使用成对的CRISPR切口酶核糖核蛋白修饰免疫相关基因组基因座

摘要

经改造为靶向免疫相关基因组基因座的成对的CRISPR切口酶核糖核蛋白，以及使用所述核糖核蛋白修饰免疫相关基因组基因座的方法。

说明书

本申请要求于2018年4月13日提交的美国临时申请序列号62/657,488的优先权，所述美国临时申请的公开内容在此整体引入作为参考。

本申请含有序列表，其已经由EFS-Web以ASCII格式提交，并且在此整体引入作为参考。于2019年4月10日创建的ASCII副本命名为P18_061_SL.txt，且大小为19,607字节。

本公开内容涉及经改造为靶向免疫相关基因组基因座的成对的CRISPR切口酶核糖核蛋白，以及用于修饰免疫相关基因组基因座的方法。

免疫疗法是强大的治疗选项，其利用免疫系统以对抗癌症、感染和其它疾病。传统的免疫疗法包括使用物质如疫苗、单克隆抗体、细胞因子等，以刺激或压制免疫系统和其它化合物。近年来，基因组编辑用于修饰细胞的DNA，以改造功能更好的细胞用于在免疫疗法中使用。锌指核酸酶和CRISPR核酸酶用于改造对抗疾病的细胞。然而，这些基因组靶向技术受低靶向频率和脱靶效应阻碍。因此，需要在免疫相关基因组基因座处改进和更精确的基因组编辑。

在本公开内容的各个方面，提供了用于修饰真核细胞中的免疫相关基因组基因座的方法。该方法包括将包含一对引导RNA的成簇规律间隔短回文重复（CRISPR）切口酶核糖核蛋白（RNP）引入真核细胞内，所述引导RNA设计为与免疫相关基因组基因座中的靶序列杂交，使得通过CRISPR切口酶RNP产生的双链断裂的修复导致免疫相关基因组基因座的修饰。

本公开内容的另一个方面涉及组合物，其包含CRISPR切口酶和经改造为靶向免疫相关基因组基因座的一对引导RNA。

本公开内容的另一个方面涉及治疗受试者中的癌症的方法。该方法包括根据本文所述的方法修饰离体真核细胞中的免疫相关基因组基因座，以制备修饰的真核细胞，并且将修饰的真核细胞递送给受试者。

其它目的和特点将是一定程度上显而易见的，而一定程度上在下文指出。

本公开内容提供了经改造为靶向免疫相关基因组基因座的成对的CRISPR切口酶核糖核蛋白，以及使用所述成对的CRISPR切口酶RNP修饰免疫相关基因座的方法。本文公开的组合物和方法可以用于靶向免疫疗法，例如癌症免疫疗法。

本公开内容的一个方面提供了靶向涉及免疫功能的基因组基因座的成对的CRISPR切口酶核糖核糖核蛋白（RNP）。成对的CRISPR切口酶RNP包含至少一对偏移引导RNA，其设计为与目标基因组基因座中的靶位点杂交，使得切口酶的协调切开导致基因组基因座中的双链断裂，当所述双链断裂通过细胞DNA修复过程修复时，导致对基因组基因座的修饰。

（a）靶基因组基因座

一般而言，成对的CRISPR切口酶RNP可以被改造为靶向免疫相关基因组基因座。基因组基因座可以例如与免疫细胞的效应子功能的丧失相关联，并且有利地与免疫细胞活化状态不同、分开或解开或独立。可替代地，基因组基因座可以例如与免疫细胞活化相关联，并且有利地与免疫细胞功能障碍状态不同、分开或解开或独立。因此，在各个实施方案中，例如，可以靶向功能障碍的基因座，同时使活化基因座完整。

在其它实施方案中，成对的CRISPR切口酶RNP可以被改造为靶向选自以下的基因组基因座：2B4（CD244）、4-1BB（CD137）、A2aR、AAVS1、ACTB、ALB、B2M、B7.1、B7.2、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、BAFFR、BCL11A、BLAME（SLAMF8）、BTLA、嗜乳脂蛋白、CCR5、CD100（SEMA4D）、CD103、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、CD150、IPO-3）、CD160、CD160（BY55）、CD18、CD19、CD2、CD27、CD28、CD29、CD30、CD4、CD40、CD47、CD48、CD49a、CD49D、CD49f、CD52、CD69、CD7、CD83、CD84、CD8α、CD8β、CD96（Tactile）、CDS、CEACAM1、CRTAM、CTLA4、CXCR4、DGK、DGKA、DGKB、DGKD、DGKE、DGKG、DGKI、DGKK、DGKQ、DGKZ、DHFR、DNAM1（CD226）、EP2/4受体、腺苷受体包括A2AR、FAS、FASLG、GADS、GITR、GM-CSF、gp49B、HHLA2、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HIV-LTR（长末端重复）、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-I、HVEM、HVEM、IA4、ICAM-1、ICOS、ICOS、ICOS（CD278）、IFN-α/β/γ、IL-1 β、IL-12、IL-15、IL-18、IL-23、IL2R β、IL2R γ、IL2RA、IL-6、IL7R α、ILT-2、ILT-4、ITGA4、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB1、ITGB2、ITGB7、KIR家族受体、KLRG1、LAIR-1、LAT、LIGHT、LTBR、Ly9（CD229）、MNK1/2、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80（KLRF1）、OX2R、OX40、PAG/Cbp、PD-1、PD-L1、PD-L2、PGE2受体、PIR-B、PPP1R12C、PSGL1、PTPN2、RANCE/RANKL、ROSA26、SELPLG（CD162）、SIRPα（CD47）、SLAM（SLAMF1、SLAMF4（CD244、2B4）、SLAMF5、SLAMF6（NTB-A、Ly108）、SLAMF7、SLP-76、TGFBR2、TIGIT、TIM-1、TIM-3、TIM-4、TMIGD2、TRA、TRAC、TRB、TRD、TRG、TNF、TNF-α、TNFR2、TUBA1、VISTA、VLA1或VLA-6。

在一些实施方案中，成对的CRISPR切口酶RNP可以被改造为靶向表A中列出的免疫相关基因组基因座。

在一个具体实施方案中，成对的CRISPR切口酶RNP被改造为靶向PD-1基因组基因座。在另一个具体实施方案中，成对的CRISPR切口酶RNP被改造为靶向CTLA4基因组基因座。在另一个具体实施方案中，成对的CRISPR切口酶RNP被改造为靶向TIM-3基因组基因座。在另一个具体实施方案中，成对的CRISPR切口酶RNP被改造为靶向TRAC基因组基因座。

（b）CRISPR切口酶

CRISPR切口酶通过核酸酶结构域之一的失活而衍生自CRISPR核酸酶。在具体实施方案中，CRISPR切口酶可以衍生自II型CRISPR核酸酶。例如，II型CRISPR核酸酶可以是Cas9蛋白。合适的Cas9核酸酶包括化脓性链球菌（

CRISPR核酸酶包含两个核酸酶结构域。例如，Cas9核酸酶包含切割引导RNA互补链的HNH结构域和切割非互补链的RuvC结构域；Cpf1核酸酶包含RuvC结构域和NUC结构域；并且Cas13a核酸酶包含两个HNEPN结构域。当两个核酸酶结构域均是有功能的时，CRISPR核酸酶引入双链断裂。任一核酸酶结构域均可以通过一个或多个突变和/或缺失而失活，从而产生在双链序列的一条链中引入单链断裂的变体。例如，Cas9核酸酶的RuvC结构域中的一个或多个突变（例如D10A、D8A、E762A和/或D986A）产生HNH切口酶，其切开引导RNA互补链；并且Cas9核酸酶的HNH结构域中的一个或多个突变（例如H840A、H559A、N854A、N856A和/或N863A）产生RuvC切口酶，其切开引导RNA非互补链。相当的突变可以将Cpf1和Cas13a核酸酶转换为切口酶。

在具体实施方案中，CRISPR切口酶可以是II型CRISPR切口酶、V型CRISPR切口酶或VI型CRISPR切口酶。例如，当CRISPR切口酶是II型切口酶时，CRISPR切口酶可以是Cas9切口酶，例如SpCas9、FnCas9、SaCas9、StCas9、SpaCas9、CjCas9、NmCas9或NcCas9。作为另一实例，当CRISPR切口酶是V型切口酶时，CRISPR切口酶可以是Cpf1切口酶，例如FnCpf1、AsCpf1或LbCpf1。作为又一个实例，CRISPR切口酶可以是Cas13a切口酶，例如LwaCas13a或LshCas13a。应理解，前述CRISPR切口酶包括功能上相关的突变，以便将核酸酶转换为切口酶，如前一段中所述。例如，Cas9切口酶可以是Cas9-D10A切口酶或Cas9-H840A切口酶。在一个特定实施方案中，Cas9切口酶是SpCas9-D10A切口酶。在另一个特定实施方案中，Cas9切口酶是SpCas9-H840A切口酶。

