一种非小细胞肺癌循环肿瘤细胞分离系统及方法

摘要

本公开涉及的非小细胞肺癌循环肿瘤细胞分选系统及方法，通过包括：微柱分选芯片，用于分选所述非小细胞肺癌循环肿瘤细胞；振荡流系统，用于为所述非小细胞肺癌循环肿瘤细胞提供双向流场力，缓解所述非小细胞肺癌循环肿瘤细胞在所述微柱分选芯片间的堵塞；流式细胞计数功能区，用于统计所述非小细胞肺癌循环肿瘤细胞的进样数和出样数，评估所述非小细胞肺癌循环肿瘤细胞的分选结果。通过阵列柱的形状、间距及多层排布设定，配合振荡流的驱动实现自动化非小细胞肺癌循环肿瘤细胞的分选、且分选过程无生化标记，细胞损伤小、以及可以解决过程中分选芯片内细胞的堵塞和气泡对非小细胞肺癌循环肿瘤细胞分选的影响问题。

说明书

技术领域

本公开涉及血液中肿瘤细胞分离富集领域，尤其涉及一种非小细胞肺癌循环肿瘤细胞分选系统及方法。

背景技术

循环肿瘤细胞(circulating tumor cell，CTC)是指已经从原发性肿瘤或转移性肿瘤获得脱离基底膜的能力并入侵通过组织基质进入血管或淋巴管中的肿瘤细胞，并随着血液在体内循环。CTC很可能携带着原位瘤或转移瘤的位置、环境、发展等关键信息，在早期检测、癌症转移、个性化治疗方案制定和预后评估中具有重要意义。然而，由于CTC的极端稀有性、高度异质性以及表型多样性等固有属性，给CTC的分离富集以及下游分析带来了巨大的挑战。

目前，针对CTC的分离富集技术主要可分为基于生化原理的方法以及基于物理原理的方法。

基于生化原理的方法，也称为基于亲和性的捕获，是目前应用最为广泛的方法，利用CTC上表达的特异抗原，采用不同抗体进行CTC的捕获，从而实现分离富集的目的。但是，基于生化原理的方法需要引入额外的标记物，为下游的分析带来误差，难以实现对于CTC亚型的分选，遗漏一部分不表达特异抗原的CTC；难以量化构建模型，无法实现检测的可重复性。

基于物理原理的方法，也称为基于非亲和性的捕获，利用CTC的细胞物理特性，通过外加物理场实现对CTC的分离富集。但是，基于物理原理的方法建模难度大、参数十分复杂以及对于分离平台工艺要求高等。

研究表明白细胞与非小细胞肺癌循环肿瘤细胞在尺寸上存在交集，在杨氏模量上存在明显差异。其中淋巴细胞杨氏模量0.417±0.081kPa，中性粒细胞杨氏模量0.156±0.087kPa，非小细胞肺癌A549细胞系杨氏模量2.71±0.14kPa；同时小淋巴细胞尺寸6～9μm，大淋巴细胞12～15μm，中性粒细胞10～12μm，非小细胞肺癌A549循环细胞系尺寸20～30μm，也有报道血样中分离出的非小细胞肺癌循环细胞尺寸在15μm左右。由上述差异，在非小细胞肺癌循环肿瘤细胞与白细胞在尺寸存在重叠的区域可以通过挤压方式对血细胞和非小细胞肺癌循环中肿瘤细胞进一步加以区分。

