能够恢复由微尘引起的皮肤角质形成细胞分化抑制的物质的筛选方法以及用于恢复由微尘引起的皮肤角质形成细胞分化抑制的组合物

摘要

本发明涉及一种能够恢复由微尘引起的皮肤角质形成细胞分化抑制的物质的筛选方法，其包括确认皮肤角质形成细胞的原纤毛的相对形成程度的步骤，通过本发明的一方面，可以有效地筛选和发现能够恢复由微尘引起的皮肤角质形成细胞分化抑制的物质，从而可以促进由微尘引起的皮肤健康相关事业的发展。

说明书

技术领域

本发明涉及一种能够恢复由微尘引起的皮肤角质形成细胞分化抑制的物质的筛选方法，具体而言，涉及一种通过调节作为细胞器的原纤毛的长度和数量来筛选能够恢复由微尘引起的皮肤角质形成细胞分化抑制的物质的方法，及用于恢复由微尘引起的皮肤角质形成细胞分化抑制的组合物。

背景技术

皮肤在保护个体免受外部影响方面起到非常重要的屏障作用。屏障功能是防御各种外部刺激(化学物质、大气污染物质、干燥的环境、紫外线等)和防止体内水分通过皮肤而过度散发的保护功能，这种保护功能只有在由角质形成细胞构成的角质层正常形成的情况下才能维持。

在表皮中，存在于最外层的角质层(Stratum corneum，horney layer)由角质形成细胞形成，并且由完成分化的角质细胞和围绕其的脂质层构成(Marcelo C.L.等人，皮肤病学研究期刊，(J.Invest.Dermatol.),80,pp37-44,1983年)。

角质细胞是由在表皮最下层不断增殖(proliferation)的基底细胞(basal cell)经过阶段性的形态及功能变化并上升至皮肤表面的特征性细胞，当经过一定时间后，老的角质细胞从皮肤脱落，新的角质细胞会代替其功能，这种重复性的一系列变化过程称为“表皮细胞的分化(differentiation)”或“角质化(keratinization)”。

另外，在分化过程中，角质形成细胞(keratinocytes)生成天然保湿因子(Naturalmoisturizing factor；NMF)和细胞间脂质(神经酰胺、胆固醇、脂肪酸)的同时形成角质层，从而使角质层具有坚固性和柔韧性，具有作为皮肤屏障(skin barrier)的功能。

这种角质层的功能会因过度洗脸或洗澡等生活习惯因素、或特应性皮肤或老年性皮肤等的内源性疾病等而容易受损失。

一方面，微尘为颗粒微细到肉眼看不见的灰尘，是指直径为10μm或以下的灰尘，根据粒径分别区分为直径为10μm或以下的PM10(微尘)、直径为2.5μm或以下的PM2.5(超微尘)、直径为1.0μm或以下的PM1.0(极超微尘)。其中，PM(particulate matter)是指“颗粒状物质(漂浮在大气中的固体或液体状态的微粒)”。

作为有害物质的微尘是导致呼吸器官疾病和肺部疾病以及皮肤疾病及眼部疾病等的原因，与一般灰尘不同，无法被鼻子、口腔、支气管过滤而积累于身体中。尤其，在现代社会中，由这种微尘引起的皮肤屏障功能损伤而导致的皮肤干燥症状正在逐渐增加。

另外，细胞松弛素D也称为细胞松弛素，是已知的真菌毒素的一种，而关于由微尘引起的皮肤屏障功能损伤和细胞松弛素D之间的关联性尚未所知。

发明内容

技术问题

本发明的目的在于提供一种通过调节皮肤角质形成细胞的原纤毛(primarycilia)的数量和长度来有效地筛选能够恢复由微尘引起的皮肤角质形成细胞分化抑制的物质的新方法，及用于恢复由微尘引起的皮肤角质形成细胞分化抑制的组合物。

技术方案

为了实现上述目的，本发明的一实施例提供一种能够恢复由微尘引起的皮肤角质形成细胞分化抑制的物质的筛选方法，其包括以下步骤：

用实验物质处理皮肤角质形成细胞(keratinocyte)；

在用所述实验物质处理过的皮肤角质形成细胞中，确认用实验物质处理之前和之后的原纤毛(primary cilia)的相对形成程度；以及

当用所述实验物质处理之后的原纤毛的相对形成程度大于用所述实验物质处理之前的原纤毛的相对形成程度时，将所述实验物质判断为用于恢复由微尘引起的皮肤角质形成细胞分化抑制的物质。