CRISPR切口酶可以进一步包含至少一个核定位信号、至少一个细胞穿透结构域、至少一个标记物结构域和/或至少一个染色质破坏结构域。至少一个核定位信号、至少一个细胞穿透结构域、至少一个标记物结构域和/或至少一个染色质破坏结构域可以位于N末端、C末端和/或内部位置（条件是不影响CRISPR切口酶的功能）。

核定位信号的非限制性实例包括PKKKRKV（SEQ ID NO:1）、PKKKRRV（SEQ ID NO:2）、KRPAATKKAGQAKKKK（SEQ ID NO:3）、YGRKKRRQRRR（SEQ ID NO:4）、RKKRRQRRR（SEQ IDNO:5）、PAAKRVKLD（SEQ ID NO:6）、RQRRNELKRSP（SEQ ID NO:7）、VSRKRPRP（SEQ ID NO:8）、PPKKARED（SEQ ID NO:9）、PQPKKKPL（SEQ ID NO:10）、SALIKKKKKMAP（SEQ ID NO:11）、PKQKKRK（SEQ ID NO:12）、RKLKKKIKKL（SEQ ID NO:13）、REKKKFLKRR（SEQ ID NO:14）、KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK（SEQ ID NO:15）、RKCLQAGMNLEARKTKK（SEQ ID NO:16）、NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY（SEQ ID NO:17）和RMRIZFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV（SEQ ID NO:18）。

合适的细胞穿透结构域的实例包括但不限于GRKKRRQRRRPPQPKKKRKV（SEQ ID NO:19）、PLSSIFSRIGDPPKKKRKV（SEQ ID NO:20）、GALFLGWLGAAGSTMGAPKKKRKV（SEQ ID NO:21）、GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV（SEQ ID NO:22）、KETWWETWWTEWSQPKKKRKV（SEQ ID NO:23）、YARAAARQARA（SEQ ID NO:24）、THRLPRRRRRR（SEQ ID NO:25）、GGRRARRRRRR（SEQ IDNO:26）、RRQRRTSKLMKR（SEQ ID NO:27）、GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL（SEQ ID NO:28）、KALAWEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKCEA（SEQ ID NO:29）和RQIKIWFQNRRMKWKK（SEQ ID NO:30）。

标记物结构域包括荧光蛋白和纯化或表位标签。合适的荧光蛋白包括但不限于绿色荧光蛋白（例如GFP、eGFP、GFP-2、tagGFP、turboGFP、Emerald、Azami Green、MonomericAzami Green、CopGFP、AceGFP、ZsGreen1），黄色荧光蛋白（例如YFP、EYFP、Citrine、Venus、YPet、PhiYFP、ZsYellow1），蓝色荧光蛋白（例如BFP、EBFP、EBFP2、Azurite、mKalama1、GFPuv、Sapphire、T-sapphire），青色荧光蛋白（例如ECFP、Cerulean、CyPet、AmCyan1、Midoriishi-Cyan），红色荧光蛋白（例如mKate、mKate2、mPlum、DsRed单体、mCherry、mRFP1、DsRed-Express、DsRed2、DsRed-Monomer、HcRed-Tandem、HcRed1、AsRed2、eqFP611、mRasberry、mStrawberry、Jred），以及橙色荧光蛋白（例如mOrange、mKO、Kusabira-Orange、Monomeric Kusabira-Orange、mTangerine、tdTomato）。合适的纯化标签或表位标签的非限制性实例包括6xHis、FLAG®、 HA、GST、Myc等等。促进CRISPR复合物的检测或富集的异源融合物的非限制性实例包括链霉抗生物素蛋白（Kipriyanov等人，Human Antibodies，1995，6（3）：93-101.），抗生物素蛋白（Airenne等人，Biomolecular Engineering，1999，16（1-4）：87-92），抗生物素蛋白的单体形式（Laitinen等人，Journal of Biological Chemistry，2003，278（6）：4010-4014），在重组生产过程中促进生物素化的肽标签（Cull等人，Methodsin Enzymology，2000，326：430-440）。

合适的染色质破坏结构域的实例包括衍生自高迁移率族（HMG）蛋白（例如HMGB、HMGN蛋白）的核小体相互作用肽，组蛋白H1变体（例如，组蛋白H1.0、H1.1、H1.2、H1.3、H1.4、H1.5、H1.6、H1.7、H1.8、H1.9和H.1.10）的中心球状结构域，或染色质重塑复合物（例如SWI/SNF、ISWI、CHD、Mi-2/NuRD、INO80、SWR1或 RSC复合物）的DNA结合结构域。在一些情况下，染色质破坏结构域可以是HMGB1 A盒结构域、HMGB2 A盒结构域、HMGB3 A盒结构域、HMGN1肽、HMGN2肽、HMGN3肽、HMGN3肽、HMGN4肽、HMGN5肽或人组蛋白H1中心球状结构域肽。

至少一个核定位信号、至少一个细胞穿透结构域、至少一个标记物结构域和/或至少一个染色质破坏结构域可以经由一个或多个化学键（例如，共价键）与CRISPR切口酶直接连接。可替代地，至少一个核定位信号、至少一个细胞穿透结构域、至少一个标记物结构域和/或至少一个染色质破坏结构域或一个或多个异源结构域可以经由一个或多个接头与CRISPR切口酶间接连接。合适的接头包括氨基酸，肽，核苷酸，核酸，有机接头分子（例如马来酰亚胺衍生物、N-乙氧基苄基咪唑、联苯-3,4',5-三羧酸、对氨基苄氧羰基等等），二硫化物接头和聚合物接头（例如PEG）。接头可以包括一个或多个间隔基团，包括但不限于亚烷基、亚烯基、亚炔基、烷基、烯基、炔基、烷氧基、芳基、杂芳基、芳烷基、芳烯基、芳炔基等等。接头可以是中性的，或者携带正电荷或负电荷。另外，接头可以是可切割的，使得在特定条件包括pH、温度、盐浓度、光、催化剂或酶下，连接接头与另一个化学基团的接头的共价键可以被断裂或切割。在一些实施方案中，接头可以是肽接头。肽接头可以是柔性氨基酸接头或刚性氨基酸接头。合适接头的另外实例是本领域众所周知的，并且设计接头的程序是可容易获得的（Crasto等人，Protein Eng.，2000，13（5）：309-312）。

在另外其它实施方案中，CRISPR切口酶可以通过一种或多种氨基酸取代、缺失和/或插入进行改造，以具有改善的靶向特异性、改善的保真度、改变的PAM特异性、减少的脱靶效应和/或增加的稳定性。改善靶向特异性、改善保真度和/或减少脱靶效应的一种或多种突变的非限制性实例包括N497A、R661A、Q695A、K810A、K848A、K855A、Q926A、K1003A、R1060A和/或D1135E（参考SpCas9的编号系统）。

（c）成对的引导RNA

成对的CRISPR切口酶RNP包含至少一对偏移引导RNA，其设计为与目标基因组基因座相反链上的靶序列杂交。引导RNA包含（i）CRISPR RNA（crRNA）和（ii）反式作用crRNA（tracrRNA）。crRNA包含在5'端处的引导序列，所述引导序列设计为与目标靶基因组基因座中的靶序列（即，前间隔区）杂交。靶序列与基因组的其余部分相比是独特的，并且与

成对的引导RNA进行改造，以与靶序列杂交，所述靶序列足够紧密接近，以在两个个别切开事件时产生双链断裂。靶区域包含两个靶序列和相邻的PAM序列。一对引导RNA这样进行配置，使得PAM序列面向外侧或位于靶区域的远端处（Ran等人，Cell，2013，154:1380-1389）。此类配置称为“PAM-向外（PAM-out）”取向。两个PAM序列之间的距离范围可以是约30个碱基对（bp）至约150 bp、约35 bp至约120 bp、或约40 bp至约80 bp。在各个实施方案中，两个PAM序列之间的距离可以为约35-40 bp、约40-45 bp、约45-50 bp、约50-55bp、约55-60 bp、约60-65 bp、约65-70 bp、约70-75 bp、约75-80 bp、约80-85 bp、约85-90bp、约90-95 bp或约95-100 bp。

每个crRNA包含与靶序列互补的5'引导序列。一般而言，crRNA与靶序列之间的互补性为至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%。在具体实施方案中，互补性是完全的（即100%）。在各个实施方案中，crRNA引导序列的长度范围可以是约17个核苷酸至约27个核苷酸。例如，crRNA引导序列可以是长度约17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27个核苷酸。在一些实施方案中，crRNA引导序列可以是长度约19、20或21个核苷酸。例如，crRNA引导序列可以是20个核苷酸长。在其它实施方案中，crRNA引导序列可以是长度约22、23或24个核苷酸。例如，crRNA引导序列可以是23个核苷酸长。在一个实施方案中，crRNA引导序列包含SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33或SEQ ID NO：34。

靶序列与PAM序列相邻。来自不同细菌物种的CRISPR蛋白识别不同的PAM序列。例如，PAM序列包括5'-NGG（SpCas9、FnCAs9）、5’-NGRRT（SaCas9）、5'-NNAGAAW（StCas9）、5'-NNNNGATT（NmCas9）、5-NNNNRYAC（CjCas9）和5'-TTTV（Cpf1），其中N定义为任何核苷酸，R定义为G或A，W定义为A或T，Y定义为C或T，且V定义为A、C或G。Cas9 PAM位于靶位点的3'，而cpf1 PAM位于靶位点的5'。

