用于鸽遗传多样性分析的线粒体微卫星标记引物及检测方法

摘要

本发明公开了用于鸽遗传多样性分析的线粒体微卫星标记引物及检测方法，属于分子遗传学技术领域。本发明用微卫星荧光标记方法解决了鸽线粒体由于序列复杂，用常规测序的方法无法准确测序的难题；本发明将线粒体标记和微卫星标记有机结合在一起，不受父系来源的影响，一对引物便可追溯母性祖先；本发明开发的分子标记多态性好、等位基因数目多，亲缘分析数据准确，可以用于鸽的遗传多样性评价和系谱验证，为鸽品种的开发利用提供遗传学依据。

说明书

技术领域

本发明涉及分子遗传学技术领域，更具体的说是涉及用于鸽遗传多样性分析的线粒体微卫星标记引物及检测方法。

背景技术

随着居民生活水平的提高，人们对高品质和安全的食品需求量越来越大。鸽肉蛋白含量高，脂肪含量低，安全性好，是人类理想的健康食品，民间素有“一鸽胜九鸡”的说法。据不完全统计，目前全国种鸽存栏达6000多万对，年产乳鸽总量达到7亿多只，生产总量已占到世界总量的80％以上。

尽管鸽养殖业经济效益很好，但其种质资源研究工作仍较为薄弱，生产繁育体系极不健全，大都是自繁自育，品种性能退化严重。开展鸽群体遗传结构分析和系谱鉴定工作，对于鸽优良品种资源保护和新品种培育具有重要的应用价值。

目前评价畜禽遗传多样性的方法应用较多的为微卫星和线粒体标记，微卫星标记具有高度的多态性、广泛而又随机地分布于整个基因组以及共显性遗传等优点，线粒体标记具有结构简单、缺乏重组、进化快速和严格的母系遗传等特点。迄今，未见在鸽线粒体的微卫星分子标记并应用的报道。

因此，提供用于鸽遗传多样性分析的线粒体微卫星标记引物及检测方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了用于鸽遗传多样性分析的线粒体微卫星标记引物及检测方法，该分子标记为鸽种质资源评价、遗传多样性分析和系谱验证提供工具。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

用于鸽遗传多样性分析的线粒体微卫星标记引物，所述微卫星标记引物序列如下：

正向引物：5’-TTTCCTATGATTACCACTGG-3’；SEQ ID NO.1；

反向引物：5’-TGTAAGCTACGGGGACG-3’；SEQ ID NO.2。

进一步，用于鸽遗传多样性分析的线粒体微卫星检测方法，具体步骤如下：

(1)提取待测鸽样品的基因组DNA；

(2)以步骤(1)提取的DNA为模板，合成上述引物对，并在正向引物5’端用FAM荧光染料标记，进行PCR扩增反应；

PCR反应体系为：2×PCRMix 25μL，10μmol/L正反向引物各1μL，50-100μg/ml模板DNA 2μL，超纯水21μL；

PCR反应程序为：95℃5min；95℃30s，59℃30s，72℃60s，35个循环；72℃10min；

(3)PCR产物进行琼脂糖电泳，或者在ABI 3730分析仪进行基因型判定。

进一步，步骤(1)所述样品为鸽的羽毛或血液。

进一步，所述的线粒体微卫星标记引物在鸽种质资源评价、遗传多样性分析和系谱验证中的应用。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了用于鸽遗传多样性分析的线粒体微卫星标记引物及检测方法，本发明用微卫星荧光标记方法解决了鸽线粒体由于序列复杂，用常规测序的方法无法准确测序的难题；本发明将线粒体标记和微卫星标记有机结合在一起，不受父系来源的影响，一对引物便可追溯母性祖先；本发明开发的分子标记多态性好、等位基因数目多，亲缘分析数据准确，可以用于鸽的遗传多样性评价和系谱验证，为鸽品种的开发利用提供遗传学依据。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明鸽线粒体微卫星标记在银王鸽中进行母系验证；

其中，A为公鸽；B为母鸽；C为乳鸽1；D为乳鸽2。

图2附图为本发明鸽线粒体微卫星标记在泰深鸽中进行母系验证；

其中，M为DNA marker；1为公鸽；2为母鸽；3为乳鸽1；4为乳鸽2。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1白羽王鸽遗传多样性研究

(1)提取36只白羽王鸽羽毛中的基因组DNA；

(2)以步骤(1)提取的DNA为模板，合成正反向引物，并在正向引物5’端用FAM荧光染料标记，进行PCR扩增反应；

正反向引物序列如下：

正向引物：5’-TTTCCTATGATTACCACTGG-3’；SEQ ID NO.1；

反向引物：5’-TGTAAGCTACGGGGACG-3’；SEQ ID NO.2；

PCR反应体系为：2×PCR Mix(南京诺唯赞生物有限公司)25μL，10μmol/L正反向引物各1μL，50-100μg/ml模板DNA 2μL，超纯水21μL；

PCR反应程序为：95℃5min；95℃30s，59℃30s，72℃60s，35个循环；72℃10min；

(3)PCR产物在ABI 3730分析仪进行基因型判定；

(4)运用Cervus3.0软件分析等位基因数(N

表1基于微卫星分子标记得到的白羽王鸽遗传信息

表1结果表明，本发明分子标记多态性丰富、应用价值高，能够应用于鸽遗传多样性分析以及群体结构分析。

实施例2银王鸽母系亲缘关系验证

(1)提取1窝银王鸽(公鸽、母鸽、2只乳鸽)羽毛中的基因组DNA；

(2)以步骤(1)提取的DNA为模板，合成正反向引物，并在正向引物5’端用FAM荧光染料标记，进行PCR扩增反应；

正反向引物序列如下：

正向引物：5’-TTTCCTATGATTACCACTGG-3’；SEQ ID NO.1；

反向引物：5’-TGTAAGCTACGGGGACG-3’；SEQ ID NO.2；

PCR反应体系为：2×PCR Mix(南京诺唯赞生物有限公司)25μL，10μmol/L正反向引物各1μL，50-100μg/ml模板DNA 2μL，超纯水21μL；

PCR反应程序为：95℃5min；95℃30s，59℃30s，72℃60s，35个循环；72℃10min；

(3)PCR产物在ABI 3730分析仪进行基因型判定；结果显示2只乳鸽与母鸽条带一致，与公鸽不一致(图1)，进一步证明了线粒体标记的母系遗传规律和本分子标记的高效性。

实施例3泰深鸽母系亲缘关系验证

(1)提取1窝泰深鸽(公鸽、母鸽、2只乳鸽)血液中的基因组DNA；

(2)以步骤(1)提取的DNA为模板，合成正反向引物，进行PCR扩增反应；

正反向引物序列如下：

正向引物：5’-TTTCCTATGATTACCACTGG-3’；SEQ ID NO.1；

反向引物：5’-TGTAAGCTACGGGGACG-3’；SEQ ID NO.2；

PCR反应体系为：2×PCR Mix(南京诺唯赞生物有限公司)25μL，10μmol/L正反向引物各1μL，50-100μg/ml模板DNA 2μL，超纯水21μL；

PCR反应程序为：95℃5min；95℃30s，59℃30s，72℃60s，35个循环；72℃10min；

(3)PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳；结果显示2只乳鸽与母鸽条带一致，与公鸽不一致(图2)，进一步证明了线粒体标记的母系遗传规律和本分子标记的高效性。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 江苏省家禽科学研究所

<120> 用于鸽遗传多样性分析的线粒体微卫星标记引物及检测方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

tttcctatga ttaccactgg 20

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

tgtaagctac ggggacg 17