一种提高链霉亲和素-生物素反应体系的化学发光试剂盒抗生物素干扰能力和灵敏度的方法

摘要

本发明公开了一种提高链霉亲和素‑生物素反应体系的化学发光试剂盒抗生物素干扰能力和灵敏度的方法，属于生物技术领域。一种提高链霉亲和素‑生物素反应体系的化学发光试剂盒抗生物素干扰能力和灵敏度的方法，在磁珠稀释液中添加SA磁珠组成磁珠包被物工作液；在酶标记物稀释液中添加碱性磷酸酶标记抗体组成碱性磷酸酶标记物工作液；在生物素标记物稀释液中添加生物素标记抗体组成生物素标记物工作液；将样本、磁珠包被物工作液、生物素标记物工作液顺序加入反应杯，孵育一定时间后，进行反应清洗，再加入碱性磷酸酶标记物工作液反应后进行清洗；本发明通过封闭未与生物素抗体结合的游离SA磁珠，减小非特异性信号，提高检测灵敏度。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种提高链霉亲和素-生物素反应体系的化学发光试剂盒抗生物素干扰能力和灵敏度的方法。

背景技术

链霉亲和素是由链霉菌分泌的一种蛋白质，它能与生物素发生特异性结合，它们之间的结合力是目前已知的最强的非共价键结合力。因为这一特性，链霉亲和素-生物素反应体系在纯化和检测领域得到了广泛的应用。链霉亲和素以同源四聚体的形式存在，每摩尔的四聚体分子可结合四摩尔的生物素分子，所以在免疫检测领域具有信号放大作用。

生物素的基本结构为双环结构：I环为咪挫酮环，是与亲和素结合的部位；II是噻吩环，含一个戊酸侧链，其末端羧基可与生物大分子连接，形成生物素标记抗原、抗体或酶等。生物素与生物大分子结合后不影响生物大分子和生物素原有的活性，即生物素标记抗体同时具有与亲和素和相应抗原特异性结合的特性。

利用链霉亲和素和生物素结合力强的特性，公告日：2011-10-05，专利号：CN102207501A中介绍了一种生物素化牛血清白蛋白和链霉亲和素酶标反应板及其制备方法，公开了在酶标板微孔内包被生物素化牛血清白蛋白和链霉亲和素，将生物素标记抗体和待测抗原同时加至板上，使抗原抗体反应处于液相中，提高反应效率，缩短反应时间，拓宽检测范围。改善了传统酶标反应板包被技术中的弊端，由于包被液中蛋白浓度很低、抗体分子不能完全覆盖所有位点，为避免反应时发生非特异性吸附，而需加入高浓度牛血清白蛋白来达到封闭空白位点的目的。

在化学发光体系中，发光方式有直接发光、间接发光和电化学发光，目前研究较多的是酶促发光，主要有HRP-鲁米诺系统和ALP-AMPPD系统。在酶促化学发光系统中，为了提高试剂盒灵敏度和特异性，链霉亲和素-生物素反应体系也被广泛使用，但生物素干扰一直是免疫检测试剂盒尤其是链霉亲和素-生物素体系免疫检测试剂盒亟待解决的问题，SA磁珠具有吸附生物素的特性，而不同粒径的磁珠表面积和非特异性吸附能力不同，小粒径磁珠比大粒径磁珠的表面积大，链霉亲和素蛋白载量更高，所以可以结合更多的生物素，从而可以降低因样本中生物素占位带来的干扰，但是小粒径磁珠不易清洗，表面非特异性吸附更高，影响试剂的灵敏度。

发明内容

本发明的目的主要是为了解决现有技术中小粒径磁珠非特异性吸附不易控制的缺陷，而提出的一种提高链霉亲和素-生物素反应体系的化学发光试剂盒抗生物素干扰能力和灵敏度的方法。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种提高链霉亲和素-生物素反应体系的化学发光试剂盒抗生物素干扰能力和灵敏度的方法，包括如下步骤：

