一种共表达羊口疮病毒B2L和F1L蛋白的重组山羊痘病毒

摘要

本发明提供一种用于重组山羊痘病毒构建的重组转移载体。所述的转移载体主要包含：TK基因的左臂和右臂、两个逆向的p7.5K启动子及其分别调控的羊口疮病毒B2L基因和F1L基因、p11K启动子、增强型绿色荧光蛋白(eGFP)基因、两个顺向Loxp序列。所述的转移载体与山羊痘病毒在羊睾丸细胞内发生同源重组，获得表达eGFP的重组山羊痘病毒，在Cre酶作用下，eGFP基因及p11K启动子被特异性敲除，获得潜在共表达羊口疮病毒B2L和F1L蛋白的重组山羊痘病毒。

说明书

技术领域

本发明属于重组病毒构建技术领域，具体涉及一种共表达羊口疮病毒B2L和F1L蛋白的重组羊痘病毒。

背景技术

羊口疮又称传染性脓疱，由羊口疮病毒(orf virus,ORFV)感染导致。该病最易感染羔山羊和羔绵羊，多呈群发性流行，成年羊同样易感，人亦感染，因此属于人兽共患病。患病羊主要表现为口唇处皮肤和粘膜形成丘疹、脓疱、溃疡并结成疣状厚痂。该病主要通过密切接触传播，病羊损伤的皮肤及黏膜是主要的传播途径，也可通过被病羊污染的厩舍或牧场引起。本病的预防通常采用弱毒苗免疫接种。

ORFV为痘病毒科(Poxviridae)、副痘病毒属(Parapoxvirus)成员，其基因组是两端闭合的线性双股DNA，全长约135kb。ORFV B2L基因(开放阅读框为1137bp)编码一个高免疫原性的囊膜蛋白，B2L蛋白(379aa，约42kD)，该蛋白可在体内诱导较高滴度的病毒中和抗体，且具有肿瘤治疗及修饰免疫反应的潜力。另一个具有较强免疫原性的蛋白是F1L蛋白，其同样是囊膜蛋白，全长217aa，约37kD。

山羊痘病毒(goatpox virus,GTPV)属于痘病毒科(Poxviridae)、羊痘病毒属(Capripoxvirus)成员。GTPV基因组为两端共价闭合、线性双股DNA，对外源基因容纳性较高，若经适当修饰，可成为理想的活疫苗载体。胸苷激酶(thymidine kinase,TK)基因是痘病毒复制的非必需基因，因此作为同源重组基因广泛用于重组GTPV构建。外源抗原基因插入至TK基因会破坏其表达，但不显著影响重组GTPV的复制。若外源蛋白能在体内表达且诱导理想的免疫保护作用，重组病毒将是潜在的活疫苗候选株。

发明内容

本发明提供一种共表达羊口疮病毒B2L和F1L蛋白的重组羊痘病毒GTPV，从而弥补现有技术的不足。

本发明首先提供一种用于重组山羊痘病毒构建的重组转移载体，命名为“pLSEG-BF”；该重组转移载体携带氨苄青霉素抗性基因，还包含有如下的作用元件：TK基因的左臂(TK

所述的重组转移载体B2L和F1L基因上游皆为p7.5K启动子，下游皆为“ATTTTTAT”早期转录终止信号。

其中B2L原始基因第139至145bp序列(TTTTTGT)是一个潜在的早期转录终止信号序列。因此，为防止重组病毒的B2L mRNA转录提前终止，特将“TTTTTGT”同义突变为“TTCTTGT”。

所述重组转移载体的筛选marker为eGFP基因，受p11K启动子调控。eGFP基因和p11K启动子两端为两个顺向Loxp序列，在Cre酶作用下，可将两个Loxp序列之间的部分特异性敲除，从而使重组病毒不含eGFP筛选marker。

作为实施例的一种具体记载，所述的转移载体的核酸序列为SEQ ID NO:1。

本发明提供的pLSEG-BF转移载体在永生化羊睾丸(GT)细胞内，通过TK基因左右同源臂与亲本GTPV发生同源重组，借助于eGFP筛选marker的指示作用，通过连续多次噬斑纯化，获得含B2L、F1L及eGFP基因的重组山羊痘病毒(GTPV-BF-eGFP)。该病毒在胞内Cre重组酶作用下，特异性敲除筛选marker，通过连续8轮噬斑纯化，筛选到潜在共表达B2L和F1L蛋白的重组GTPV(GTPV-BF)。