微流控芯片技术在CTC研究中能够对多种技术与操作进行组合，例如样本准备、引入、细胞分选、分离及检测。微流控技术便于集成化及一体化，避免CTC 在步骤转移中丢失。微流控技术能够进行高通量的细胞分析，得到大量的生物学信息；具有密闭空间且操作自动化，在CTC研究过程中避免引入额外的污染物，干扰CTC的分析。微流控芯片较小的尺寸使得在CTC研究过程中所需的细胞量以及试剂量都较少，大大节省花费和试剂损耗。利用微流控芯片技术作为平台，实现对CTC基于物理特性的一体化、免标记分选检测成为解决CTC分析问题的重要途径之一。2016年，广州益善生物技术股份有限公司(下文简称广州益善)提出了一种附带振荡流分选系统的微柱过滤微流控芯片，用于实现循环肿瘤细胞自动捕获(如图1所示)。广州益善发表的该专利中以振荡流输出系统提供压力与吸力作用于微柱阵列中的细胞，实现循环肿瘤细胞与血细胞的分选。但是，在循环肿瘤细胞受挤压穿越微柱间隙时，间隙处循环肿瘤细胞部分受到挤压，而稍远离微柱间隙处循环肿瘤细胞(循环肿瘤细胞中后端)处于低形变状态，使得循环肿瘤细胞在这个微尺寸内发生剧烈形变，对循环肿瘤细胞活性产生较大影响，不能对循环肿瘤细胞进行分选；该专利中使用振荡流单元提供循环肿瘤细胞分选的压力与吸力，采用的振荡流以推压—抽吸的方式实现振荡，这种方式极易在分选芯片中引入来自各种接口间隙中的气泡(特别是如图1中的出样口45和出样口46)，使得大量气泡进入芯片，影响细胞分选；另外，该方式会在分选芯片中引入较为剧烈的正负压变化，对于循环肿瘤细胞的样品进样速度的控制会有很大影响，难以进行精确度量；且该专利在振荡流系统输出振荡流中设计两个出样口和一个进样口，此时若出现循环肿瘤细胞滞留或堵塞于分选芯片底部时，无法实现疏通芯片堵塞或排出滞留的循环肿瘤细胞，无法解决分选芯片内堵塞问题。

发明内容

有鉴于此，本公开提出了一种非小细胞肺癌循环肿瘤细胞分选系统及方法，能够实现自动化非小细胞肺癌循环肿瘤细胞的分选、且分选过程无生化标记，细胞损伤小、以及解决分选芯片内细胞的堵塞和气泡对非小细胞肺癌循环肿瘤细胞分选的影响问题。

根据本公开的一方面，提出了一种非小细胞肺癌循环肿瘤细胞分选系统，所述系统包括：

微柱分选芯片，用于分选所述非小细胞肺癌循环肿瘤细胞；

振荡流系统，用于为所述非小细胞肺癌循环肿瘤细胞提供双向流场力，缓解所述非小细胞肺癌循环肿瘤细胞在所述微柱分选芯片间的堵塞，以及去除所述非小细胞肺癌循环肿瘤细胞在所述微柱分选芯片间的气泡；

流式细胞计数功能区，用于统计所述非小细胞肺癌循环肿瘤细胞的进样数和出样数，评估所述非小细胞肺癌循环肿瘤细胞的分选结果。

在一种可能的实现方式中，所述微柱分选芯片由微柱阵列构成。

在一种可能的实现方式中，所述微柱阵列呈整齐阵列排布，所述微柱阵列为渐进式微柱间距微柱阵列和/或挤压式微柱阵列，用于实现基于非小细胞肺癌循环细胞尺寸和杨氏模量差异的分选。

在一种可能的实现方式中，所述微柱曲面为抛物线型。

在一种可能的实现方式中，所述振荡流系统包括振荡流输出系统，所述振荡流输出系统包括液泵，通过液泵提供所述双向流场力。

在一种可能的实现方式中，所述系统还包括流速缓冲区，用于减少所述非小细胞肺癌循环肿瘤系统经流式细胞计数功能区后的进样速度。

在一种可能的实现方式中，所述系统还包括进泵样组，用于驱动所述非小细胞肺癌循环肿瘤系统的样品流入所述流式细胞计数功能区。

在一种可能的实现方式中，所述挤压式微柱阵列根据所述非小细胞肺癌循环肿瘤细胞的尺寸和弹性模量进行所述非小细胞肺癌循环肿瘤细胞的分选；

所述渐进式微柱间距微柱阵列根据多层概率分布模型进行所述非小细胞肺癌循环肿瘤细胞的多级分选。

根据本公开的另一方面，提出了一种非小细胞肺癌循环肿瘤细胞分选方法，

往所述微柱分选芯片内注满PBS缓冲液或生理盐水，及设定振荡流系统的输出模式；

将所述非小细胞肺癌循环肿瘤细胞样品注入所述振荡流系统，统计所述非小细胞肺癌循环肿瘤细胞的进样数和出样数；

计算所述非小细胞肺癌循环肿瘤细胞的进样数和出样数的比值，计算所述非小细胞肺癌循环肿瘤细胞的分离率。

本公开的一种非小细胞肺癌循环肿瘤细胞分选系统，通过包括：微柱分选芯片，用于分选所述非小细胞肺癌循环肿瘤细胞；振荡流系统，用于为所述非小细胞肺癌循环肿瘤细胞提供双向流场力，缓解所述非小细胞肺癌循环肿瘤细胞在所述微柱分选芯片间的堵塞；流式细胞计数功能区，用于统计所述非小细胞肺癌循环肿瘤细胞的进样数和出样数，评估所述非小细胞肺癌循环肿瘤细胞的分选结果。能够实现自动化非小细胞肺癌循环肿瘤细胞的分选、且分选过程无生化标记，非小细胞肺癌循环肿瘤细胞损伤小、以及解决分选芯片内非小细胞肺癌循环肿瘤细胞的堵塞和气泡对非小细胞肺癌循环肿瘤细胞分选的影响问题。