步骤一：在磁珠稀释液中添加SA磁珠组成磁珠包被物工作液；

步骤二：在酶标记物稀释液中添加碱性磷酸酶标记抗体组成碱性磷酸酶标记物工作液；

步骤三：在生物素标记物稀释液中添加生物素标记抗体组成生物素标记物工作液；

步骤四：将样本、磁珠包被物工作液、生物素标记物工作液顺序加入反应杯，孵育一定时间后，进行反应清洗，再加入碱性磷酸酶标记物工作液反应后进行清洗。

优选的，步骤一中磁珠包被物的具体制备方法为：

S1：使用前先置换上清，用pH7.2的PBS缓冲液清洗三次；

S2：然将磁珠重悬至适量的基础缓冲液中制备成磁珠包被物母液。

优选的，步骤S2中所述磁珠包被物母液浓度为10mg/mL。

优选的，步骤二中碱性磷酸酶标记物的具体制备方法为：

S1：称取一定质量的抗体活化剂2IT；

S2：用含有50mM Tris，0.1M NaCl和0.005M EDTA，pH＝8.5±0.05水溶液溶解活化剂2IT至10mg/mL；

S3：准确量取一定质量的HBsAg单克隆抗体，通过浓缩或定容的方式使溶液中抗体浓度为3.5mg/mL，溶剂使用上述2IT溶液的溶剂，置于反应试管底部；

S4：在含有3.5mg/mL HBsAg单克隆抗体溶液的试管中加入活化剂2IT溶液进行活化、混匀，在室温下反应20分钟；

S5：结束后利用分子筛层析方式去除溶液中的过量的活化剂2IT，得到活化的抗体

S6：准确量取一定质量碱性磷酸酶，置于反应试管底部；

S7：称取适量的环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯用二甲基甲酰胺溶解至5mg/ml；

S8：在含有碱性磷酸酶的试管中加入其体积1/20的环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯溶液，混匀后，室温下反应15分钟；

S9：结束后利用分子筛层析去除溶液中的过量的环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯，得到活化的碱性磷酸酶；

S10：将S5中活化的抗体和S9中活化的碱性磷酸酶按一定比例混合，加入6μL的1MMgCl

S11：反应结束后，用分子筛层析的方法纯化得到最终碱性磷酸酶标记抗体；

S12：用BCA法测定蛋白浓度，再用加有保护剂的缓冲液进行稀释。

优选的，步骤S10中所述混合比例按质量比1∶0.8。

优选的，步骤S12中所述稀释浓度为0.5mg/mL。

优选的，步骤S4中所述HBsAg单克隆抗体溶液与活化剂2IT溶液的混合体积比为1/20。

优选的，步骤三中生物素标记物的具体制备方法为：

S1：生物素取待标记的抗体，标记前使用pH7.425mM的磷酸缓冲液替换掉抗体自带的缓冲液；

S2：生物素标记前事先在无水N，N-二甲基甲酰胺中溶解成0.1～100mg/mL的生物素母液；

S3：在避光条件下，取置换完缓冲液的抗体和生物素母液按照摩尔浓度1:1-200的比例进行标记；

S4：在避光条件下悬混,标记缓冲液为pH7.425mM PB；

S5：反应结束后使用AKTA纯化仪纯化，得到生物素标记的抗体；

S6：用BCA法测定蛋白浓度，再用加有保护剂的缓冲液稀释。

优选的，步骤S4中的在避光条件下悬混标记时间为1-12小时。

优选的，步骤S6中所述稀释浓度为0.5mg/mL。

与现有技术相比，本发明提供了一种提高链霉亲和素-生物素反应体系的化学发光试剂盒抗生物素干扰能力和灵敏度的方法，具备以下有益效果：

1、该提高链霉亲和素-生物素反应体系的化学发光试剂盒抗生物素干扰能力和灵敏度的方法，通过筛选使用小粒径磁珠包被链霉亲和素减少因样本中的生物素与磁珠表面链霉亲和素结合占位而导致试剂检测结果的出现偏差的问题，并同时在酶标记物组份中添加生物素化牛血清白蛋白来封闭未与生物素抗体结合的游离SA磁珠，减小SA磁珠非特异性结合酶标抗体而产生非特异性信号，提高检测灵敏度。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的数据，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

磁珠包被物工作液的制备，其中SA磁珠可为购买商品,在磁珠稀释液中添加SA磁珠组成磁珠包被物工作液；

使用前先置换上清，用pH7.2的PBS缓冲液清洗三次，然后将磁珠重悬至适量的基础缓冲液中制备成磁珠包被物母液，其中磁珠母液浓度保持为10mg/mL；

碱性磷酸酶标记物工作液制备，在酶标记物稀释液中添加碱性磷酸酶标记抗体组成碱性磷酸酶标记物工作液；

首先对抗体活化：称取一定质量的抗体活化剂2IT，用含有50mM Tris，0.1M NaCl和0.005M EDTA，pH＝8.5±0.05水溶液溶解至10mg/ml，准确量取一定质量的HBsAg单克隆抗体，通过浓缩或定容的方式使溶液中抗体浓度为3.5mg/mL，溶剂使用上述2IT溶液的溶剂，置于反应试管底部；在含有3.5mg/mL HBsAg单克隆抗体溶液的试管中加入其体积1/20比例的2IT溶液进行活化、混匀，在室温下反应20分钟，结束后利用分子筛层析方式去除溶液中的过量的2IT，得到活化的抗体；