每个crRNA进一步包含在3'端处与tracrRNA的5'端互补的序列，使得crRNA的3'端可以与tracrRNA的5'端杂交。crRNA的3'序列的长度范围可以是约6至约50个核苷酸、约15至约25个核苷酸。在各个实施方案中，crRNA的3'序列范围可以是长度约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。

除在tracrRNA的5'端与crRNA的3'序列互补的序列之外，每个tracrRNA进一步包含可以形成二级结构（例如，至少一个茎环、发夹环等）的3'重复序列，其与CRISPR蛋白相互作用。在tracrRNA的3'端处的序列保持单链。一般而言，tracrRNA序列基于与野生型CRISPR蛋白相互作用的野生型tracrRNA。每个tracrRNA的范围可以是长度约50个核苷酸至约300个核苷酸。在各个实施方案中，tracrRNA的范围可以是长度约50至约90个核苷酸、约90至约110个核苷酸、约110至约130个核苷酸、约130至约150个核苷酸、约150至约170个核苷酸、约170至约200个核苷酸、约200至约250个核苷酸、或约250至约300个核苷酸。

每个引导RNA可以包含两个分开的分子：crRNA和tracrRNA。可替代地，每个引导RNA可以是单个分子，其中crRNA连接到tracrRNA。例如，环或茎环可以用于连接crRNA和tracrRNA。

引导RNA可以化学、酶促或其组合来合成。例如，可以使用标准的基于亚磷酰胺的固相合成方法合成引导RNA。可替代地，可以通过将编码引导RNA的DNA可操作地连接至由噬菌体RNA聚合酶识别的启动子控制序列，在体外合成引导RNA。合适的噬菌体启动子序列的实例包括T7、T3、SP6启动子序列或其变化。在一些实施方案中，crRNA是化学合成的，而tracrRNA是酶促合成的。

每个引导RNA可以包含标准核糖核苷酸和/或修饰的核糖核苷酸。在一些实施方案中，引导RNA可以包含标准或修饰的脱氧核糖核苷酸。在其中酶促合成引导RNA的实施方案中，引导RNA一般包含标准核糖核苷酸。在其中化学合成引导RNA的实施方案中，引导RNA可以包含标准或修饰的核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸。修饰的核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸包括碱基修饰（例如假尿苷、2-硫代尿苷、N6-甲基腺苷等等）和/或糖修饰（例如2'-O-甲基、2'-氟、2'-氨基、锁核酸（LNA）等等）。引导RNA的主链也可以被修饰为包含硫代磷酸酯键、硼烷磷酸酯键或肽核酸。

在其它实施方案中，引导RNA可以进一步包含至少一种可检测标记。可检测标记可以是荧光团（例如，FAM、TMR、Cy3、Cy5、Texas Red、Oregon Green、Alexa Fluors、Halo标签或合适的荧光染料），检测标签（例如生物素、洋地黄毒苷等等），量子点或金颗粒。

（d）具体实施方案

在某些实施方案中，成对的CRISPR切口酶RNP包含（i）与包含SEQ ID NO：31的引导RNA复合的Cas9-D10A（+ NLS）、以及（ii）与包含SEQ ID NO：32的引导RNA复合的Cas9-D10A（+NLS）。在其它实施方案中，成对的CRISPR切口酶RNP包含（i）与包含SEQ ID NO：33的引导RNA复合的Cas9-D10A（+ NLS）、以及（ii）与包含SEQ ID NO：34的引导RNA复合的Cas9-D10A（+NLS）。在其它实施方案中，成对的CRISPR切口酶RNP包含（i）与包含SEQ ID NO：33的引导RNA复合的Cas9-D10A（+ NLS）、以及（ii）与包含SEQ ID NO：32的引导RNA复合的Cas9-D10A（+NLS）。在其它实施方案中，成对的CRISPR切口酶RNP包含（i）与包含SEQ ID NO：39的引导RNA复合的Cas9-D10A（+ NLS）、以及（ii）与包含SEQ ID NO：40的引导RNA复合的Cas9-D10A（+NLS）。在其它实施方案中，成对的CRISPR切口酶RNP包含（i）与包含SEQ ID NO：41的引导RNA复合的Cas9-D10A（+ NLS）、以及（ii）与包含SEQ ID NO：42的引导RNA复合的Cas9-D10A（+NLS）。在其它实施方案中，成对的CRISPR切口酶RNP包含（i）与包含SEQ ID NO：43的引导RNA复合的Cas9-D10A（+ NLS）、以及（ii）与包含SEQ ID NO：44的引导RNA复合的Cas9-D10A（+NLS）。在其它实施方案中，成对的CRISPR切口酶RNP包含（i）与包含SEQ ID NO：45的引导RNA复合的Cas9-D10A（+ NLS）、以及（ii）与包含SEQ ID NO：46的引导RNA复合的Cas9-D10A（+NLS）。在其它实施方案中，成对的CRISPR切口酶RNP包含（i）与包含SEQ ID NO：47的引导RNA复合的Cas9-D10A（+ NLS）、以及（ii）与包含SEQ ID NO：48的引导RNA复合的Cas9-D10A（+NLS）。在其它实施方案中，成对的CRISPR切口酶RNP包含（i）与包含SEQ ID NO：49的引导RNA复合的Cas9-D10A（+ NLS）、以及（ii）与包含SEQ ID NO：50的引导RNA复合的Cas9-D10A（+NLS）。在其它实施方案中，成对的CRISPR切口酶RNP包含（i）与包含SEQ ID NO：51的引导RNA复合的Cas9-D10A（+ NLS）、以及（ii）与包含SEQ ID NO：52的引导RNA复合的Cas9-D10A（+NLS）。在其它实施方案中，成对的CRISPR切口酶RNP包含（i）与包含SEQ ID NO：53的引导RNA复合的Cas9-D10A（+ NLS）、以及（ii）与包含SEQ ID NO：54的引导RNA复合的Cas9-D10A（+NLS）。在其它实施方案中，成对的CRISPR切口酶RNP包含（i）与包含SEQ ID NO：55的引导RNA复合的Cas9-D10A（+ NLS）、以及（ii）与包含SEQ ID NO：56的引导RNA复合的Cas9-D10A（+NLS）。

本公开内容的一个进一步方面提供了试剂盒，其包含如上文节段（I）中所述的成对的CRISPR切口酶RNP。在一些实施方案中，CRISPR切口酶可以与成对的引导RNA各自复合，并且作为即用型RNP提供。在其它实施方案中，CRISPR切口酶和成对的引导RNA各自可以对于最终用户分开提供，以在使用前复合成RNP。试剂盒可以进一步包含转染试剂、细胞生长培养基、选择培养基、反应缓冲液等等。在一些实施方案中，试剂盒可以进一步包含一种或多种供体多核苷酸，用于目标基因组基因座的基因转换/校正。本文提供的试剂盒一般包括用于进行下文详述的方法的说明书。试剂盒中包括的说明可以贴在包装材料上，或可以作为包装插页提供。尽管说明书通常是书面或印刷材料，但它们并不限于此。本公开内容考虑了能够存储此类说明书并且将其传达给最终用户的任何介质。此类介质包括但不限于电子存储介质（例如磁盘、磁带、盒式磁带、芯片）、光学介质（例如CD ROM）等等。如本文使用的，术语“说明书”可以包括提供说明书的互联网站的地址。

本公开内容的另一个方面涵盖用于有效修饰真核细胞中的基因组基因座的方法。该方法包括将如上文节段（I）中所述的成对的CRISPR切口酶RNP引入细胞内，其中所述CRISPR切口酶将双链断裂协调地引入靶基因组基因座内，使得双链断裂的细胞修复导致基因组基因座的修饰。

双链断裂可以通过非同源末端连接（NHEJ）进行修复，使得存在至少一个核苷酸的插入和/或至少一个核苷酸的缺失（即插入缺失），并且基因组基因座是失活的。例如，基因组基因座可以被敲低（即，单等位基因突变）并且产生降低量的基因产物，或者可以被敲除（即，双等位基因突变）并且不产生基因产物。

在一些实施方案中，该方法进一步包括将供体多核苷酸引入真核细胞内，所述供体多核苷酸包含相对于目标基因组基因座的靶区域具有至少一个核苷酸变化的供体序列，其中通过同源定向修复（HDR）的双链断裂修复导致供体序列的整合或交换，使得目标基因组基因座通过至少一个核苷酸取代（例如，基因校正/转换）进行修饰。

本文公开的方法包括将CRISPR切口酶RNP引入细胞内，与编码CRISPR组分的核酸相反。因此，CRISPR切口酶RNP可以立即切割靶基因组基因座，并且细胞不必转录/翻译CRISPR组分。由于外来蛋白质和RNA趋于快速降解，因此CRISPR切口酶RNPS具有瞬时效应。此外，CRISPR切口酶RNP的递送避免了当将编码CRISPR组分的核酸引入细胞内时，观察到的延长表达问题（Kim等人，Genome Research，2014，24（6）:1012-1019）。

