一种精子冻存液及其在中华乌塘鳢精子冷冻保存中的应用

摘要

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种精子冻存液及其在中华乌塘鳢精子冷冻保存中的应用，本发明的精子冻存液包括精子稀释液和抗冻保护剂，所述精子稀释液包括氯化钠、磷酸二氢钠、碳酸氢钠、氯化钾、二水氯化钙、D‑葡萄糖和七水硫酸镁，所述抗冻保护剂包括二甲亚砜、牛血清白蛋白和海藻糖，该精子冻存液用于冻存中华乌塘鳢精子，损伤小。同时，本发明还提供了一种中华乌塘鳢精子的冷冻保存方法，该方法简便快速，用于冻存中华乌塘鳢精子，复苏后精子活力高，体外受精率高，可用于中华乌塘鳢种质资源的保护以及大规模人工繁殖和生产中。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种精子冻存液及其在中华乌塘鳢精子冷冻保存中的应用。

背景技术

生殖细胞经过减数分裂产生单配体的精子和卵子，精子和卵子结合形成受精卵，从而产生新的个体。因此，生殖细胞是种群繁衍的基础，是重要的种质资源。生殖细胞冻存是一种长期有效保存种质资源的方法。鱼类成熟卵子含有大量的卵磷脂和蛋白等物质，导致卵子冻存异常困难；而鱼类精子体积小、数量多、内含物质相对简单，因此鱼类生殖细胞冻存的对象首选精子。精子冻存技术对于克服重要水产养殖育种的时间和地域限制，以及促进品种的改良具有重要意义。

低温冻存技术目前主要分为梯度降温冻存技术和快速低温冻存技术。其中，梯度降温冻存技术容易产生冰晶，从而对冻存细胞(包括精子)产生损伤。快速冻存技术通过高浓度非渗透生物保护剂让细胞脱水，同时渗透性保护剂进入细胞，然后经液氮快速冻存完成玻璃化，从而保护冻存细胞。由于大部分海水鱼类可耐受较高渗透压，因此，快速冻存技术在海水鱼类精子冻存中有较好的应用前景。目前，该技术已初步应用于冻存少数海水鱼类的精子，如虹鳟和俄罗斯鲟鱼等。然而，现有的海水鱼类精子冻存方法不具备普适性，不同海水鱼类的冻存方法和冻存效率存在非常明显的差异。

中华乌塘鳢是一种生活在潮间带的名贵鱼类。其人工繁殖受到以下3个难题的困扰：(1)其精巢易出现发育不良；(2)有近10％的个体形成同时具有精卵巢的败育性腺；(3)成熟雄鱼的精子难以通过人为轻轻挤压而排出。因此，收集和冻存中华乌塘鳢高质量的精子具有非常重要的经济价值。然而，现有的海水鱼类精子冻存方法应用于中华乌塘鳢的精子冻存时，效果较差，不利于中华乌塘鳢的大规模生产和繁殖。

因此，开发高效的精子低温冻存技术，并将其应用到保存高质量中华乌塘鳢的精子，进行大规模生产和繁殖，对其种质资源的保护和养殖品种的改良均具有重要的意义。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明提出了一种精子冻存液及其应用，针对中华乌塘鳢精子的特性，本发明的精子冻存液中添加了多种生物保护剂，用于中华乌塘鳢精子的冷冻保存，损伤小，复苏后精子活力高，体外受精率高，能够用于人工授精。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

本发明提供一种精子冻存液，所述精子冻存液包括精子稀释液和抗冻保护剂，所述精子稀释液包括氯化钠、磷酸二氢钠、碳酸氢钠、氯化钾、二水氯化钙、D-葡萄糖和七水硫酸镁，所述抗冻保护剂包括二甲亚砜(DMSO)、牛血清白蛋白(BSA)和海藻糖。

本发明根据中华乌塘鳢精子的特性，配制了适合中华乌塘鳢精子活动的稀释液，并且在稀释液中添加了多种抗冻保护剂(DMSO、BSA和海藻糖)制备精子冻存液，将中华乌塘鳢精子和上述冻存液混合，在精子冻存液的高渗透压下，精子可以快速脱水，并且抗冻试剂能够较好的进入精子细胞中，精子在冻存液的短暂平衡下，经过快速低温冷冻可以有效防止冰晶的形成，从而减少精子的损伤，提高精子的冻存成活率以及体外受精率。