本发明的另一实施例提供一种用于恢复由微尘引起的皮肤角质形成细胞分化抑制的组合物，其包含作为有效成分的细胞松弛素D(cytochalasin D)。

有益效果

在根据本发明的能够恢复由微尘引起的皮肤角质形成细胞分化抑制的物质的筛选方法中，通过包括确认皮肤角质形成细胞内原纤毛(primary cilia)的相对形成程度的步骤，从而可以更有效地筛选能够恢复由微尘引起的皮肤角质形成细胞分化抑制的物质，并可以确认利用现有方法未能发现的能够恢复由微尘引起的皮肤角质形成细胞分化抑制的物质，因此可以对相关领域的产业发展做出巨大的贡献。

此外，根据本发明的用于恢复由微尘引起的皮肤角质形成细胞分化抑制的组成物通过恢复在皮肤角质形成细胞中由微尘引起的原纤毛的生成抑制，从而可以有效地恢复由微尘引起的皮肤角质形成细胞分化抑制。

附图说明

图1示出了利用共聚焦显微镜观察到原纤毛(primary cilia)的长度和数量随着人类正常皮肤角质形成细胞的分化而增加(比例尺为10μm)。

图2示出了当对人类正常皮肤角质形成细胞进行微尘(PM10)和/或细胞松弛素D处理时，利用共聚焦显微镜观察到的原纤毛的长度和数量的变化(比例尺为10μm)。

图3a示出了当对人类正常皮肤角质形成细胞进行微尘(PM10)和/或细胞松弛素D处理时，通过RT-PCR确认到的内披蛋白(involucrin)的表达变化。

图3b示出了当对人类正常皮肤角质形成细胞进行微尘(PM10)和/或细胞松弛素D处理时，通过RT-PCR确认到的兜甲蛋白(loricrin)的表达变化。

图3c示出了当对人类正常皮肤角质形成细胞进行微尘(PM10)和/或细胞松弛素D处理时，通过RT-PCR确认到的丝聚合蛋白(filaggrin)的表达变化。

图3d示出了当对人类正常皮肤角质形成细胞进行微尘(PM10)和/或细胞松弛素D处理时，通过RT-PCR确认到的角蛋白1(keratin 1)的表达变化。

图3e示出了当对人类正常皮肤角质形成细胞进行微尘(PM10)和/或细胞松弛素D处理时，通过RT-PCR确认到的角蛋白10(keratin 10)的表达变化。

具体实施方式

以下，将详细描述本发明。

在本说明书中，“微尘”为颗粒微细到肉眼看不见的灰尘，是指直径为10μm或以下的灰尘，根据粒径分别区分为直径为10μm或以下的PM10(微尘)、直径为2.5μm或以下的PM2.5(超微尘)、直径为1.0μm或以下的PM1.0(极超微尘)，并且是包括上述全部的广义概念。其中，PM(particulate matter)是指“颗粒状物质(漂浮在大气中的固体或液体状态的微粒)”。

在本说明书中，“皮肤”是指覆盖于动物体表的组织，其以广义使用，不仅包括覆盖在诸如面部或身体等的体表的组织，而且还包括头皮和头发。此外，在本说明书中，皮肤不仅可以包括生物体皮肤，而且还可以包括实现生物体皮肤状态的人工皮肤或皮肤模拟物。

在本说明书中，“皮肤细胞分化”可以是指，角质形成细胞(keratinocyte)从皮肤最下层的基底层进行功能性分化而逐渐形成棘层、颗粒层、角质层的过程。

在本说明书中，“原纤毛”也称为初级纤毛(primary cilium(数量为多个时，primary cilia))，作为从细胞体突出的小器官，是用于感知包括化学刺激、物理刺激、光、渗透压、流体流动以及重力信号等的各种外部刺激的细胞器。

在本说明书中，“相对形成程度”可为，在对处于或未处于某种条件下的细胞的原纤毛(primary cilia)的形成程度或表达程度进行比较时，显示出形成或表达的与否、数量、量、质量(quality)的差异的程度。此外，所述形成程度可以包括，例如形成或表达原纤毛的细胞的数量或量、或原纤毛的长度。