一般而言，成对的CRISPR切口酶RNP的利用导致高频率的基因组修饰。如实施例4中详述的，在人原代T细胞中，成对的Cas9切口酶RNP生成在CTLA-4基因座处29%的插入缺失频率、在TIM-3基因座处11%的插入缺失频率、以及在TRAC基因座处14%的插入缺失频率，如使用TIDE/ICE（通过CRISPR编辑的分解/推断追踪插入缺失）测定估计的。通常，与单个CRISPR核酸酶RNP的利用相比，成对的CRISPR切口酶RNP的利用导致增加频率的基因组修饰。如实施例1中详述的，在K562细胞中，成对的Cas9切口酶RNP生成在PD-1基因座处21%的平均插入缺失频率，而Cas9核酸酶RNP导致在PD-1基因座处9.5%的平均插入缺失频率，如用CEL-1核酸酶测定估计的。类似地，如实施例2中详述的，在人原代T细胞中，成对的Cas9切口酶RNP生成在PD-1位点处5.6%的平均插入缺失频率，而Cas9核酸酶RNP导致在PD-1位点处1.6%的平均插入缺失频率，如使用下一代测序方法估计的。如实施例4中详述的，成对的Cas9切口酶RNP生成在TIM-3基因座处11%的插入缺失频率，而Cas9核酸酶RNP导致在TIM-3基因座处4%的插入缺失频率，如使用TIDE/ICE测定估计的。

（a）引入细胞内

该方法包括将成对的CRISPR切口酶RNA引入细胞内。在一些实施方案中，CRISPR切口酶和成对的引导RNA各自可以在临递送至细胞之前复合成RNP。在其它实施方案中，CRISPR切口酶和成对的引导RNA各自可以在递送至细胞之前数小时、数天、数周或数月复合（并适当地贮存）。

一般而言，引导RNA对与CRISPR切口酶的摩尔比的范围可以是约0.1:1至约100:1。因此，例如，该引导RNA对与CRISPR切口酶的摩尔比可以是0.25:1、0.5:1、0.75:1、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1、30:1、31:1、32:1、33:1、34:1、35:1、36:1、37:1、38:1、39:1、40:1、41:1、42:1、43:1、44:1、45:1、46:1、47:1、48:1、49:1、50:1. 51:1、52:1、53:1、54:1、55:1、56:1、57:1、58:1、59:1、60:1、61:1、62:1、63:1、64:1、65:1、66:1、67:1、68:1、69:1、70:1、71:1、72:1、73:1、74:1、75:1、76:1、77:1、78:1、79:1、80:1、81:1、82:1、83:1、84:1、85:1、86:1、87:1、88:1、89:1、90:1、91:1、92:1、93:1、94:1、95:1、96:1、97:1、98:1、99:1或100:1。在一些实施方案中，该引导RNA对与CRISPR切口酶的摩尔比为约0.5:1至约50:1。在一些实施方案中，该引导RNA对与CRISPR切口酶的摩尔比为约1:1至约75:1。在一些实施方案中，该引导RNA对与CRISPR切口酶的摩尔比为约1:1至约25:1。在一些实施方案中，该引导RNA对与CRISPR切口酶的摩尔比为约1:1至约15:1。在一些实施方案中，该引导RNA对与CRISPR切口酶的摩尔比为约1:1至约10:1。在一些实施方案中，该引导RNA对与CRISPR切口酶的摩尔比为约2:1至约10:1。在其它实施方案中，该引导RNA对与CRISPR切口酶的摩尔比为0.5:1、1:1、1.5:1、2:1、2.5:1、3:1、3.5:1、4:1、4.5:1、5:1、5.5:1、6:1、6.5:1、7:1、7.5:1、8:1、8.5:1、9:1、9.5:1或10:1。

CRISPR切口酶RNP可以通过各种手段递送至细胞。在一些实施方案中，CRISPR切口酶RNP可以经由合适的转染方法引入细胞内。例如，可以用基于电穿孔的转染程序，即核转染引入CRISPR切口酶RNP。核转染方法和仪器是本领域众所周知的。在其它实施方案中，可以通过在内体裂解剂（endosomolytic agent）如细胞穿透肽或其衍生物的存在下温育，将CRISPR切口酶RNP引入细胞内（Erazo-Oliverase等人，Nature Methods，2014，11:861-867）。在另外其它实施方案中，可以通过显微注射将CRISPR切口酶RNP引入细胞内。

一般而言，将细胞维持在对于细胞生长和/或维持适当的条件下。合适的细胞培养条件是本领域众所周知的，并且例如在Santiago等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，2008，105:5809-5814；Moehle等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，2007，104:3055-3060；Urnov等人，Nature，2005，435:646-651；以及Lombardo等人，Nat. Biotechnol.，2007，25:1298-1306中描述。本领域技术人员了解，用于培养细胞的方法是本领域已知的，并且可以并且将根据细胞类型而变。在所有情况下，常规优化都可以用于确定用于特定细胞类型的最佳技术。

（b）任选的供体多核苷酸

在一些实施方案中，该方法进一步包括将至少一种供体多核苷酸引入细胞内，所述供体多核苷酸包含相对于目标基因组基因座的靶区域具有至少一个核苷酸变化的供体序列。因此，在与天然基因组序列整合或交换后，修饰的基因组基因座包含至少一个核苷酸改变，使得细胞产生修饰的基因产物。

供体序列包含相对于基因组基因座的靶区域的至少一个核苷酸变化。像这样，供体序列与目标基因组基因座中的靶区域具有实质的序列同一性。取决于靶区域的长度，供体序列的侧翼可以是与位于靶区域的上游和下游的序列具有实质的序列同一性的序列。如本文使用的，短语“实质的序列同一性”指具有至少约75%的序列同一性的序列。因此，供体多核苷酸中的供体序列（和任选的侧翼序列）可以与目标基因组基因座具有约75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99%的序列同一性。在具体实施方案中，任选的侧翼序列可以与目标基因组基因座中的相应序列具有约95%或100%的序列同一性。

供体序列（和任选的侧翼序列）的长度可以并且将变化。例如，供体序列（和任选的侧翼序列）的范围可以是长度约30个核苷酸至约1000个核苷酸。在某些实施方案中，供体序列（和任选的侧翼序列）的范围可以是长度约30个核苷酸至约100个核苷酸、约100个核苷酸至约300个核苷酸、或约300个核苷酸至约10000个核苷酸。

供体多核苷酸可以是单链或双链的、线性或环状的和/或RNA或DNA。在一些实施方案中，供体多核苷酸可以是载体，例如质粒载体。在其它实施方案中，供体多核苷酸可以是单链寡核苷酸。

（c）细胞类型

该方法包括将成对的CRISPR切口酶RNP引入真核细胞内。真核细胞可以是人细胞或动物细胞。在大多数实施方案中，真核细胞是免疫细胞。合适的免疫细胞包括淋巴细胞，例如T细胞（例如杀伤性T细胞、辅助性T细胞、γδT细胞）、B细胞（例如前B细胞、记忆性B细胞、浆细胞）、或天然杀伤（NK）细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞/巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞和树突状细胞。在一些实施方案中，细胞可以是非免疫细胞。真核细胞可以是原代细胞或细胞系细胞。在特定实施方案中，细胞可以是人原代T细胞。

本文公开的组合物和方法可以用于各种治疗、诊断、工业和研究应用中。在一些实施方案中，本公开内容可以用于开发、测试和/或实施免疫肿瘤学、癌症免疫疗法、免疫疗法、免疫治疗学、免疫诊断或其它基于免疫的治疗。例如，特异性组合物可以进行改造，以靶向特定类型的乳腺癌（例如，ER阳性、PR阳性、三阴性等）、前列腺癌、肺癌、皮肤癌等。

在其它实施方案中，本公开内容可以用于修饰细胞或动物中的目标基因组基因座，以便建模和/或研究基因的功能、研究目标遗传或表观遗传条件、或者研究涉及各种疾病或病症的生化途径。例如，可以产生建模疾病或病症的转基因动物，其中与疾病或病症相关的一种或多种核酸序列的表达被改变。疾病模型可以用于研究突变对动物的作用，研究疾病的发展和/或进展，研究药物活性化合物对疾病的作用，和/或评价潜在基因疗法策略的功效。

在其它实施方案中，所述组合物和方法可以用于执行有效且具有成本效益的功能基因组筛选，其可以用于研究涉及特定生物学过程的基因的功能，以及基因表达中的任何改变可以如何影响生物学过程，或者执行与细胞表型结合的基因组基因座的饱和或深层扫描诱变。例如，饱和或深层扫描诱变可以用于确定基因表达、药物抗性和疾病逆转所需的功能元件的关键最小特点和离散脆弱性。

在另一个方面，提供了治疗受试者的方法，例如降低或改善受试者中的过度增殖性状况或病症（例如癌症），例如实体瘤、软组织肿瘤或转移病灶的方法。该方法包括根据本文所述的方法，通常是离体地修饰细胞，并且将单独或者与其它试剂或治疗模式组合的修饰细胞递送至或施用于需要治疗的受试者。