优选地，上述的精子稀释液包括以下质量浓度的成分：

(7.10-8.10)g/L氯化钠、(0.30-0.70)g/L磷酸二氢钠、(1.05-1.30)g/L碳酸氢钠、(0.20-0.60)g/L氯化钾、(0.15-0.45)g/L二水氯化钙、(0.50-1.50)g/L D-葡萄糖、(0.15-0.35)g/L七水硫酸镁。

进一步地，所述精子稀释液包括以下质量浓度的成分：

7.66g/L氯化钠、0.51g/L磷酸二氢钠、1.16g/L碳酸氢钠、0.38g/L氯化钾、0.31g/L二水氯化钙、1.00g/L D-葡萄糖、0.26g/L七水硫酸镁。

优选地，所述精子稀释液的pH为6.5-7.5，渗透压为(300-350)mOsmol/kg。进一步地，所述精子稀释液的pH为7.0、渗透压为320mOsmol/kg。

优选地，所述抗冻保护剂添加到精子稀释液中时，二甲亚砜(DMSO)的质量百分比浓度为5％-15％，牛血清白蛋白(BSA)的质量百分比浓度为1％-3％，海藻糖的质量浓度为(35.0-45.0)g/L。进一步地，DMSO的质量百分比浓度为10％，BSA的质量百分比浓度为10％，海藻糖的质量浓度为38.7g/L。

本发明还提供了上述的精子冻存液在中华乌塘鳢精子冷冻保存中的应用。

本发明还提供了一种中华乌塘鳢精子的冷冻保存方法，具体包括以下步骤：

S1、精液采集：在繁殖期，选择精巢发育成熟的健康雄性亲鱼，通过剪碎精巢收集精子；

S2、精液稀释：采用权利要求1-4任一项所述的精子冻存液对步骤S1中收集得到的精子进行稀释；

S3、精子冻存：先将步骤S2稀释后的精液置于室温进行避光平衡，然后置于液氮表面上方冷冻停留一段时间，紧接着没入液氮中进行快速冻存处理，最后转移到-150℃低温保存。

本发明的中华乌塘鳢精子冷冻保存方法方便快捷，无须特殊的冻存装备，冻存效率高。精子活性检测和体外授精结果表明，复苏后精子活力高，体外受精率高，冻存3个月的中华乌塘鳢精子存活率为97.27％，冻存18个月的中华乌塘鳢精子存活率为95.74％，体外平均受精率为55.23％。

优选地，步骤S2所述精子与精子冻存液的混合体积比为1:(2-4)。进一步地，所述精子与精子冻存液的混合体积比为1:(2-3)。

优选地，避光平衡后置于液氮表面上方(4-6)cm处停留(10-20)分钟。进一步地，避光平衡后置于液氮表面上方5cm处停留15分钟。

优选地，所述快速冻存处理的时间为(12-36)小时。进一步地，所述快速冻存处理的时间为24小时。

优选地，所述避光平衡的时间为8-12分钟。进一步地，所述避光平衡的时间为10分钟。

优选地，精子冻存后还包括精子复苏方法：即将步骤S3冻存的精子在37℃恒温水浴锅中轻轻摇晃迅速解冻后，于4度避光保存，使精子复苏。

精子冻存的最终目标是能应用于体外受精，复苏采用本发明方法冻存的中华乌塘鳢精子，将其与成熟卵子混合后进行体外受精，通过统计受精后原肠期胚胎的比例，计算得出冻存精子产生的受精卵的比例超过50％，与已报道的海水鱼类(除俄罗斯鲟鱼冻存精子受精率为90％之外)冻存精子的受精率(均不超过50％)相比，本发明方法可以大大提高冻存精子的体外受精率，有利于冻存精子的大规模生产和繁殖。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明提供一种精子冻存液，所述精子冻存液包括精子稀释液和抗冻保护剂，所述精子稀释液包括氯化钠、磷酸二氢钠、碳酸氢钠、氯化钾、二水氯化钙、D-葡萄糖和七水硫酸镁，所述抗冻保护剂包括二甲亚砜、牛血清白蛋白和海藻糖，该精子冻存液用于冻存中华乌塘鳢精子，损伤小。同时，在上述精子冻存液的基础上，本发明还提供了一种中华乌塘鳢精子的冷冻保存方法，该方法简便快速，不仅无须特殊的冻存装备，而且所用的冻存溶液可以一次性配置，经0.22微米滤膜过滤便可得到无菌的冻存液，可以长期于4℃储备；采用本发明方法冻存中华乌塘鳢精子，复苏后精子活力高，体外受精率高；可见，本发明具有简便性、损伤小、精子活力和体外受精率高等优势。因此，本发明可应用于中华乌塘鳢种质的保护以及大规模人工繁殖和生产中，具有重要的经济价值。