附图说明

图1：重组转移载体pLSEG-BF模式图。

图2：GTPV-BF-eGFP噬斑纯化。a：绿色荧光噬斑；b：亮场对照。

图3：F3/R3上下游引物退火位点。

图4：第8代GTPV-BF-eGFP噬斑纯化后PCR鉴定。M：DNA Marker；G：GTPV-BF-eGFP。

图5：筛选marker敲除的测序鉴定。黄色阴影序列：单一Loxp序列。

图6：重组山羊痘病毒(GTPV-BF)和母源山羊痘病毒(GTPV)生长曲线的比较。

具体实施方式

本发明利用分子克隆及同源重组技术，构建了一种重组山羊痘病毒转移载体(pLSEG-BF)，利用该重组载体与母源GTPV的同源重组，获得带有筛选marker的重组病毒。利用Cre-Loxp重组技术，对筛选marker进行特异性敲除，最终获得一株潜在共表达ORFV B2L和F1L蛋白的重组GTPV。

在本发明的实施例中，ORFV B2L蛋白的序列记载在NCBI数据库中，其编号为GenBank:KX951407；F1L的编号为GenBank:KX951408。

以下通过实施例来进一步阐明本发明。但是应理解，所述实施例只是举例说明的目的，并不意欲限制本发明的范围和精神。

实施例1.重组山羊痘病毒转移载体pLSEG-BF的构建

所构建的pLSEG-BF模式图如图1所示。TK基因的左臂(TK

实施例2.GTPV-BF-eGFP的构建

在六孔细胞培养板中接种GT细胞，培养至80－90％致密单层，接种GTPV AV41疫苗株，37℃作用2h。按照每孔加入150μL无血清Opti-MEM和6μL Lipofectamine 2000的比例，配制溶液I；按照每孔加入150μL无血清Opti-MEM和3μg pLSEG-BF的比例，配制溶液II。将溶液II逐滴加入溶液I中，轻柔混匀，室温静置20min。在此期间，吸弃六孔板内病毒液，每孔加入1mL Opti-MEM，再逐滴加入孵育后的脂质体与pLSEG-BF混合液。37℃5％CO

实施例3.GTPV-BF-eGFP的纯化

采用连续噬斑纯化的方法将GTPV-BF-eGFP从亲本毒种群中分离出来。将重组后病毒液冻融2次，按10

实施例4.GTPV-BF-eGFP纯化后的PCR鉴定

GTPV-BF-eGFP经历连续8次噬斑纯化后，采用病毒核酸提取试剂盒提取病毒液总核酸，进行PCR检测。首先根据TK

实施例5.GTPV-BF-eGFP筛选marker的敲除

将表达Cre重组酶的质粒转染至GT细胞，通过G418连续筛选3代，获得表达Cre重组酶的GT细胞(GT-Cre细胞)。将GTPV-BF-eGFP接种GT-Cre细胞，置于37℃5％CO

实施例6.GTPV-BF的纯化及鉴定

采用连续噬斑纯化法将GTPV-BF从亲本毒种群(GTPV-BF-eGFP)中分离出来。将收获的GTPV-BF病毒液冻融2次，按10

实施例7.GTPV-BF生长曲线测定

将GT细胞同时接种多个35mm细胞培养皿，次日将GTPV-BF及亲本毒(GTPV AV41疫苗株)分别平行感染多个GT细胞(MOI＝0.1)。感染0,24,48,72和96h后，分别将对应培养皿连续冻融2次并收获病毒液，测定不同培养时间点的病毒滴度，绘制重组毒和亲本毒的生长曲线(图6)。结果表明，外源片段的插入，并未显著影响病毒在细胞内的生长动力学。

应该理解，尽管参考其示例性实施方案，对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由后附的权利要求所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。

序列表

<110> 中国动物卫生与流行病学中心

<120> 一种共表达羊口疮病毒B2L和F1L蛋白的重组山羊痘病毒

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8222

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aagcttttta ttagtgggtt acctaatact atgtactcaa aggaagcact atcattaaat 60

agacaaccga taacatataa atattgtaat gatcttttac aatcaataaa tggatcacag 120

caagtattta ttaacgatat tcttagaaaa tgatgactcc ttttttaaat acttatcaga 180

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gtaaattatt taaaagatta cataaatata agtgatgatt attatctgta tgacggatcg 3840

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ttttttagtg atactagtaa gaaatataaa gaagaatatc ccattgttaa cataaacacc 5880

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tatctgtatg acgaattaat tcttgaagac gaaagggcct cgtgatacgc ctatttttat 6060

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cggccttttt acggttcctg gccttttgct ggccttttgc tcacatgttc tttcctgcgt 7920

tatcccctga ttctgtggat aaccgtatta ccgcctttga gtgagctgat accgctcgcc 7980

gcagccgaac gaccgagcgc agcgagtcag tgagcgagga agcggaagag cgcctgatgc 8040

ggtattttct ccttacgcat ctgtgcggta tttcacaccg catacttggt gtttggcttc 8100

agcaacaagt acaactctcc attcaccata atcatctttg acctctacaa ttccaccatc 8160

aggtttgatg ctggaatttg aaacaaataa agtaccgcca agatcagggt caattttttt 8220

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