其次对碱性磷酸酶活化：准确量取一定质量碱性磷酸酶，置于反应试管底部；称取适量的环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯用二甲基甲酰胺溶解至5mg/mL；在含有碱性磷酸酶的试管中加入其体积1/20的环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯溶液，混匀后，室温下反应15分钟，结束后利用分子筛层析去除溶液中的过量的环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯，得到活化的碱性磷酸酶；

将以上活化的抗体和活化的碱性磷酸酶按质量比1∶0.8混合，加入6μL的1M MgCl

生物素标记物工作液的制备，在生物素标记物稀释液中添加生物素标记抗体组成生物素标记物工作液；

生物素取待标记的抗体，标记前使用pH7.425mM的磷酸缓冲液替换掉抗体自带的缓冲液，生物素标记前事先在无水N，N-二甲基甲酰胺中溶解成0.1～100mg/mL的生物素母液；

在避光条件下，取置换完缓冲液的抗体和生物素母液按照摩尔浓度1:1-200的比例进行标记，标记缓冲液为pH7.425mM PB，在避光条件下悬混标记1-12小时，反应结束后使用AKTA纯化仪纯化，得到生物素标记的抗体，用BCA法测定蛋白浓度，再用加有保护剂的缓冲液稀释至0.5mg/mL；

下面结合实际的组分组成和原料的选取对本方案进行详细的描述，参照实施例1-4。

实施例1：

磁珠包被物组分：

SA磁珠：粒径1μm；

磁珠包被物稀释液：

Tris：50-100mmol/L；

BSA：0.5％-2％；

吐温20：0.05％-0.2％；

PC300：0.05％；

BND：0.02％；

pH7.0，0.2μm滤膜过滤，2～8℃保存备用；

根据磁珠包被物工作液，磁珠浓度0.5mg/mL配制体积计算好所需磁珠母液体积，用移液器量取适量磁珠母液至洁净离心管中，磁分离，置换上清后加到磁珠包被物稀释液中，混匀后备用。

碱性磷酸酶标记物组分：

碱性磷酸酶标记抗体：碱性磷酸酶标记物组分-1和碱性磷酸酶标记物组分-2，其中母液浓度：0.5mg/mL；

酶标记物稀释液：

MES：50-100mmol/L；

Nacl：2％-5％；

Mgcl2：2mM-5mM；

Zncl2：0.1mM-0.5mM；

BSA：0.5％-2％；

吐温20：0.05％-0.2％；

Mouse IgG：500μg/mL；

Goat IgG：500μg/mL；

MAK33 POLY：250μg/mL；

PC300：0.05％；

BND：0.02％；

pH 6.5，0.5μm滤膜过滤，2～8℃保存备用；

通过信号调配，确定碱性磷酸酶标记物组分-1和碱性磷酸酶标记物组分-2按照1:1的比例添加至酶标物稀释液中，其中稀释度为：1:500～1:1500。

生物素标记物组分：

生物素标记抗体：生物素标记物组分-1和生物素标记物组分-2，其中母液浓度：0.5mg/mL；

生物素标记物稀释液：

Tris：50-100mmol/L；

Nacl：2％-5％；

吐温20：0.05％-0.2％；

TritonX-100：0.1％；

Mouse IgG：500μg/mL；

Bovine IgG：500μg/mL；

MAK33 POLY：250μg/mL；

Mutein AP：150μg/mL；

Polybrene：0.05％；

生物素化牛血清白蛋白：0.5％；

PC300：0.05％；

BND：0.02％；

pH 7.4，0.2μm滤膜过滤，2～8℃保存备用；

通过信号调配，确定生物素标记物-1和生物素标记物组分-2按照10:1的比例添加至生物素标物稀释液中，其中生物素标记物组分-2稀释度：1:500～1:1500；

实施例2：在实施例1的基础上，SA磁珠替换为粒径2μm，其他组份和工艺与实施例1相同；

实施例3：在实施例1的基础上，酶标稀释液中添加0.2％生物素化牛血清白蛋白，其他组份和工艺与实施例1相同；

实施例4：在实施例1的基础上，酶标稀释液中添加1.0％生物素化牛血清白蛋白，其他组份和工艺与实施例1相同；

对照组1：在实施例1的基础上，SA磁珠粒径换为5μm，其他组份和工艺与实施例1相同；

对照组2：在实施例1的基础上，酶标记物稀释液中不加0.5％的生物素化牛血清白蛋白，其他组份和工艺与实施例1相同；

下面以乙肝表面抗原HBsAg测定试剂盒为例，进行测试，其中HBsAg试剂盒是一种基于酶促化学发光、链霉亲和素-生物素放大反应体系的检测试剂盒。试剂盒分为3个组份，即链霉亲和素包被磁珠、生物素标记抗体、碱性磷酸酶标记抗体，反应模式为两步两清洗：第一步为样本中抗原、生物素标记抗体、SA磁珠包被物结合成复合物；第二步为抗原-生物素标记抗体-SA磁珠包被物复合物与碱性磷酸酶标记抗体结合，测试方法如下：