附图说明

图1为台盼蓝染色中华乌塘鳢精子的图片。

图1中，A为新鲜精子；B为实施例4中冻存3个月的中华乌塘鳢精子；C为实施例4中冻存18个月的中华乌塘鳢精子；D为对比例1中冻存18个月的中华乌塘鳢精子；E为对比例2中冻存18个月的中华乌塘鳢精子；标尺，50微米。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到的。

实施例1一种精子冻存液

该精子冻存液包括精子稀释液和抗冻保护剂。其中，精子稀释液包括以下质量浓度的成分：

7.66g/L氯化钠、0.51g/L磷酸二氢钠、1.16g/L碳酸氢钠、0.38g/L氯化钾、0.31g/L二水氯化钙、1.00g/L D-葡萄糖、0.26g/L七水硫酸镁。

上述精子稀释液的pH为7.0、渗透压为320mOsmol/kg。

抗冻保护剂包括DMSO、BSA和海藻糖。

将抗冻保护剂添加到精子稀释液中时，DMSO的体积百分比浓度为10％，BSA的质量百分比浓度为10％，海藻糖的质量浓度为38.7g/L。

实施例2一种精子冻存液

该精子冻存液包括精子稀释液和抗冻保护剂。其中，精子稀释液包括以下质量浓度的成分：

7.10g/L氯化钠、0.30g/L磷酸二氢钠、1.05g/L碳酸氢钠、0.20g/L氯化钾、0.15g/L二水氯化钙、0.50g/L D-葡萄糖、0.15g/L七水硫酸镁。

上述精子稀释液的pH为6.5、渗透压为300mOsmol/kg。

抗冻保护剂包括DMSO、BSA和海藻糖。

将抗冻保护剂添加到精子稀释液中时，DMSO的质量百分比浓度为5％，BSA的质量百分比浓度为5％，海藻糖的质量浓度为35.0g/L。

实施例3一种精子冻存液

该精子冻存液包括精子稀释液和抗冻保护剂。其中，精子稀释液包括以下质量浓度的成分：

8.10g/L氯化钠、0.70g/L磷酸二氢钠、1.30g/L碳酸氢钠、0.60g/L氯化钾、0.45g/L二水氯化钙、1.50g/L D-葡萄糖、0.35g/L七水硫酸镁。

上述精子稀释液的pH为7.5、渗透压为350mOsmol/kg。

抗冻保护剂包括DMSO、BSA和海藻糖。

将抗冻保护剂添加到精子稀释液中时，DMSO的质量百分比浓度为15％，BSA的质量百分比浓度为15％，海藻糖的质量浓度为45.0g/L。

实施例4中华乌塘鳢精子的冻存方法

(1)精子的采集：在中华乌塘鳢繁殖季节(5-9月份)，选择精巢发育成熟的健康雄性亲鱼，取出精巢，剪碎，加入500微升生理盐水(0.9％氯化钠溶液)，将精巢组织块溶液收集至1.5mL，静置2分钟，收集精子悬浊液。经过细胞活力检测精子的活力为98.2％，细胞计数板计数精子浓度为3.2×10

(2)精子的稀释：将步骤(1)采集的精子分别与实施例1的精子冻存液按照1:2的体积比混匀，稀释后的精子浓度为1.07×10

(3)精子冻存：将步骤(2)中经精子冻存液稀释后的精子转移到冻存管中，室温避光平衡10分钟，在将冻存管置于液氮表面上方5cm处停留15min后，冻存管没入液氮中冻存24小时，最后转移到-150度冰箱保存。

