测定人血浆样本肾素活性的试剂盒和方法

摘要

本发明涉及一种测定人血浆样本肾素活性的试剂盒和方法，本发明的试剂盒包括(1)标准曲线工作液配制试剂盒；(2)内标工作液配制试剂盒；(3)样本前处理缓冲液配制试剂盒；(4)质控样本配置试剂盒；(5)反应终止液试剂盒；(6)液相色谱梯度洗脱液。采用本发明的试剂盒和方法，具有高效率，低成本，操作简便，准确度高和灵敏度高等优点。

说明书

技术领域

本发明涉及医疗技术领域，主要涉及一种测定人血浆样本肾素活性的试剂盒和方法。

背景技术

血浆肾素活性(Plasma Renin Activity，PRA)是衡量在肾素催化下，外周血中血管紧张素I产生效率的指数，在肾素血管紧张素醛固酮系统(RAAS)所致高血压的分型诊断中有重要意义，其在肾动脉狭窄导致的高血压患者中活性明显增高，在继发性醛固酮增多症患者中则减低。在肾上腺功能不足的患者中，肾素活性也是衡量替代激素疗法有效性的重要指标，其在激素替代疗法效果充分的患者中数值正常，而在替代疗法效果不足的患者中数值会升高。肾素活性也是原发性醛固酮增多症(Primary Aldosteronism，简称PA)筛查的最重要指标。目前常用免疫测定技术检测血浆肾素活性(PRA)或直接肾素浓度测定(Direct Renin Concentration，DRC)，前者是通过测定血管紧张素I产生的速率来计算，而后者则通过放射免疫法直接测定血浆肾素浓度。目前直接肾素浓度检测方法正在不断改进中,不同方法或试剂所得的测定结果相差甚远，还需进行大规模的临床试验或人群研究，才有可能取代肾素活性检测成为一线检测方法。免疫法测定肾素活性则存在免疫法地固有缺陷，方法特异性较差，存在交叉偶联反应，灵敏度较低，线性范围较窄，前处理过程较复杂，无法满足实际临床上原醛症患者较低水平PRA的检测需求。然而现有的高效液相色谱质谱检测方法需要比较复杂的前处理固相提取操作(SPE)或者要额外增加或者改装二维液相色谱系统，方法较复杂，检测仪器和耗材成本高，技术难度高，不适合临床的大批量样本处理的需要，推广难度较大。此外，肾素活性检测的结果容易受到实验条件的影响，例如缓冲盐浓度，pH，血浆基质，孵育的温度等，经常遇到室内和室间的检测偏差，如何控制结果和数据的准确性和重现性也是现有肾素活性检测中的重要难点问题。因此迫切需要一种改进的人血浆样本肾素活性检测的高效液相色谱串联质谱分析方法以及与其配套的可覆盖从前处理到仪器检测的全流程的完善的质控体系，使得该方法具有高效率、高通量、低成本、操作简便，准确度高和灵敏度高的优点，同时对检测全过程的准确性和结果重现性进行有效监控，保证实际临床肾素活性检测的准确性，便于临床推广和应用。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种改进的人血浆样本肾素活性检测的高效液相色谱串联质谱分析试剂盒以及分析方法。为了实现本发明的目的，拟采用如下技术方案：

本发明一方面涉及一种测定人血浆样本肾素活性的试剂盒，所述试剂盒为高效液相色谱串联质谱分析试剂盒，其包括如下组分：

(1)标准曲线工作液配制试剂盒：其包括血管紧张素I标准品、40-60体积％浓度的甲醇水溶液、1-8质量％浓度牛血清白蛋白BSA水溶液；

(2)内标工作液配制试剂盒：其包括血管紧张素I同位素内标ANG I-

(3)样本前处理缓冲液配制试剂盒：50-200mM浓度的苯甲基磺酰氟甲醇溶液、pH到5.45-5.50之间的0.5-2mol/L Tris和0.1-0.5mol/L EDTA缓冲溶液；