在本说明书中，“细胞松弛素D”可以表示为cytochalasin D或cyto D。

在一方面，本发明提供一种能够恢复由微尘引起的皮肤角质形成细胞分化抑制的物质的筛选方法，其包括以下步骤：用实验物质处理皮肤角质形成细胞(keratinocyte)；在用所述实验物质处理过的皮肤角质形成细胞中，确认用实验物质处理之前和之后的原纤毛(primary cilia)的相对形成程度；以及当用所述实验物质处理之后的原纤毛的相对形成程度大于用所述实验物质处理之前的原纤毛的相对形成程度时，将所述实验物质判断为用于恢复由微尘引起的皮肤角质形成细胞分化抑制的物质。

在本发明的一实施例中，所述原纤毛的相对形成程度可以通过选自比较表达原纤毛的皮肤角质形成细胞的数量、及比较原纤毛的长度中的一种或多种来进行判定。

在本发明的一实施例中，所述原纤毛的相对形成程度可以根据选自内披蛋白(involucrin)、兜甲蛋白(loricrin)、丝聚合蛋白(filaggrin)以及角蛋白(keratin)中的一种或多种的表达程度来确认。例如，可以通过比较表达出内披蛋白、兜甲蛋白、丝聚合蛋白或角蛋白的皮肤角质形成细胞的数量，或比较在一个细胞内表达出的内披蛋白、兜甲蛋白、丝聚合蛋白或角蛋白的量来进行判定。当用所述实验物质处理之后表达出内披蛋白、兜甲蛋白、丝聚合蛋白或角蛋白的皮肤角质形成细胞的数量，或在一个细胞内表达出的内披蛋白、兜甲蛋白、丝聚合蛋白或角蛋白的量少于用实验物质处理之前时，可以认为所形成的原纤毛的表达量或其长度增加，并且可以将所述实验物质判定为能够恢复由微尘引起的皮肤角质形成细胞分化抑制的物质。

在本发明的一实施例中，所述角蛋白可包括选自角蛋白1(keratin 1)和角蛋白10(keratin 10)中的一种或多种。

此外，测定所述原纤毛的相对形成程度的方法可以由本领域技术人员适当地选择公知技术，例如免疫荧光分析、蛋白质印迹法(western blot)、斑点杂交法(dot blot)、酶联免疫法(enzyme-linked immunosorbent assay；ELISA)、诺瑟印迹法(northern blot)、PCR、RT-qPCR、GC-MS、LC-MS、NMR等，但不限于此。

在另一方面，本发明提供一种用于恢复由微尘引起的皮肤角质形成细胞分化抑制的组合物，其包含作为有效成分的细胞松弛素D(cytochalasin D)。

在本发明的一实施例中，所述细胞松弛素D可以增加表达原纤毛(primary cilia)的皮肤角质形成细胞的数量或所述原纤毛的长度。

在本发明的一实施例中，所述细胞松弛素D可以提高选自内披蛋白、兜甲蛋白、丝聚合蛋白以及角蛋白中的一种或多种的表达，所述角蛋白可以包括选自角蛋白1和角蛋白10中的一种或多种物质。

即，所述细胞松弛素D可通过增加皮肤角质形成细胞的原纤毛的表达来恢复由微尘引起的皮肤角质形成细胞的分化抑制。

在本发明的一实施例中，所述组合物可以为通过恢复由微尘引起的皮肤角质形成细胞分化抑制而用于皮肤保湿、或用于增强皮肤屏障功能的组合物。如果皮肤细胞分化进行不佳，则皮肤角质层无法发挥正常功能，从而降低皮肤的保水能力、降低皮肤屏障功能。因此，能够恢复由微尘引起的皮肤角质形成细胞分化抑制的物质可以针对微尘表现出皮肤保湿和增强皮肤屏障功能的效果。

在本发明的一实施例中，本领域技术人员可以在不损害本发明的目的及效果的范围内容易地选定所述细胞松弛素D的含量，例如，基于组合物总重量，所述含量可以为0.0001重量％至30重量％。并且，基于组合物总重量，所述含量可以为0.0001重量％或以上、0.0005重量％或以上、0.001重量％或以上、0.005重量％或以上、0.01重量％或以上、0.05重量％或以上、0.1重量％或以上、0.3重量％或以上、0.5重量％或以上、0.8重量％或以上、1重量％或以上、3重量％或以上、5重量％或以上、8重量％或以上、10重量％或以上、12重量％或以上、15重量％或以上、或18重量％或以上。并且，基于所述组合物总重量，所述含量可以为30重量％或以下、28重量％或以下、25重量％或以下、22重量％或以下、20重量％或以下、18重量％或以下、15重量％或以下、12重量％或以下、10重量％或以下、8重量％或以下、5重量％或以下、3重量％或以下、1重量％或以下、0.8重量％或以下、0.5重量％或以下、0.3重量％或以下、0.1重量％或以下、0.05重量％或以下、0.01重量％或以下、0.005重量％或以下、0.001重量％或以下、或0.0005重量％或以下。

