羊口疮病毒和山羊痘病毒的分离鉴定及羊口疮病毒B2L蛋白单克隆抗体的研制

摘要

羊口疮病毒(Orf virus，ORFV)可感染山羊、绵羊和其他野生或家养的小反刍兽引起羊接触性传染性脓疱(Contagious ecthyma，CE)，又名羊口疮(Orf)。虽然感染在1-2月内可自行康复，但继发感染和生长缓慢同样严重影响养殖业的发展。山羊痘病毒(Goatpoxvirus，GTPV)可感染各种年龄、性别、品种的山羊，有报道称也可感染绵羊，引起急性热性接触性山羊痘病，该病最典型的临床症状为皮肤粘膜出现广泛性痘疹，羔羊、泌乳羊及老年羊发病严重，后期多因衰竭死亡，孕羊大多发生流产，严重威胁国内反刍动物的生长繁殖，是OIE规定的必须申报疾病之一，在GTPV流行地区造成巨大的经济损失。
　　羊口疮和羊痘在临床症状上十分相似，血清学诊断又存在交叉反应，同时混合感染也时有发生，一般很难快速鉴别，给疾病的治疗造成很多不必要的麻烦。本实验从江苏地区部分养殖场（户）采集病死羊病料，利用细胞培养从中分离GTPV和ORFV，通过PCR、遗传进化分析等方法对其进行鉴定，克隆表达了ORFV B2L蛋白并制备相应的单克隆抗体。取得了如下结果:
　　1.2013-2015年江苏部分地区ORFV和GTPV的分离鉴定
　　共采集羊病料121份，对其进行细菌分离和病毒分离鉴定。其中ORFV PCR检测阳性有4份，分别将其命名为 ORFV/Ovis/XZ/Jiangsu/2015/China、ORFV1/Ovis/DT/Jiangsu/2015/China、 ORFV2/Ovis/DT/Jiangsu/2015/China和ORFV/Ovis/SL/Jiangsu/2015/China。其中有1份是和GTPV混合感染的，扩增ORFV B2L基因全长并绘制遗传进化树，结果表明，XZ株和DT株核酸同源性分别为100.0％、98.6％、98.6％，与SC-JY、GX-YB、JS-FX株聚成一簇，核酸同源性分别为99.9％、100.0％、99.2％和98.5％、98.6％、97.8％。SL株与其他3株核酸同源性分别为98.8％、98.8％、98.5％，与LiaoNing、HuB、Gansu株亲缘关系接近，核酸同源性分别为98.8％、98.9％、98.9％。4株分离株与中国疫苗株的核酸同源性为96.8％-98.8％。用胎羊鼻甲骨细胞(OFTu)和MDBK细胞系对其进行分离，成功分离出2株。GTPV PCR检测阳性有2份，将其命名为Goatpox/WX/Jiangsu/2014/China和Goatpox/XZ/Jiangsu/2014/China。2株分离株与EF514890、EF522177、EF514892、HM572329、JN596275、EF514891株等聚成一簇，同源性接近，其中Goatpox/WX/Jiangsu/2014/China与其核酸同源性分别为98.7％-99.1％，Goatpox/XZ/Jiangsu/2014/China与其核酸同源性分别为99.4％-99.5％，与中国疫苗株的核酸同源性分别为98.6％和99.3％。扩增其P32全长基因绘制遗传进化树，结果表明，与其他地区分离株核苷酸序列同源性分别为97.3％-100％、97.7％-99.6％。用胎羊睾丸细胞(LT)和BHK-21细胞对其进行分离，成功分离出1株。
　　2.ORFV和GTPV多重PCR检测方法的建立
　　选择羊口疮病毒和羊痘病毒各自的保守基因P32和VIR，分别设计特异性引物，建立多重PCR(mPCR)检测方法。该方法特异性和广谱性较好，提取病料DNA的敏感度结果显示，鉴别羊痘、羊口疮病毒的最低检出量分别为0.098 ng/μL和0.46 ng/μL，可在同一个PCR反应体系中快速鉴定羊痘、羊口疮病毒感染或是两者混合感染。
　　3.ORFV B2L基因的原核表达
　　克隆ORFV的囊膜蛋白B2L基因，并将其插入pET-32a，转化表达菌株BL21。SDS-PAGE检测结果显示，在37℃、200rpm、0.6M IPTG条件下，融合蛋白B2L-His以可溶性形式大量表达。经His标签蛋白纯化试剂盒（可溶性蛋白）纯化后，重组蛋白浓度为4.183 mg/mL。
　　4.抗B2L蛋白单克隆抗体的制备
　　以纯化的His-B2L融合蛋白免疫六周龄Balb/c小鼠，取免疫小鼠脾细胞与SP2/0进行融合，通过间接ELISA方法筛选出与B2L蛋白反应呈阳性，与His蛋白反应呈阴性的孔进行亚克隆，获得1株能稳定分泌抗B2L蛋白抗体的杂交瘤细胞株，命名为6D5。IFA结果显示，该株单抗与感染ORFV的MDBK细胞反应产生特异性绿色荧光;Western-blot试验结果表明该株单抗与B2L蛋白反应，而与His蛋白不反应。
　　综上所述，ORFV和GTPV在江苏省仍有流行，存在潜在的爆发危险，应加强监测。对ORFV、GTPV的分子流行病学调查以及研制基于单抗隆抗体的检测技术对疾病的防控具有非常重要的意义。

目录

摘要

符号说明

文献综述

第一章 江苏部分地区羊口疮、羊痘病毒的分离鉴定

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

参考文献

第二章 羊口疮、羊痘病毒多重PCR检测方法的建立

1 材料与方法

2 结果

3．讨论

参考文献

第三章 羊口疮病毒B2L基因的原核表达

1 材料

2．方法

3．结果

4 讨论

参考文献

第四章 羊口疮B2L蛋白单克隆抗体的制备

1．试剂和材料

2 方法

3 结果

4 讨论

参考文献

全文总结

致谢

攻读硕士期间参与发表的学术论文

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