(4)质控样本配置试剂盒：其包括EDTA抗凝的血浆样本和血管紧张素I标准品溶液；

(5)反应终止液试剂盒：甲酸；

(6)液相色谱梯度洗脱液：体积比0.05-0.2％甲酸水溶液，体积比0.05-0.2％甲酸的甲醇溶液，在梯度洗脱程序中两者的体积比为90～5％：10～95％。

在本发明的一个优选实施方式中，所述标准曲线工作液中血管紧张素I的浓度介于0.2ng/mL-30ng/ml。通过将标准曲线工作液中血管紧张素I控制上述浓度范围，能够获得良好的线性关系。

在本发明的一个优选实施方式中，所述标准曲线工作液配制试剂盒中BSA水溶液浓度为1-8质量％浓度。本发明通过将BSA控制在优选的范围内，有利于模拟生物基质。

在本发明的一个优选实施方式中，所述质控样本试剂盒保存在-20～-80℃条件下。

本发明另一方面涉及一种测定肾素活性的人血浆样本前处理工艺，其包括使用上述试剂盒进行处理得到人血浆样本，其包括如下步骤：

(1)采用标准曲线工作液配制试剂盒制备标准储备液和标准曲线工作液；

(2)采用内标工作液配制试剂盒制备内标储备液和内标工作液；

(3)采用质控样本配置试剂盒配制质控样本，所述质控样本包括血管紧张素I低浓度质控样本和高浓度质控样本，是由EDTA抗凝的血浆样本中额外加入(1)中的不同浓度或者体积的血管紧张素I标准储备液或标准溶液得到；所述质控样本包括肾素活性不同的低活性质控样本和高活性质控样本，其中高活性血浆样本为新鲜采集后的血浆样本，低活性血浆样本为2-8℃条件下放置3～7天处理后的血浆样本；

(4)采用样本前处理缓冲液配制试剂盒制备样本前处理缓冲液，将样本前处理缓冲液置于多孔板中；

(5)将待测样品平行取2份，置于2个多孔板的样本孔中，其中一个多孔板在孵育2-4小时候后采用反应终止液甲酸终止再加入内标工作液配制试剂盒配制的内标工作液得到孵育后样本，离心取上清液；另一个多孔板混匀后立即采用反应终止液甲酸终止再加入内标工作液配制试剂盒配制的内标工作液得到未孵育样本，离心取上清液。

本发明另一方面还涉及一种测定人血浆样本肾素活性的方法，其包括上述人血浆样本前处理工艺以及采用液相色谱串联质谱方法对孵育样本和未孵育样本分别进行检测。

在本发明的一个优选实施方式中，液相色谱采用梯度洗脱，色谱柱为C18柱，流动相A相为0.05-0.2体积％的甲酸水溶液，流动相B相为0.05-0.2体积％甲酸的甲醇溶液，流动相A和流动相B的体积比为90～5％：10～95％。

在本发明的一个优选实施方式中，梯度洗脱程序如下：

在本发明的一个优选实施方式中，所述质谱为三重四极杆质谱仪，采用电喷雾离子源和正离子模式(ESI+)和多反应监测(MRM)模式进行质谱检测。

在本发明的一个优选实施方式中，所述肾素活性为(孵育后样本血管紧张素I浓度-未孵育样本血管紧张素I浓度)/孵育时间。

在本发明的一个优选实施方式中，所述的检测误差质量控制是通过比较质控样本的检测指标数值和理论靶值的偏差，从而评价检测结果准确度，其中检测指标包括质控样本的未孵育和孵育后的血管紧张素I的浓度和质控样本的肾素活性水平。

本发明的有益效果在于，(1)前处理操作简单，采用沉淀蛋白方法，避免了浓缩吹干和复溶等操作，对操作人员的要求较低，同时节约人力和工作时间；(2)直接利用ESI检测模式可以进行多电荷带电粒子检测的原理，可对其进行直接检测，而不需要对血管紧张素I进行消化水解，避免了额外的、不必要的劳动；(3)前处理设备均为实验室常规配置，试剂成本低廉且容易购买，项目易于在临床开展；(4)操作简便，可在96孔板进行常规处理，便于实现高通量检测和检测方式的自动化；(5)质量控制体系设置了未孵育和孵育后两套质控系统，从而保证样本仪器检测和前处理流程(特别是孵育过程)的准确性和重现性，方便发现问题，进行及时纠正。