例如，修饰方案靶向人基因组内的基因座（蛋白质编码基因、非编码基因、安全港基因座或其它），以敲低、敲除或敲入特定的靶基因。通过使基因失活，预期目标基因不以功能蛋白或RNA形式表达（即，敲除）。可替代地，可以修饰目标基因，使得其表达和/或功能性降低（即，敲低）。作为另一种替代，外源或供体序列可以被复制或整合到基因组序列内（即，敲入或整合）。例如，通过校正小的内源基因区域（例如单个核酸变化或几个核酸变化）、或整个基因通过引入导致疾病治疗的合成拷贝的功能替换，可以引入突变或在其它方面缺陷的基因的校正版本。引起的核酸链断裂通常通过同源重组或非同源末端连接（NHEJ）的独特机制进行修复。然而，NHEJ是不完善的修复过程，其经常导致在切割位点处的DNA序列的变化。经由非同源末端连接（NHEJ）的修复经常导致小插入或缺失（插入缺失），并且可以用于产生特异性基因敲除。可以通过本领域众所周知的方法鉴定和/或选择其中已发生切割诱导的诱变事件的细胞。

如本文所述的癌症治疗意欲包括所有类型的癌性生长或致癌过程，转移组织或恶性转化的细胞、组织或器官，而与组织病理学类型或侵入性阶段无关。癌性病症的实例包括但不限于实体瘤、血液学癌症、软组织肿瘤和转移病灶。

实体瘤的实例包括各种器官系统的恶性肿瘤，例如肉瘤和癌（包括腺癌；以及鳞状细胞癌），例如影响肝、肺、乳腺、淋巴、胃肠道（例如结肠）、泌尿生殖道（例如肾、尿路上皮细胞）、前列腺和咽的那些。腺癌包括恶性肿瘤，例如大多数结肠癌、直肠癌、肾细胞癌、肝癌、非小细胞肺癌、小肠癌和食道癌。鳞状细胞癌包括例如在肺、食道、皮肤、头颈区、口腔、肛门和宫颈中的恶性肿瘤。还可以使用本公开内容的方法和组合物治疗或预防上述癌症的转移病灶。

可以使用本文公开的方法和组合物抑制其生长的示例性癌症包括通常响应免疫疗法的癌症。用于治疗的优选癌症的非限制性实例包括淋巴瘤（例如弥漫性大B细胞淋巴瘤、何杰金淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤）、乳腺癌（例如转移性乳腺癌）、肺癌（例如非小细胞肺癌）（NSCLC），例如IV期或复发性非小细胞肺癌、NSCLC腺癌或NSCLC鳞状细胞癌）、骨髓瘤（例如多发性骨髓瘤）、白血病（例如慢性髓性白血病）、皮肤癌（例如黑色素瘤（例如III期或IV期黑色素瘤）或Merkel细胞癌）、头颈癌（例如头颈鳞状细胞癌（HNSCC））、骨髓增生异常综合症、膀胱癌（例如移行细胞癌）、肾癌（例如肾细胞癌，例如透明细胞肾细胞癌，例如晚期或转移性透明细胞肾细胞癌）和结肠癌。另外，可以使用本文描述的抗体分子治疗难治性或复发性恶性肿瘤。

可以治疗的其它癌症的实例包括骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门癌、胃食管癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、Merkel细胞癌、何杰金淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病（包括急性髓样白血病、慢性髓样白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病）、儿童期实体瘤、淋巴细胞淋巴瘤、膀胱癌、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、肾癌或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统（CNS）肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊柱肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波济氏肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱发的癌症包括通过石棉诱发的癌症（例如间皮瘤）、以及所述癌症的组合。

在一个实施方案中，肿瘤或癌症选自腺瘤、血管肉瘤、星形细胞瘤、上皮癌、生殖细胞瘤、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、错构瘤、血管内皮瘤、血管肉瘤、血肿、肝母细胞瘤、白血病、淋巴瘤、髓母细胞瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤、骨肉瘤、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤和畸胎瘤。肿瘤可以选自肢端雀斑痣样黑色素瘤、光化性角化病、腺癌、腺样囊性癌、腺瘤、腺肉瘤、腺鳞状癌、星形细胞肿瘤、前庭大腺癌、基底细胞癌、支气管腺癌、毛细血管癌、类癌、癌、癌肉瘤、海绵状、胆管癌、软骨肉瘤、脉络丛乳头状瘤/癌、透明细胞癌、囊腺瘤、内胚窦瘤、子宫内膜增生、子宫内膜间质肉瘤、子宫内膜样腺癌、室管膜、上皮样、尤因氏肉瘤、纤维板层、局灶性结节性增生、胃泌素瘤、生殖细胞肿瘤、胶质母细胞瘤、胰高血糖素瘤、血管母细胞瘤、血管内皮瘤、血管瘤、肝腺瘤、肝腺瘤病、肝细胞癌、胰岛素瘤、上皮内瘤变、上皮间鳞状细胞瘤变、浸润性鳞状细胞瘤、大细胞癌、平滑肌肉瘤、恶性雀斑样痣、恶性黑色素瘤、恶性间皮瘤、髓母细胞瘤、髓上皮瘤、黑色素瘤、脑膜、间皮、转移性癌、粘液表皮样癌、神经母细胞瘤、神经上皮腺癌、结节性黑色素瘤、燕麦细胞癌、少突胶质细胞瘤、骨肉瘤、胰腺、乳头状浆液性腺癌、松果体细胞、垂体肿瘤、浆细胞癌、假性肉瘤、肺母细胞瘤、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、浆液性癌、小细胞癌、软组织癌、生长抑素分泌性肿瘤、鳞状癌、鳞状细胞癌、间皮下、浅表扩散性黑色素瘤、未分化癌、葡萄膜黑色素瘤、疣状癌、病毒瘤、分化良好癌和肾母细胞瘤。

因此，例如，本公开内容提供了用于治疗各种癌症的方法，所述癌症包括但不限于以下：癌，包括膀胱癌（包括加速和转移性膀胱癌）、乳腺癌、结肠癌（包括结肠直肠癌）、肾癌、肝癌、肺癌（包括小细胞和非小细胞肺癌和肺腺癌）、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、泌尿生殖道癌、淋巴系统癌、直肠癌、喉癌、胰腺癌（包括外分泌胰腺癌）、食道癌、胃癌、胆囊癌、宫颈癌、甲状腺癌和皮肤癌（包括鳞状细胞癌）；淋巴样谱系的造血系统肿瘤，包括白血病、急性淋巴细胞白血病、急性成淋巴细胞性白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、何杰金淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、毛细胞淋巴瘤、组织细胞性淋巴瘤和伯基特淋巴瘤；髓样谱系的造血系统肿瘤，包括急性和慢性髓性白血病、骨髓增生异常综合症、髓样白血病和早幼粒细胞白血病；中枢和周围神经系统的肿瘤，包括星形细胞瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤和神经鞘瘤；间充质起源的肿瘤，包括纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和骨肉瘤；以及其它肿瘤，包括黑色素瘤、着色性干皮病、角化棘皮瘤（keratoactanthoma）、精原细胞瘤、甲状腺滤泡癌和畸胎癌。

例如，可以用本文所述的组合物和方法治疗的特定白血病包括但不限于急性非淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性粒细胞性白血病、慢性粒细胞性白血病、急性早幼粒细胞白血病、成人T细胞白血病、白细胞不增多性白血病、白细胞白血病（leukocythemic leukemia）、嗜碱性粒细胞白血病（basophylic leukemia）、原始细胞白血病、牛白血病、慢性髓细胞性白血病、皮肤白血病、干细胞性白血病、嗜酸性粒细胞白血病、葛氏白血病、毛细胞白血病、成血细胞性白血病、血母细胞性白血病、组织细胞性白血病、干细胞白血病、急性单核细胞白血病、白细胞减少性白血病、淋巴性白血病、成淋巴细胞性白血病、淋巴细胞性白血病、淋巴源性白血病、淋巴样白血病、淋巴肉瘤细胞性白血病、肥大细胞白血病、巨核细胞性白血病、小骨髓母细胞性白血病、单核细胞性白血病、髓母细胞性白血病、髓细胞性白血病、髓样粒细胞性白血病、粒单核细胞白血病、Naegeli白血病、浆细胞白血病、浆细胞性白血病、早幼粒细胞白血病、里德尔细胞白血病、希林氏白血病、干细胞白血病、亚白血病性白血病和未分化细胞性白血病。

淋巴瘤也可以用本文所述的组合物和方法进行治疗。淋巴瘤一般是主要位于淋巴样组织中的细胞的致瘤性转化。淋巴瘤是免疫系统的肿瘤，并且一般作为T细胞和B细胞相关疾病呈现。在淋巴瘤中，存在两个主要不同的组：非何杰金氏淋巴瘤（NHL）和何杰金氏病。可能尤其涉及骨髓、淋巴结、脾和循环细胞。治疗方案包括从患者中取出骨髓并从其中清除肿瘤细胞，经常使用针对存在于肿瘤细胞类型上的抗原的抗体，随后为贮存。患者然后给予毒性剂量的放射或化学疗法，且然后重新注入净化的骨髓，以便重新填充患者的造血系统。