在本发明的一实施例中，所述组合物可以为化妆品组合物。

所述化妆品组合物可以制备成适合于局部施用的的所有剂型。例如，可以制备为溶液、通过将油相分散在水相中获得的乳液、通过将水相分散在油相中获得的乳液、悬浮液、霜、固体、凝胶、粉末、糊剂、泡沫或气溶胶组合物的剂型。可以根据本领域的常规方法制备这些剂型的组合物。

在不损害主要效果的范围内，所述化妆品组合物除了包含上述物质之外，优选地还可以包含对主要效果能够产生协同效果的其他成分。所述化妆品组合物可以包含选自维生素、多肽、多糖及鞘脂中的物质。此外，所述化妆品组合物可以包含保湿剂、润肤剂、表面活性剂、紫外线吸收剂、防腐剂、杀菌剂、抗氧化剂、pH调节剂、有机颜料和无机颜料、香料、冷却剂或止汗剂。本领域技术人员可以在不损害本发明的目的及效果的范围内容易地选定所述成分的调配量，基于组合物的总重量，所述调配量可为0.01重量％至5重量％，具体为0.01重量％至3重量％。

在本发明的一实施例中，所述组合物可以为保健食品组合物。

所述保健食品是使用在日常膳食中易缺乏的营养素、或对人体具有有利功能的原料或成分(功能性原料)来制造的，可以指通过维持人体的正常功能或激活生理功能来维持和改善健康的食物，但不限于此。所述保健食品可制备、加工成片剂、胶囊、粉末、颗粒、液体剂、丸剂等形式，但不限于此，且可制备、加工成法律允许的任何形式。

除包含有效成分外，每种剂型的保健食品组合物还可以包含相应领域中通常所使用的成分，本领域技术人员可以毫无困难地根据剂型或使用目的选择这些成分进行配制，并且当与其它原料同时使用时可以获得协同效应。

除了本说明书中公开的有效成分之外，可以包含的液体成分不受特别限制，并且如通常的饮料一样，可以包含各种调味剂或天然碳水化合物等附加成分。所述天然碳水化合物例如包括单糖、葡萄糖、果糖等的二糖、麦芽糖、蔗糖等的多糖、糊精、环糊精等常规糖、以及木糖醇、山梨糖醇和赤藓糖醇等的糖醇等。可有利地使用天然调味剂(索马甜、甜叶菊提取物(例如莱鲍迪甙A、甘草甜素等)及合成调味剂(例如糖精、阿斯巴甜等)作为所述调味剂。在本说明书中公开的每100ml组合物中，所述天然碳水化合物的比率一般可为约1g至20g，在一方面可以为约5g至12g。

在一方面，所述食品组合物可以包含各种营养素、维生素、矿物质(电解质)、合成增味剂和天然增味剂等增味剂、着色剂及风味剂(奶酪、巧克力等)、果胶酸及其盐、海藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇、用于碳酸饮料的碳酸化剂等。在另一方面，可以包含用于制作天然果汁及蔬菜饮料的果肉。所述成分可以单独使用或组合使用。这些添加剂的比率可以更改，但基于100重量份的本说明书中公开的组合物，这些添加剂的比例通常选择为0.001重量份至约20重量份。

在又另一方面，本发明可以涉及一种用于恢复由微尘引起的皮肤角质形成细胞分化抑制的方法，其包括将有效剂量的所述细胞松弛素D给药于所需对象的步骤。

在又另一方面，本发明可以涉及一种用于恢复由微尘引起的皮肤角质形成细胞分化抑制的方法，其包括将组合物给药于所需对象的步骤，所述组合物包含作为有效成分的所述细胞松弛素D。