特别需要说明的是，采用本发明的试剂盒和方法，具有高效率，低成本，操作简便，准确度高和灵敏度高等优点。

附图说明

图1血管紧张素I检测的定量下限的色谱图：(A为AngI，B为AngI内标)；

图2内标法建立的标准曲线线性回归图。

具体实施方式：

下面结合实例对本发明作进一步说明，以下实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明做出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。

实施例1：利用液相色谱串联质谱技术进行人血浆样本肾素活性检测的分析方法

储备液的配制

血管紧张素I一级储备液：准确称取1mg血管紧张素I标准品，将其溶于10mL50％甲醇水溶液，将其配制成为100μg/mL的一级储备液。

血管紧张素I二级储备液的配制：吸取100μL血管紧张素I的一级储备液，将其用900μL 50％甲醇水溶液稀释成为10μg/mL的二级储备液。

注：以上配制的储备液均保存于-20℃冰箱中。

标准曲线工作液的配制：

(1)吸取100μL血管紧张素I的二级储备液，将其用900μL 50％甲醇水溶液稀释成为1μg/mL的三级储备液。

表1：三级储备液的配制

(2)三级储备液用1％BSA水溶液稀释成系列标准曲线(SD)1，2，3，4，5，6，7，标准曲线具体配制方式见下表。

表2：标准曲线配制表

注：以上配制的储备液保存于-80℃冰箱中；标准曲线工作溶液分装成小份，暂时不用的部分保存于-80℃冰箱中，现用工作溶液保存于4℃冰箱中。

内标储备液的配制：

(1)血管紧张素I同位素内标一级储备液：向装有0.1mg血管紧张素I同位素内标(ANG I-

(2)血管紧张素I同位素内标二级储备液：精密吸取100μg/mL的血管紧张素I同位素内标一级储备液10μL，并向其中加入990μL的50％甲醇水溶液，将其稀释成为1μg/mL血管紧张素I同位素内标的二级储备液。

内标工作液的配制：

精密吸取50μL 1μg/mL的血管紧张素I内标二级储备液，以及1mL 89mg/mL的硫酸锌(ZnSO4.7H2O)水溶液，置于10mL的离心管中，并向其中加入8950μL甲醇，混匀，即得5ng/mL血管紧张素I的内标工作液。

质控样本配制：

取新鲜的EDTA抗凝的人血浆样本混合作为本底，分装为2部分，其中混合血浆A置于-20℃下保存，另一部分混合血浆B首先置于2-8℃下放置7天后再置于-20℃下保存。

取10mL混合血浆A，置于冷冻冰盒或者冰袋上，加入5μL血管紧张素I三级储备液，涡旋30秒，快速分装，分装体积约为250μL，作为低浓度质控(L)；

取10mL混合血浆B，置于冷冻冰盒或者冰袋上，加入50μL血管紧张素I三级储备液，涡旋30秒，快速分装，分装体积约为250μL，作为高浓度质控H。

其它溶液的配制：

ZnSO

苯甲基磺酰氟(PMSF)溶液的配制：取0.174g PMSF加入10mL甲醇中，配制成为100mM的PMSF甲醇溶液，储存条件为2-8℃。

生成缓冲液：12.11g三羟甲基氨基甲烷(TRIS)和7.4g乙二胺四乙酸EDTA到100mL容量瓶中，加入去离子水到90mL，超声30min至溶解均匀。加入去离子水到刻度线，混匀。转移到聚丙烯材质的储存容器。用乙酸调节PH到5.45-5.50之间，-20℃储存。