可以用本文所述的组合物和方法治疗的其它血液系统恶性肿瘤包括骨髓增生异常综合症（MDS）、骨髓增生性综合征（MPS）和骨髓瘤，例如孤立性骨髓瘤和多发性骨髓瘤。多发性骨髓瘤（也称为浆细胞骨髓瘤）涉及骨骼系统，并且特征在于遍及该系统散布的致瘤性浆细胞的多重肿瘤团块。它也可能扩散到淋巴结和其它部位如皮肤。孤立性骨髓瘤涉及趋于在与多发性骨髓瘤相同的位置中发生的孤立病灶。

靶向用于在本文所述的治疗方法中使用的细胞可以包括例如T细胞、天然杀伤（NK）细胞、细胞毒性T淋巴细胞（CTL）、调节性T细胞、人胚胎干细胞、肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）或可以由其分化淋巴样细胞的多能干细胞。表达所需CAR的T细胞可以例如通过与γ照射的活化和繁殖细胞（AaPC）共培养进行选择，所述AaPC共表达癌抗原和共刺激分子。可以例如通过在可溶性因子如IL-2和IL-21的存在下，在AaPC上共培养来扩增改造的CAR T细胞。这种扩增可以例如这样进行，以便提供记忆性CAR+ T细胞（其可以例如通过非酶促数字阵列和/或多板流式细胞术进行测定）。以这种方式，可以提供CAR T细胞，其对带有抗原的肿瘤具有特异性细胞毒性活性（任选地与产生所需趋化因子例如干扰素-γ结合）。这种CART细胞可以例如在动物模型中使用，例如以治疗肿瘤异种移植物。

诸如上述的方法可以适于提供治疗和/或增加患有疾病（例如瘤形成）的受试者的存活的方法，例如通过施用有效量的包含抗原识别受体的免疫应答细胞，所述抗原识别受体结合选择的抗原，其中所述结合活化免疫应答细胞，从而治疗或预防疾病（例如瘤形成、病原体感染、自身免疫病症或同种异体移植物反应）。

根据本公开内容修饰的细胞或细胞群的施用可以以任何方便的方式进行，所述方式包括通过气溶胶吸入、注射、摄入、输液、植入或移植。细胞或细胞群可以皮下、皮内、肿瘤内、结节内、髓内、肌内、通过静脉内或淋巴内注射或腹膜内施用于患者。在一个实施方案中，本公开内容的修饰细胞优选通过静脉内注射施用。

在一个实施方案中，在施用于有此需要的患者之前，在CAR T细胞中调节本文所述的任何靶。

细胞或细胞群的施用可以由以下组成：施用10

在另一个实施方案中，肠胃外施用有效量的细胞或包含那些细胞的组合物。施用可以是静脉内施用。可以通过在肿瘤内注射直接完成施用。

在一些实施方案中，该方法可以进一步包括施用一种或多种另外的试剂（例如，组合疗法）。例如，一种或多种另外的试剂可以与以下结合（例如，在本文所述的治疗之前、之后或同时）施用于受试者：包括化学治疗剂、抗血管生成剂和降低免疫压制的试剂。

治疗剂可以是例如化学治疗剂或生物治疗剂、放射或免疫疗法。可以施用用于特定癌症的任何合适的治疗性处理。化学治疗剂和生物治疗剂的实例包括但不限于血管生成抑制剂，例如羟基血管抑素K1-3、DL-α-二氟甲基鸟氨酸、内皮抑素、烟曲霉素、染料木黄酮、米诺环素、星形孢菌素和沙利度胺；DNA嵌入剂/交联剂，例如博来霉素、卡铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、顺式二氯二氨基铂（II）（顺铂）、美法仑、米托蒽醌和奥沙利铂；DNA合成抑制剂，例如（±）-甲氨蝶呤（氨甲蝶呤）、3-氨基-1,2,4-苯并三嗪1,4-二氧化物、氨基蝶呤、胞嘧啶β-D-阿糖胞苷、5-氟-5'-脱氧尿苷、5-氟尿嘧啶、更昔洛韦、羟基脲和丝裂霉素C；DNA-RNA转录调节剂，例如放线菌素D、柔红霉素、多柔比星、高三尖杉酯碱和伊达比星；酶抑制剂，例如S（+）-喜树碱、姜黄素、（-）-鱼藤素、5,6-二氯苯并咪唑1-β-D-呋喃核糖苷、依托泊苷、福美坦、福司曲星、Hispidin、2-亚氨基-1-咪唑-二乙酸（环肌酸）、美维诺林、曲古菌素A、酪氨酸激酶抑制剂AG 34和酪氨酸激酶抑制剂AG 879；基因调节剂，例如5-氮杂-2'-脱氧胞苷、5-氮杂胞苷、胆钙化醇（维生素D3）、4-羟基他莫昔芬、褪黑素、米非司酮、雷洛昔芬、全反式视黄醛（维生素A醛）、全反式视黄酸（维生素A酸）、9-顺式视黄酸、13-顺式视黄酸、视黄醇（维生素A）、他莫昔芬和曲格列酮；微管抑制剂，例如秋水仙碱、多西他赛、多拉司他汀15、诺考达唑、紫杉醇、鬼臼毒素、根瘤菌素、长春碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨（诺维本）；和未分类的治疗剂，例如17-（烯丙氨基）-17-脱甲氧基格尔德霉素、4-氨基-1,8-萘二甲酰亚胺、芹菜素、布雷菲德菌素A、西咪替丁、二氯亚甲基-二膦酸、亮丙瑞林（Leuprorelin）、促黄体激素释放激素、Pifithrin-α、雷帕霉素、性激素结合球蛋白、毒胡萝卜素和尿胰蛋白酶抑制剂片段（Bikunin）。治疗剂可以是六甲蜜胺、氨磷汀、天冬酰胺酶、卡培他滨、克拉屈滨、西沙必利、阿糖胞苷、达卡巴嗪（DTIC）、放线菌素、屈大麻酚、促红细胞生成素α、非格司亭、氟达拉滨、吉西他滨、格拉司琼、异环磷酰胺、伊立替康、兰索拉唑、左旋咪唑、亚叶酸钙、甲地孕酮、美司钠、甲氧氯普胺、米托坦、奥美拉唑、昂丹司琼、匹鲁卡品、氯丙嗪或盐酸托扑替康。

治疗剂也可以是单克隆抗体、例如131I-托西莫单抗、90Y-替伊莫单抗、恩美曲妥珠单抗（Kadcyla™）、恩美曲妥珠单抗、阿法替尼二马来酸盐（Gilotrif®）、阿仑珠单抗（Campath®）、阿昔替尼（Inlyta®）、贝伐珠单抗（Avastin®）、硼替佐米（Velcade®）、博舒替尼（Bosulif®）、本妥昔单抗（Adcetris®）、卡博替尼（Cometriq™）、卡非佐米（Kyprolis®）、色瑞替尼（LDK378/Zykadia）、西妥昔单抗（Erbitux®）、克唑替尼（Xalkori®）、达拉非尼（Tafinlar®）、达沙替尼（Sprycel®）、地诺单抗（Xgeva®）、厄洛替尼（Tarceva®）、厄洛替尼（Tarceva®）、吉非替尼（Iressa®b）、替伊莫单抗（Zevalin®）、依鲁替尼（Imbruvica™）、依德利西布（idelalisib）（Zydelig®）、甲磺酸伊马替尼（Gleevec®）、拉帕替尼（Tykerb®）、尼洛替尼（Tasigna®）、奥比妥珠单抗（Gazyva™）、奥法木单抗（Arzerra®）、帕尼单抗（Vectibix®）、帕唑帕尼（Votrient®）、帕博利珠单抗（Keytruda ®）、帕妥珠单抗（Perjeta™）、雷莫芦单抗（Cyramza™）、瑞戈非尼（Stivarga®）、利妥昔单抗（Rituxan®）、司妥昔单抗（Sylvant™）、索拉非尼（Nexavar®）、舒尼替尼（Sutent®）、托西莫单抗和131I-托西莫单抗（Bexxar®）、曲美替尼（Mekinist®）、曲妥珠单抗（Herceptin®）、凡德他尼（Caprelsa®）、维莫非尼（Zelboraf®b）和维莫地尼（Erivedge™）。治疗剂也可以是新抗原。

治疗剂可以是细胞因子，例如干扰素（INF）、白介素（IL）或造血生长因子。例如，治疗剂可以是INF-α、IL-2、阿地白介素、IL-2、促红细胞生成素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）或粒细胞集落刺激因子。