在又另一方面，本发明可以涉及一种通过恢复由微尘引起的皮肤角质形成细胞分化抑制来保湿皮肤或增强皮肤屏障功能的方法，其包括将有效剂量的所述细胞松弛素D给药于所需对象的步骤。

在又另一方面，本发明可以涉及一种通过恢复由微尘引起的皮肤角质形成细胞分化抑制来保湿皮肤或增强皮肤屏障功能的方法，其包括将组合物给药于所需对象的步骤，所述组合物包含作为有效成分的所述细胞松弛素D。

在本发明的一方面，所述方法的给药可以根据本说明书中记载的给药方法和给药剂量来进行。

在又另一方面，本发明可以涉及细胞松弛素D在制备用于恢复由微尘引起的皮肤角质形成细胞分化抑制的组合物中的用途。

在又另一方面，本发明可以涉及细胞松弛素D在制备通过恢复由微尘引起的皮肤角质形成细胞分化抑制而用于皮肤保湿、或用于增强皮肤屏障功能的组合物中的用途。

在又另一方面，本发明可以涉及细胞松弛素D的用于恢复由微尘引起的皮肤角质形成细胞分化抑制的用途。

在又另一方面，本发明可以涉及细胞松弛素D的通过恢复由微尘引起的皮肤角质形成细胞分化抑制来保湿皮肤保湿、或增强皮肤屏障功能的用途。

以下，通过实施例和实验实施例对本发明的内容进行更详细的描述。然而，这些实施例和实验实施例仅用于帮助理解本发明的内容，并不限制本发明的权力范围。本领域技术人员所做出的通常公知的改变、替换及插入均属于本发明的保护范围。

【实施例1】

使用添加有补充剂的KGM-Gold培养基(LONZA公司)并按照LONZA公司的说明书，在36℃、5％的CO

将所述人类表皮正常角质形成细胞以每孔0.5X10

使用Trizol

各数据通过至少三次的独立实验而获得，并表示为平均±SE(标准误差)。利用单向方差分析(1-way ANOVA)对结果进行统计评估(*p<0.05，**p<0.01)。

【实验实施例1】通过形成原纤毛(primary cilia)使由微尘引起的皮肤角质形成细胞分化抑制得到恢复

原纤毛为具有两极化结构的细胞内器官，纤毛的结合(形成纤毛)和分解通过细胞周期、极性、脊椎发育以及遗传性疾病等各种原因被相互连接。通过所述实施例1的免疫荧光分析，确认到原纤毛(用箭头表示)的长度和数量随着人类正常皮肤角质形成细胞的分化而增加(图1)。

因此，为了确认微尘对皮肤角质形成细胞的原纤毛带来的影响，在皮肤角质形成细胞中处理微尘(PM10)并经过四日之后进行观察，其结果可以确认到，与用已知的会抑制原纤毛生成的物质ciliobrevin A1进行处理的情况相同地未生成原纤毛，此时，在将cytochalasin D与微尘同时处理时，原纤毛的生成抑制重新得到恢复，因此原纤毛(用箭头表示)的数量或长度增加至与仅处理cytochalasin D时或未进行任何处理的对照组相等或更高的水平(图2)。

此外，当在皮肤角质形成细胞中处理微尘时，作为皮肤角质形成细胞分化标记的内披蛋白(图3a)、兜甲蛋白(图3b)、丝聚合蛋白(图3c)、角蛋白1(图3d)以及角蛋白10(图3e)的表达量大幅减少至与处理ciliobrevin A1相等或更严重的水平，但将cytochalasinD与微尘同时处理时，通过实施例1的Q-RT-PCR分析确认到各皮肤角质形成细胞分化标记的表达减少重新恢复到显着水平(图3a至图3e)。

综上所述，已确认微尘对皮肤角质形成细胞的原纤毛及分化过程带来影响。即，在皮肤角质形成细胞中处理微尘时，对皮肤角质形成细胞的分化过程起重要作用的原纤毛(primary cilia)的数量和长度会减少，并且作为分化标记的保湿因子的表达也会一同减少，由此，通过用增加原纤毛表达的物质，即细胞松弛素D对分化因微尘而受到抑制的皮肤角质形成细胞进行处理，从而增加原纤毛的表达，此时皮肤角质形成细胞分化标记的表达会增加，其结果由微尘引起的皮肤角质形成细胞分化抑制会得到恢复。通过利用这一点，可以筛选能够恢复由微尘引起的皮肤角质形成细胞分化抑制的物质。