(4)精子活性检测：在冻存3个月和18个月之后，将装有精子的冻存管取出立即于37℃水浴锅中迅速轻轻摇晃解冻至溶液完全融化后取出，于4度避光保存，使精子复苏。然后按照下述方法进行精子活性检测：

将复苏后的精子用精子稀释液溶液稀释10倍，用1％的台盼蓝染色液与稀释后的精子进行染色后放于显微镜下观察，评估精子的活性。台盼蓝染色结果如图1A所示，新鲜精子的存活率为97.68％(2866/2934，N＝5)；如图1B所示，冻存3个月的中华乌塘鳢精子存活率为97.27％(1531/1574，N＝5)；如图1C所示冻存18个月的中华乌塘鳢精子存活率为95.74％(3348/3497，N＝5)。

(5)复苏冻存精子的体外授精

在冻存3个月之后，将装有精子的冻存管取出立即于37℃水浴锅中迅速轻轻摇晃解冻至溶液完全融化后取出，于4度避光保存，使精子复苏，然后按照下述方法进行体外授精：

按照大约1000颗卵添加50微升复苏精子的比例将精子和卵子轻轻混合均匀30秒后，倒入27摄氏度1.5％的人工海水中进行授精。在授精8小时后，统计进入原肠期胚胎的比例。如表1的结果所示，新鲜精子(精子来源1)的平均受精率为85.5％；本实施例的精子冻存液冻存的中华乌塘鳢精子(精子来源2)，其平均受精率为55.23％。

实施例5中华乌塘鳢精子的冻存方法

(1)精子的采集：在中华乌塘鳢繁殖季节(5-9月份)，选择精巢发育成熟的健康雄性亲鱼，取出精巢，剪碎，加入500微升生理盐水(0.9％氯化钠溶液)，将精巢组织块溶液收集至1.5mL，静置2分钟，收集精子悬浊液。经过细胞活力检测精子的活力为98.2％，细胞计数板计数精子浓度为3.2×10

(2)精子的稀释：将步骤(1)采集的精子分别与实施例1的精子冻存液按照1:3的体积比混匀，稀释后的精子浓度为7.54×10

(3)精子冻存：将步骤(2)中经精子冻存液稀释后的精子转移到冻存管中，室温避光平衡8分钟，在将冻存管置于液氮表面上方4cm处停留10min后，冻存管没入液氮中冻存12小时，最后转移到-150度冰箱保存。

(4)精子活性检测：检测方法同实施例4，其中，冻存3个月的中华乌塘鳢精子存活率为91.52％(图略)；冻存18个月的中华乌塘鳢精子存活率为88.37％(图略)。

(5)复苏冻存精子的体外授精：方法同实施例4，其平均受精率为50.35％。

实施例6中华乌塘鳢精子的冻存方法

(1)精子的采集：在中华乌塘鳢繁殖季节(5-9月份)，选择精巢发育成熟的健康雄性亲鱼，取出精巢，剪碎，加入500微升生理盐水(0.9％氯化钠溶液)，将精巢组织块溶液收集至1.5mL，静置2分钟，收集精子悬浊液。经过细胞活力检测精子的活力为98.2％，细胞计数板计数精子浓度为3.2×10

(2)精子的稀释：将步骤(1)采集的精子分别与实施例1的精子冻存液按照1:4的体积比混匀，稀释后的精子浓度为6.21×10

(3)精子冻存：将步骤(2)中经精子冻存液稀释后的精子转移到冻存管中，室温避光平衡12分钟，在将冻存管置于液氮表面上方6cm处停留20min后，冻存管没入液氮中冻存36小时，最后转移到-150度冰箱保存。

(4)精子活性检测：检测方法同实施例4，其中，冻存3个月的中华乌塘鳢精子存活率为89.51％(图略)；冻存18个月的中华乌塘鳢精子存活率为84.43％(图略)。

(5)复苏冻存精子的体外授精：方法同实施例4，其平均受精率为48.61％。

对比例1中华乌塘鳢精子的冻存方法

(1)精子的采集：在中华乌塘鳢繁殖季节(5-9月份)，选择精巢发育成熟的健康雄性亲鱼，取出精巢，剪碎，加入500微升生理盐水(0.9％氯化钠溶液)，将精巢组织块溶液收集至1.5mL，静置2分钟，收集精子悬浊液。经过细胞活力检测精子的活力为93.2％，细胞计数板计数精子浓度为3.2×10