治疗剂可以是靶向疗法，例如乙酸阿比特龙（Zytiga®）、阿利维A酸（Panretin®）、阿那曲唑（Arimidex®）、贝利司他（Beleodaq™）、贝沙罗汀（Targretin®）、卡巴他赛（Jevtana®）、地尼白介素（Ontak®）、恩杂鲁胺（Xtandi®）、依维莫司（Afinitor®）、依西美坦（Aromasin®）、氟维司群（Faslodex®）、来那度胺（Revlimid®）、来那度胺（Revlimid®）、来曲唑（Femara®）、泊马度胺（Pomalyst®）、普拉曲沙（Folotyn®）、氯化镭223（Xofigo®）、罗米地辛（Istodax®）、坦西莫司（Torisel®）、托瑞米芬（Fareston®）、Tretinoin（Vesanoid®）、伏立诺他（Zolinza®）和ziv-阿柏西普（Zaltrap®）。另外，治疗剂可以是表观遗传学靶向药物，例如HDAC抑制剂、激酶抑制剂、DNA甲基转移酶抑制剂、组蛋白脱甲基酶抑制剂或组蛋白甲基化抑制剂。表观遗传学药物可以是阿扎胞苷（Vidaza）、地西他滨（Dacogen）、罗米地辛（Istodax）、鲁索替尼（Jakafi）或伏立诺他（Zolinza）。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。下述参考文献为技术人员提供了本发明中使用的许多术语的一般定义：Singleton等人，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology（第2版，1994）；The Cambridge Dictionary of Science and Technology（Walker编辑，1988）；TheGlossary of Genetics，第5版，R. Rieger等人（编辑），Springer Verlag（1991）；以及Hale& Marham，The Harper Collins Dictionary of Biology（1991）。如本文使用的，除非另有说明，否则下述术语具有归于其的含义。

当介绍本公开内容或其优选实施方案的要素时，冠词“一个”、“一种”、“该”和“所述”预期意指存在一个或多个要素。术语“包含”、“包括”和“具有”预期是包括性的，并且意指可以存在除所列要素外的另外要素。

当关于数值x使用时，术语“约”例如意指x ± 5%。

如本文使用的，术语“互补的”或“互补性”指通过特定氢键的碱基配对的双链核酸结合。碱基配对可以是标准的沃森-克里克碱基配对（例如5’-A G T C-3’与互补序列3’-TC A G-5’配对）。碱基配对也可以是Hoogsteen或反向Hoogsteen氢键合。互补性通常关于双链体区域进行测量，并且因此，例如排除突出端。如果仅一些（例如70%）碱基是互补的，则双链体区域的两条链之间的互补性可以是部分的，并且表示为百分比（例如70%）。并不互补的碱基是“错配的”。如果双链体区域中的所有碱基都是互补的，则互补性也可以是完全的（即，100%）。

如本文使用的，“基因”指编码基因产物的染色体区域（包括外显子和内含子），以及调节基因产物产生的所有染色体区域，无论此类调节序列是否与编码和/或转录序列相邻。相应地，基因包括但不一定限于启动子序列、终止子、翻译调节序列如核糖体结合位点和内部核糖体进入位点、增强子、沉默子、绝缘子、边界元件、复制起点、基质附着位点和基因座控制区。“基因组基因座”指染色体上包含基因序列的位置。

术语“切口酶”指切割双链核酸序列的一条链（即，切开双链序列）的酶。例如，可以通过突变和/或缺失来修饰具有双链切割活性的核酸酶，以充当切口酶并且仅切割双链序列的一条链。

如本文使用的，术语“核酸酶”指切割双链核酸序列的两条链的酶。

术语“核酸”和“多核苷酸”指呈线性或环状构象、以及以单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物。为了本公开内容的目的，这些术语不应解释为关于聚合物长度的限制。该术语可以涵盖天然核苷酸的已知类似物，以及在碱基、糖和/或磷酸酯部分（例如，硫代磷酸酯主链）中修饰的核苷酸。一般而言，特定核苷酸的类似物具有相同的碱基配对特异性；即A的类似物将与T碱基配对。

术语“核苷酸”指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。核苷酸可以是标准核苷酸（即，腺苷、鸟苷、胞苷、胸苷和尿苷），核苷酸异构体或核苷酸类似物。核苷酸类似物指具有修饰的嘌呤或嘧啶碱基或者修饰的核糖部分的核苷酸。核苷酸类似物可以是天然存在的核苷酸（例如肌苷、假尿苷等）或非天然存在的核苷酸。核苷酸的糖或碱基部分上的修饰的非限制性实例包括乙酰基、氨基、羧基、羧甲基、羟基、甲基、磷酰基和硫醇基的添加（或去除），以及碱基的碳和氮原子被其它原子的取代（例如7-脱氮嘌呤）。核苷酸类似物还包括双脱氧核苷酸、2'-O-甲基核苷酸、锁核酸（LNA）、肽核酸（PNA）和吗啉代。

术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用，以指氨基酸残基的聚合物。

术语“受试者”和“个体”在本文中可互换使用，并且指用根据本发明的组合物的治疗，包括预防性治疗提供给其的动物，例如人。如本文使用的，术语“受试者”指人和非人动物。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物，例如非人灵长类动物（尤其是高等灵长类动物）、绵羊、犬、啮齿类动物（例如小鼠或大鼠）、豚鼠、山羊、猪、猫、兔、牛，以及非哺乳动物例如鸡、两栖动物、爬行动物等。在一个实施方案中，受试者是非人哺乳动物。在另一个实施方案中，受试者是人。在另一个实施方案中，受试者是实验动物或作为疾病模型的动物替代品。该术语不指示特定年龄或性别。因此，预期覆盖成年和新生受试者以及胎儿，无论是雄性还是雌性。受试者的实例包括人、犬、猫、牛、山羊和小鼠。术语受试者进一步预期包括转基因物种。

术语“靶序列”和“靶位点”可互换使用，以指CRISPR RNP靶向其的目标靶基因组基因座中的特异性序列。

用于确定核酸和氨基酸序列同一性的技术是本领域已知的。通常，此类技术包括确定基因的mRNA的核苷酸序列和/或确定由此编码的氨基酸序列，并且将这些序列与第二核苷酸或氨基酸序列进行比较。基因组序列也可以以这种方式来确定且比较。一般而言，同一性分别指两个多核苷酸或多肽序列的精确核苷酸对核苷酸或氨基酸对氨基酸的对应关系。可以通过确定其同一性百分比来比较两个或更多个序列（多核苷酸或氨基酸）。两个序列（无论是核酸序列还是氨基酸序列）的同一性百分比是两个比对序列之间的精确匹配数目除以较短序列的长度，且乘以100。关于核酸序列的近似比对由Smith和Waterman，Advances in Applied Mathematics 2：482-489（1981）的局部同源性算法提供。这种算法可以通过使用评分矩阵应用于氨基酸序列，所述评分矩阵由Dayhoff，Atlas of ProteinSequences and Structure，M. O. Dayhoff编辑，5 suppl. 3：353-358，NationalBiomedical Research Foundation，Washington，D.C.，USA开发，并且由Gribskov，Nucl.Acids Res. 14（6）：6745-6763（1986）标准化。这种算法确定序列的同一性百分比的示例性实现由“BestFit”实用应用程序中的Genetics Computer Group（Madison，Wis.）提供。用于计算序列之间的同一性或相似性百分比的其它合适程序是本领域一般已知的，例如，另一种比对程序是与缺省参数一起使用的BLAST。例如，可以使用下述缺省参数来使用BLASTN和BLASTP：遗传密码=标准；过滤器=无；链=两条；截止值=60；期望值=10；矩阵=BLOSUM62；描述=50个序列；排序方式=高评分；数据库=非冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻译+Swiss蛋白+Spupdate+PIR。这些程序的详细信息可以在GenBank网站上找到。

由于可以在上述细胞和方法中作出各种变化，而不背离本发明的范围，因此预期上述说明和下文给出的实施例中包含的所有内容，都应该解释为说明性的而不是限制性的。

实施例

下述实施例示出了本公开内容的某些方面。

实施例1. CRISPR切口酶RNP对K562细胞中的PD-1的评估

程序性细胞死亡1（PD-1或PCD-1），细胞表面受体，是癌症免疫疗法中的检查点阻断的潜在靶。设计了成对的crRNA集合，用于对PD-1的CRISPR切口酶RNP（表1）。成对的crRNA以PAM-向外取向进行配置。

测试了包含成对crRNA的设计#1、#2或#3的SpCas9-D10A切口酶RNP，并且与含有个别crRNA（crRNA-a、crRNA-b、crRNA-c或crRNA-d）的SpCas9核酸酶RNP进行比较。为了形成RNP，将Cas9蛋白（+NLS）、tracrRNA和crRNA各自重悬浮于所提供的重悬浮溶液或pH 7.5的10 mM Tris缓冲液中至30 μM的浓度。然后将它们以5:5:1（crRNA : tracrRNA : Cas9蛋白）的摩尔比在11 μL的混合物中组装，并且在临使用前在室温下放置5分钟。对于切口酶RNP，两个RNP分开形成并且在转染前立即同时加入细胞中。使用核转染系统（Lonza）完成转染，其中将整个RNP混合物加入100 μL K562细胞（大约350K细胞）中。