生成缓冲液A：在检测分析当天配置，将100μL的100mM PMSF溶液加入到10mL生成缓冲液中配制成为生成缓冲液A(pH值5.4-5.6)。

二、具体操作步骤：

(1)试剂准备：首先向两块干净的1.2mL 96孔收集板中加入20μL的生成缓冲液A，用于后续的样本前处理。

(2)样本解冻：待测血浆样本置于冰水(0℃)解冻至融化。

(3)取样：平行取2份100μL的血浆样本转移至步骤(1)中准备好的两块板中，分别进行未孵育和孵育样本的检测，剩余样本立即放入-20℃冷冻。

(4)孵育样本的处理：将步骤(3)其中一批样本用硅胶垫封好，短暂涡旋，然后放入37℃水浴3小时，3小时后，加入12μL反应终止液甲酸，涡旋，再加入200μL含有5ng/mL血管紧张素I同位素内标ANG I-

(5)未孵育的样本处理：将步骤(3)中剩下的另一批样本用密封垫封好后涡旋混匀。立即加入12μL反应终止液甲酸，涡旋，再加入200μL含血管紧张素I同位素内标的内标工作液，涡旋混匀，随后在4℃15000rpm离心10分钟，取上清液100μL加入96孔进样板，进液相色谱串联质谱仪进样分析。

(6)计算肾素活性：肾素活性等于血管紧张素I的产生速率，其单位为ng/mL/hr，计算公式为：(孵育后血管紧张素I浓度-孵育前血管紧张素I浓度)/孵育时间，相关的检测结果如表7-表10所示。

进行液相色谱串联质谱分析时，液相色谱采用梯度洗脱，反相色谱法建立待测物的分离条件如下：色谱柱为Phenomenex Kinetex C18(2.6,100A,50x2.1mm)，流速为0.6mL/min，柱温为40℃；其中流动相A相为体积比0.1％的甲酸水溶液，流动相B相为体积比0.1％甲酸的甲醇溶液，流动相A和流动相B的体积比为90～5％：10～95％。梯度程序如下表4所示，血管紧张素I及其同位素内标的保留时间分别为：1.92min。

表4：梯度洗脱程序

进行质谱检测时，血管紧张素I采用三重四极杆质谱仪检测定量，仪器型号为SCIEX 4500MD，采用电喷雾离子源的正离子模式(ESI+)和多反应监测MRM模式进行质谱检测，相应的质谱检测方法设置如下表5所示，质谱条件如表6所示。

表5：质谱检测方法

表6质谱条件

采用内标法建立标准曲线，线性关系验证记录如下表7所示，计量单位为ng/mL。

表7：标准曲线验证结果

表8：标准曲线结果

在浓度范围内，检测的线性关系良好。

表9：日内的准确度和精密度：

低浓度质控和高浓质控分别检测未孵育和孵育后的血管紧张素I的浓度水平，日内的检测结果准确度和精密度(CV％)均小于15％，进一步计算得到的肾素活性的日内准确度和精密度均小于20％，结果表明，同一批次的样本检测结果的重现性和准确度符合检测要求。

表10：日间的准确度和精密度；

低浓度质控和高浓度质控分别检测未孵育和孵育的血管紧张素I水平，5个不同批次的检测结果的准确度和精密度(CV％)均小于15％，进一步计算得到的肾素活性的日间准确度和精密度均小于20％，表明该方法的不同批次的样本检测结果的重现性和准确度均符合检测要求。此外，本专利通过监测未孵育和孵育后的质控样本检测结果，不仅可分别监督日常临床检测中的每个检验批次的仪器检测过程和前处理肾素孵育反应过程是否存在异常，而且可以监督整个检测体系是否正常，可以更加系统全面的对实验过程进行控制，有利于日常临床检测中检测偏差和检测质量的控制，及时发现问题。

(1)储备液的制备以50％甲醇水作为溶剂：

血管紧张素I的溶解度在水中溶解较好，因此选择水作为溶解溶剂，但是在实际实验中发现，血管紧张素I在常规塑料离心管中存在吸附问题，从而导致在低浓度下其实际的浓度降低。实际结果也证明，见下表，当1000ng/mL水稀释标准溶液的实际浓度为理论浓度的64％，且随着浓度降低，数值偏差越来越大，与假设相一致。进一步分别考察了50％甲醇溶液，8％质量比例牛血清白蛋白BSA溶液，因此创新地加入有机溶剂甲醇去降低吸附作用，得到很好的回收率，见下表。50％甲醇和8％BSA稀释溶液的浓度均与理论浓度的差异很小。相比较而言，采用50％甲醇的更接近理论浓度，此外加入有机溶剂能够防止溶液变质，因此，选择以50％甲醇水替代BSA溶液作为溶剂来制备储备液，用于标准溶液的长期储存使用。