第一步，将50μL样本、50μL磁珠包被物工作液、50μL生物素标记物工作液按顺序加入反应杯中，孵育10分钟，加入清洗液，清洗5次；

第二步，在反应杯中继续加入50μL碱性磷酸酶标记物工作液，孵育10分钟，加入清洗液，清洗5次；

第三步，将发光底物注入到反应混合物中，碱性磷酸酶催化底物发光，仪器PMT检测产生的光量子数，产生光子的数量与HBsAg浓度成正比例关系。

实验仪器选择：CL1200i，用对照组1-2、实施例1-4制备好的试剂，检测灵敏度和抗生物素干扰能力，实施例1-4再检测准确度、线性和重复性，检测方法如下：

(1)灵敏度检测：测定空白样本、HBsAg浓度为0.05IU/mL、0.10IU/mL、0.15IU/mL的低浓度样本，每个样本测定10次，计算均值、标准差、变异系数，CV小于10％且偏差小于10％能满足使用需求；另外，计算浓度点0.05IU/mL的发光值RLU1与空白样本发光值RLU0的信噪比RLU1/RLU0；

(2)抗生物素干扰能力检测：准备生物素干扰阴性血清和生物素干扰阳性血清，可以向生物素干扰阴性血清中添加生物素制备而成，生物素含量为100ng/mL，两个样本各重复测定3次，计算浓度偏差；另外，测定50例临床血清样本，比对与罗氏试剂的临床相关性；

(3)线性范围检测：将接近线性范围0.05～250IU/mL上限的血清样本，逐级稀释至线性范围下限，在此处设置7～11个浓度梯度，每个浓度点测试3次，计算均值和理论值，每个浓度重复测定3次，计算浓度均值与理论值的相关系数；各个点的相对偏差在10％以内，能满足使用需求；

(4)准确度检测：测定经企业参考品赋值过的血清样本，以高值H和低值L，计算与靶值的偏差Bias＝(测定均值-靶值)/靶值×100％，偏差在85％～115％范围内，满足要求；

(5)重复性检测：测定重复性样本低值L和重复性样本高值H，各重复测定10次，计算均值M、标准偏差SD和变异系数CV；

检测数据如下：

(1)灵敏度：

表1实施例1-4灵敏度数据

表2对照组1-2灵敏度数据

表3信噪比数据

由以上数据可以看出，对照组2测低浓度样本测值偏低，甚至测不出值，有些浓度与空白液测值一样，且CV较高，不满足要求，且低浓度样本信号与本地信号的信噪比较小，低端分不开；对照组1和实施例1-4可测到浓度0.05IU/mL，且低浓度样本CV较好，低浓度样本信号与本地信号的信噪比能达到4以上，验证的功能灵敏度可以达到0.05IU/mL。

(2)抗生物素干扰能力：

表4生物素干扰偏差数据

表5与罗氏试剂临床样本相关性数据

由以上数据可以看出，对照组1使用大粒径SA磁珠，测定生物素添加样本，出现明显测值偏差，且与罗氏临床比对，相关性较差，表明抗生物素干扰能力较差；对照组2和实施例1-4使用小粒径SA磁珠，测生物素添加样本，没有明显测值偏差，且与罗氏测临床样本比对，相关性较好，说明使用小粒径SA磁珠能有效提高试剂抗生物素干扰能力。

(3)线性范围：

表6线性数据

由以上数据看出，实施例1-4测定线性梯度样本，浓度相关系数r均大于0.990，满足性能要求，且实施例1表现最优，故优选实施例1所述条件(SA磁珠粒径1μm，酶标记物稀释液中添加0.5％生物素化牛血清白蛋白)。

(4)准确度：

表7准确度数据

由以上数据看出，实施例1-4测定准确度样本，浓度偏差均小于10％，满足性能要求，且实施例1表现最优，故优选实施例1所述条件。

(5)重复性：

表8重复性数据

由以上数据看出，实施例1-4测定重复性样本，变异系数cv均小于10％，满足性能要求。

综上所述，运用本发明制备的基于碱性磷酸酶-链霉亲和素-生物素系统的HBsAg试剂盒抗生物素干扰能力较强，且灵敏度较高，且其他性能也能满足临床使用需求。本发明中提高抗生物素干扰能力和检测灵敏度的方法在其他使用酶促化学发光-链霉亲和素-生物素反应体系的试剂盒中也能使用。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。