使用DNA提取溶液（Epicentre）从K562细胞中提取基因组DNA，并且对靶位点进行PCR扩增（正向PD-1引物：5’- GGACAACGCCACCTTCACCTGC，SEQ ID NO：35反向PD-1引物：5’-CTACGACCCTGGAGCTCCTGAT；SEQ ID NO：36。CEL-1测定使用Surveyor突变检测试剂盒（IDT）执行。首先，PCR扩增子在扩增后经过在热循环仪中的变性和退火步骤，以形成异源双链体，随后为在42℃下用核酸酶和增强子蛋白的消化，然后在10% TBE凝胶（Thermofisher）上进行电泳。然后将凝胶在100 ml 1x TBE缓冲液中用2 µL 10 mg/ml溴化乙锭染色5分钟，然后用1x TBE缓冲液洗涤并用UV照明仪显现。使用Image J软件分析所得到的条带，表2呈现了结果。

如表2中所示，在K562细胞中用SpCas9切口酶RNP生成对PD-1的成功基因组编辑。令人惊讶的是，SpCas9切口酶RNP对PD-1的基因组编辑效率远远高于SpCas9核酸酶RNP的那些。例如，含有crRNA-a和crRNA-b的SpCas9切口酶RNP设计#1导致22%插入缺失；而具有crRNA-a或crRNA-b的SpCas9核酸酶RNP分别仅导致11%或13%插入缺失。

实施例2. CRISPR切口酶RNP对原代T细胞中的PD-1的评估

如实施例1中所述制备SpCas9核酸酶RNP和SpCas9切口酶RNP。CD8+人原代T细胞（AllCells，LLC）维持在T细胞扩增培养基（Sigma-Aldrich）中，所述培养基补充有10%人AB血清（Sigma-Aldrich）、1x L-谷氨酰胺替代品（Gibco）、8 ng/mL IL-2（Gibco）和50 μM巯基乙醇（Sigma）。核转染前7天，用T细胞扩增珠（即DYNABEADS™ Human T-Expander CD3/CD28；Gibco）刺激细胞。每次转染使用CD8+人原代T细胞（大约500 K细胞），并且使用如实施例1中所述的核转染系统完成转染。在T细胞扩增珠的存在下培养细胞。

通过使用下一代测序（NGS）测量了SpCas9切口酶RNP和SpCas9核酸酶RNP的编辑效率。核转染六天后，使用Taq反应混合物（JUMPSTART™ REDTAQ® READYMIX™ ReactionMix；Sigma-Aldrich）和位于基因组切割位点侧翼的引物执行PCR。用部分Illumina衔接子序列给引物加上标签

NickFOR-ILLUMIPD1：TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNNNNNNGGACAACGCCACCTTCACCTG（SEQ ID NO：37）

NickREV-ILLUMIPD1：GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGNNNNNNCTACGACCCTGGAGCTCCTGAT（SEQ ID NO：38）。

热循环条件包括在95℃下5分钟的热变性步骤，随后为95℃ 30秒、在67.7℃下30秒退火和在70℃下30秒延伸的34个循环。扩增随后为在70℃下的最终延伸10分钟和冷却至4℃。

进行有限循环PCR以使扩增的PCR产物加上索引。50 μL的总反应体积包括25 μL上述Taq反应混合物、5 μL扩增的PCR产物、10 μL H

PicoGreen荧光染料（Invitrogen）用于定量加上索引的样品。纯化的加上索引的PCR用1xTE稀释至1:100。PicoGreen用1xTE稀释至1:200。将等体积的稀释的PicoGreen加入稀释的加上索引的PCR样品中，在荧光板读数器中产生最终的1:1稀释比。样品在475 nm处激发，并且在530 nm处读数。所有样品用1xTE标准化至4 nM，并且收集且合并6 µL每个标准化样品。

原液10 M NaOH用H

NGS分析清楚地显示了在原代T细胞中用SpCas9切口酶RNP对PD-1的成功基因组编辑。SpCas9切口酶RNP的设计#1和#2均在原代T细胞中显示对PD-1高于具有任何单个crRNA的SpCas9核酸酶RNP的基因组编辑效率。特别地，具有设计#1成对crRNA（crRNA-a + crRNA-b）的SpCas9切口酶RNP导致11.9%插入缺失；而具有crRNA-a或crRNA-b的SpCas9核酸酶RNP仅导致1.7%或2.4%插入缺失。

实施例3. CRISPR切口酶RNP对K562细胞中的更多免疫相关靶的评估

细胞毒性T淋巴细胞蛋白4（CTLA4）、含T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域3（TIM-3；也称为甲型肝炎病毒细胞受体2，HAVCR2）和T细胞受体α恒定（TRAC）是癌症免疫治疗领域中新兴的靶或基因组基因座。对于对这些靶的CRISPR-切口酶RNP设计了成对的gRNA集合（表4）。使用化学修饰的单个gRNA（mod-sgRNA，含有稳定的2'-O-甲基和硫代磷酸酯键）。成对的mod-sgRNA以PAM-向外取向进行配置。

表4. 成对的mod-sgRNA的设计

如实施例1中所述制备SpCas9切口酶RNP并且递送到K562细胞内，除了RNP以3:1（mod-sgRNA : Cas9蛋白）的摩尔比组装之外。

使用DNA提取溶液（Epicentre）从K562细胞中提取基因组DNA，并且对靶位点进行PCR扩增（CTLA-4引物：正向CTLA-4引物：5’- CCCTTGTACTCCAGGAAATTCTCCA，SEQ ID NO：57，反向CTLA-4引物：5’-ACTTGTGAGCTCATCCTGAAACCCA，SEQ ID NO：58；TIM-3引物：正向TIM-3引物：5’-TCATCCTCCAAACAGGACTGC，SEQ ID NO：59，反向TIM-3引物：5’-TGTCCACTCACCTGGTTTGAT，SEQ ID NO：60；TRAC引物：正向TRAC引物：5’-TCAGGTTTCCTTGAGTGGCAG，SEQ ID NO：61，反向TRAC引物：5’-TGGCAATGGATAAGGCCGAG，SEQID NO：62）。

通过使用TIDE/ICE（通过CRISPR编辑的分解/推断追踪插入缺失）测定来测量SpCas9核酸酶RNP的编辑效率。SENE痕迹通过GENEWIZ用靶特异性PCR产物生成，并且用TIDE或ICE网络工具（http://tide.nki.nl或https://ice.synthego.com）进行分析。使用缺省参数。表5呈现了结果。

如表5中所示，在K562细胞中用SpCas9切口酶RNP生成了对CTLA-4、TIM-3和TRAC的成功基因组编辑。例如，分别地，具有CTLA-4对#2的SpCas9切口酶RNP导致14%插入缺失；具有TIM-3对#3的SpCas9切口酶RNP导致18%插入缺失；并且具有TRAC对#2的SpCas9切口酶RNP导致6%插入缺失。

实施例4. CRISPR切口酶RNP对人原代T细胞中的CTLA-4、TIM-3和TRAC的评估

选择在K562细胞中对每个靶具有最高编辑效率的SpCas9切口酶RNP（CTLA-4对#2、TIM-3对#3和TRAC对#2），用于人原代T细胞中的测试。如实施例3中所述制备SpCas9核酸酶RNP和SpCas9切口酶RNP；如实施例2中所述将RNP递送到人原代T细胞内。如实施例3中所述，通过使用TIDE/ICE测定来测量SpCas9切口酶RNP和SpCas9核酸酶RNP的编辑效率。结果呈现于表6中。

表6. 用双重SpCas9切口酶RNP和SpCas9核酸酶RNP对人原代T细胞中的CTLA-4、TIM-3和TRAC的基因组编辑

如表6中所示，在人原代T细胞中生成了用SpCas9切口酶RNP对所有靶的成功基因组编辑。对靶之一TIM-3，切口酶RNP在原代T细胞中显示了比SpCas9核酸酶RNP更高的基因组编辑效率。值得注意的是，对PD-1的具有化学修饰的单个gRNA的SpCas9切口酶RNP（对#2）在原代T细胞中导致34%插入缺失，显著高于来自具有cr/tracrRNA的两个部分的切口酶RNP的插入缺失（在实施例2中，具有PD-1 cr/tracrRNA对#2的切口酶RNP仅导致小于5%插入缺失）。

实施例5. 使用成对的CRISPR切口酶核糖核蛋白（RNP）的供体多核苷酸的整合

成对的CRISPR切口酶RNP改善真核细胞中的靶向染色体双链断裂的特异性和频率的能力也有利于增加外源供体多核苷酸的整合频率。用外源供体多核苷酸遗传修饰人体细胞免疫细胞基因组的能力产生了许多新的选项（针对改善对各种疾病（尤其是癌症、传染病）的免疫应答）。

外源供体多核苷酸可以与成对的CRISPR切口酶RNP一起使用，以将转基因递送至真核免疫细胞内的安全港基因座，例如AAVS1基因座（在人基因PPP1R12C内）、人Rosa26基因座、Hipp11（H11）基因座或CCR5。安全港基因座定义为其中外源转基因的插入和表达对细胞功能和健康具有最低限度影响的位置。