc gggtctggtg cagttcgccc gtgcaacaga cacctacttc 120

agtatgggga acaagtttag aaaccccaca 150