表11：不同溶剂的比较

(2)标准曲线的稀释液为1％牛血清白蛋白(BSA)

由于血管紧张素I为内源性物质，实际生物基质，血清和血浆等均含有不同浓度的血管紧张素I的浓度，因此采用模拟生物基质1％牛血清白蛋白溶液作为替代基质，该基质不含有内源性血管紧张素I，这样通过添加标准浓度的血管紧张素I溶液就可以获得不同水平准确浓度的标准浓度样本，用来配置短期使用的标准曲线浓度样本。

(3)质控样本的基质：

现有技术常采用BSA模拟基质来配置质控样本，该方法存在的问题是，BSA与实际血浆基质有较大的差异，并没有肾素等生物活性，而且存在以下几个方面的问题。A.采用BSA模拟基质不能反映实际血浆样本基质对于前处理和检测过程的干扰与影响作用，因此，采用模拟基质BSA进行的方法学验证，证明准确度和精密度结果良好，不代表该方法在进行实际血浆样本检测过程中具有相同的性能。B.血浆存在血管紧张素I的合成酶与代谢酶，会导致检测结果过高或者过低，这与实际检测未知血浆样本的性质相近，但是采用BSA基质的质控，则无法反映在检测过程中这些酶对检测的影响作用，详见表12。(3)BSA基质中不含有血管紧张素I转化酶和肾素，因此采用该质控无法对孵育后样本进行质量监控，从而对肾素活性检测中的孵育转化过程进行质量监控，无法发现当前检测批次的孵育过程的结果偏差，详见表13。

表12常温下BSA配置的质控与血浆基质的质控的稳定性的变化差异

BSA基质的质控在常温放置下，浓度随着时间无显著变化，但是血浆基质的质控样本在常温下随着时间，有明显的降低(可能是血管紧张素代谢酶的催化作用)，这在低浓度和高浓度的质控中均呈现一致的规律。结果显示两种基质的稳定性存在明显的差异，采用BSA基质不能完全模拟实际样本中的血管紧张素I的状态，因此BSA基质对方法的准确度验证并不能反映方法在实际样本检测中的准确度和检测性能。

该结果显示前处理过程中血浆样本在室温下放置时间必须尽可能短，或者操作过程尽量保持低温状态，否则会导致血管紧张素I转化降解，引起肾素活性检测结果偏差。

表13孵育环境下，不同基质质控的变化差异

结果显示孵育过程的前后，BSA基质孵育前后无明显变化，而血浆基质的质控在孵育前后有明显数倍的升高，结果表明BSA基质无法实现模拟孵育过程，并进行质量监控。因此血浆基质要优于BSA基质的质控。

(4)质控样本保存温度条件

由于血浆中存在多种血管紧张素I代谢酶，相关文献中提及这些酶在孵育过程中会对结果产生影响，实际结果显示在常温下质控的配置过程中，温度会对结果会产生很大影响，从而影响孵育前和孵育后的血管紧张素I的检测结果，如下表14所示。

表14：配置和保存温度对质控样本的影响

当常温下用血浆配置质控时，发现其回收率显著偏低，进一步考察了配置过程温度对于回收率的影响，低温下(2-8℃)回收率较高，而室温下长时间放置(超过1小时)回收率偏低。这可能是由于血浆中的血管紧张素I代谢酶在低温下活性低，在室温下活性较高导致的结果。通过改进配置和储存的温度条件，抑制降解酶的活性，降低质控中血管紧张素I的降解，从而获得较高的提取回收率。目前尚无对于血管紧张素I的质控配置方法的文献研究。