(2)精子的稀释：将步骤(1)采集的精子分别与精子冻存液按照1:2的体积比混匀，稀释后的精子浓度为2.03×10

(3)精子冻存：将步骤(2)中经精子冻存液稀释后的精子转移到冻存管中，室温避光平衡10分钟，再将冻存管置于液氮表面上方5cm处停留15min后，冻存管没入液氮中冻存24小时，最后转移到-150度冰箱保存。

(4)精子活性检测：在冻存18个月之后，将装有精子的冻存管取出立即于37℃水浴锅中迅速轻轻摇晃解冻至溶液完全融化后取出，于4度避光保存，使精子复苏。然后按照下述方法进行精子活性检测：

将复苏后的精子用精子稀释液溶液稀释10倍，用1％的台盼蓝染色液与稀释后的精子进行染色后放于显微镜下观察，评估精子的活性。台盼蓝染色结果如图1D所示，该方法冻存精子的存活率为50.00％(305/610，N＝5)。

(5)复苏冻存精子的体外受精

在冻存3个月之后，将装有精子的冻存管取出立即于37℃水浴锅中迅速轻轻摇晃解冻至溶液完全融化后取出，于4度避光保存，使精子复苏，然后按照下述方法进行体外授精：

按照大约1000颗卵添加50微升复苏精子的比例将精子和卵子轻轻混合均匀30秒后，倒入27摄氏度1.5％的人工海水中进行授精。在授精8小时后，统计进入原肠期胚胎的比例。如表1的结果所示，对比例的精子冻存液冻存的中华乌塘鳢精子(精子来源3)，其平均受精率为10.6％。

对比例2中华乌塘鳢精子的冻存方法

(1)精子的采集：在中华乌塘鳢繁殖季节(5-9月份)，选择精巢发育成熟的健康雄性亲鱼，取出精巢，剪碎，加入500微升生理盐水(0.9％氯化钠溶液)，将精巢组织块溶液收集至1.5mL，静置2分钟，收集精子悬浊液。经过细胞活力检测精子的活力为93.2％，细胞计数板计数精子浓度为3.2×10

(2)精子的稀释：将步骤(1)采集的精子分别与精子冻存液按照1:2的体积比混匀，稀释后的精子浓度为2.03×10

(3)精子冻存：将步骤(2)中经精子冻存液稀释后的精子转移到冻存管中，室温避光平衡10分钟，在将冻存管置于液氮表面上方5cm处停留15min后，冻存管没入液氮中冻存24小时，最后转移到-150度冰箱保存。

(4)精子活性检测：在冻存18个月之后，将装有精子的冻存管取出立即于37℃水浴锅中迅速轻轻摇晃解冻至溶液完全融化后取出，于4度避光保存，使精子复苏。然后按照下述方法进行精子活性检测：

将复苏后的精子用精子稀释液溶液稀释10倍，用1％的台盼蓝染色液与稀释后的精子进行染色后放于显微镜下观察，评估精子的活性。台盼蓝染色结果如图1E所示，该方法冻存精子的存活率为61.30％(854/1391，N＝5)。

(5)复苏冻存精子的体外受精

在冻存3个月之后，将装有精子的冻存管取出立即于37℃水浴锅中迅速轻轻摇晃解冻至溶液完全融化后取出，于4度避光保存，使精子复苏，然后按照下述方法进行体外授精：

按照大约1000颗卵添加50微升复苏精子的比例将精子和卵子轻轻混合均匀30秒后，倒入27摄氏度15％的人工海水中进行授精。在授精8小时后，统计进入原肠期胚胎的比例。如表1的结果所示，对比例的精子冻存液冻存的中华乌塘鳢精子(精子来源4)，其平均受精率为33.5％。

表1不同精子冻存液冻存中华乌塘鳢精子的受精率统计表

注：1、新鲜精子；2、本发明实施例4冻存的精子；3对比例1冻存的精子；4、对比例2冻存的精子。*表示后续90％以上的胚胎发育畸形。

以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。