(5)孵育样本前处理过程的质量过程

肾素活性的计算需要分别测定未孵育样本和37℃孵育的样本的血管紧张素I的水平，再代入公式计算肾素活性，其中孵育后的检测结果受到孵育过程缓冲液组成，浓度，pH和孵育过程的温度影响较大，因此需要对这一过程进行严格的质量监控，从而保证孵育后血管紧张素I的检测和肾素活性结果计算的准确性。

采用现有技术的方法，用BSA模拟基质来配置质控，缺少肾素，血管紧张素原和血管紧张素转化酶，无法模拟孵育过程中血管紧张素I的生成变化，因此无法监控孵育的过程。本申请方案创新性地采用实际血浆基质的质控样本，并设计2种不同血管紧张素I浓度和不同肾素活性的质控方案，通过考察血管紧张素I水平和肾素活性水平等指标，对检测方法引起的偏差进行全面的监测，并在前处理过程中添加苯甲磺酰氟(PMSF)和EDTA抑制血管紧张素转换酶(ACE)将血管紧张素I转换为血管紧张素II的活性，保证孵育过程和肾素活性结果的准确性。

本申请通过解决以上的一系列技术问题建立了基于真实血浆基质的肾素活性检测的质控体系，该系统能够有效对肾素活性的检测和前处理过程进行监督，此外该系统也可用于肾素活性检测方法的进一步研究和改进。

(6)前处理沉淀蛋白方法

现有技术的血管紧张素I检测前处理方法为在线柱切换方法和离线SPE固相提取方法，其中在线柱切换方法自动化程度较高，但是液相色谱设备的搭建和维护难度较大，技术门槛较高，且第一级分离柱需要经常更换，成本较高。SPE固相萃取方法的前处理较复杂，需要活化，上样、淋洗和洗脱，以及浓缩和复溶等操作。与这些方法相比，本专利的样本前处理过程采用了简单的沉淀蛋白方法，有以下的优势A.简单易行，人员操作的难度低；B.对仪器设备无特殊要求，不需要安装二维色谱系统，也不需要正压负压的前处理装置，标准配置的液相质谱仪即可满足检测的需求，前处理设备为实验室常规配置的涡旋仪和离心机，对人员要求低，只需要可以进行常规的移液器和液相质谱操作即可，操作简单，不需要蛋白水解的操作，简单的培训即可掌握；C.试剂成本低廉，易于推广，适合开发转化相应的商品化试剂盒；D.兼容96孔操作模式，便于实现检测的高通量和自动化。

表15：沉淀蛋白方法与现有技术的比较

(7)蛋白沉淀剂的组成

常用的蛋白沉淀剂种类包括有机溶剂、中性盐溶液及强酸等。通过比对，本发明选择的蛋白沉淀剂组成为甲醇与硫酸锌水溶液的混合试剂，且沉淀剂中含有血管紧张素I的同位素内标。此内标沉淀剂的加入，在加入同位素内标的同时，可以实现对血浆样本有效蛋白沉淀。蛋白沉淀剂的溶液组成为90％甲醇体积比，10％的硫酸锌水溶液(89mg/mL)。在进行血浆样本的前处理时，蛋白沉淀剂可以按照1：1的体积比加入沉淀前样本溶液，即可实现充分的蛋白沉淀效果，减低样本稀释的倍数，提高待测物响应。

已知文献中，有国外实验室采用SPE方法进行血浆样本的前处理。本发明对现有技术的SPE方法及自建蛋白沉淀(PPT)方法进行了方法比对，分别检测了三个质控样本及十例实际样本的血管紧张素I含量，对比结果如下表所示，两种前处理方式的检测结果对比偏差较小，但本发明的方法明显更为简单，对设备和实验人员的要求都更低。

表16：已有的SPE方法及本申请的蛋白沉淀(PPT)方法的比较

结果显示本专利方法与文献中SPE固相提取检测方法的结果无明显偏差，结果误差在80～120％以内，检测结果比较一致，但本专利采用的沉淀蛋白法检测成本较低。

以上描述了本发明优选实施方式，然其并非用以限定本发明。本领域技术人员对在此公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。