根据下面参考附图对示例性实施例的详细说明，本公开的其它特征及方面将变得清楚。

附图说明

包含在说明书中并且构成说明书的一部分的附图与说明书一起示出了本公开的示例性实施例、特征和方面，并且用于解释本公开的原理。

图1示出现有技术中的一种非小细胞肺癌循环肿瘤细胞分选系统图。

图2示出根据本公开一实施例的非小细胞肺癌循环肿瘤细胞分选系统图。

图3示出根据本公开另一实施例的非小细胞肺癌循环肿瘤细胞分选系统图。

图4示出根据本公开另一实施例的非小细胞肺癌循环肿瘤细胞分选系统的微柱阵列示意图。

图5示出根据本公开另一实施例的非小细胞肺癌循环肿瘤细胞分选系统的振荡流生成区示意图。

图6示出根据本公开另一实施例的非小细胞肺癌循环肿瘤细胞分选系统的微柱分选芯片示意图。

图7示出根据本公开另一实施例的非小细胞肺癌循环肿瘤细胞分选方法流程图。

图8示出根据本公开另一实施例的非小细胞肺癌循环肿瘤细胞分选方法的振荡流输出流程图。

具体实施方式

以下将参考附图详细说明本公开的各种示例性实施例、特征和方面。附图中相同的附图标记表示功能相同或相似的元件。尽管在附图中示出了实施例的各种方面，但是除非特别指出，不必按比例绘制附图。

在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。

另外，为了更好的说明本公开，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本公开同样可以实施。在一些实例中，对于本领域技术人员熟知的方法、手段、元件和电路未作详细描述，以便于凸显本公开的主旨。

细胞的物理性质包括细胞尺寸、形态、密度、弹性、介电系数、固有频率、热容等，红细胞、白细胞和CTC在尺寸以及弹性方面存在的差异等。

图2示出根据本公开一实施例的非小细胞肺癌循环肿瘤细胞分选系统图。该系统是基于非小细胞肺癌CTC与血细胞在细胞尺寸与杨氏模量上存在差异为原理进行分选，可以用于实现全血样本中非小细胞肺癌循环肿瘤细胞与血细胞(例如白细胞、红细胞等)的分选，还可以用于其它循环肿瘤细胞(例如前列腺癌细胞等)进行分选。如图2所示，该系统包括：

微柱分选芯片，用于分选所述非小细胞肺癌循环肿瘤细胞；其中，微柱分选芯片可以由多个由间距逐层缩小的微柱阵列(渐进式微柱间距微柱阵列)构成，以组成CTC分选的主要区域。微柱阵列还可以是挤压式微柱阵列，在此不做限定。

振荡流系统，用于为所述非小细胞肺癌循环肿瘤细胞提供双向流场力，缓解所述非小细胞肺癌循环肿瘤细胞和血细胞在所述微柱分选芯片间的堵塞，以及去除所述非小细胞肺癌循环肿瘤细胞在所述微柱分选芯片间的气泡。振荡流系统可以包括脉冲流生成单元、片上接口输入设计与流路分布设计，通过脉冲流生成的单元以及片上接口与流路分布单元生成的双向脉冲流提供所述双向流场力。例如，脉冲流生成单元配合片上接口与流路分布设计可以用于为非小细胞肺癌CTC分选提供竖直方向来回振荡的流场力，同时在精确操控下可起到排除微柱分选芯片内气泡和缓解微柱通道堵塞的作用。

流式细胞计数功能区，用于统计所述非小细胞肺癌循环肿瘤细胞的进样数和出样数，评估所述非小细胞肺癌循环肿瘤细胞的分选结果；流式细胞计数功能区可以检测非小细胞肺癌CTC进样样品与分选后出样样品中细胞个数，用于指导使用人员评估细胞分选效果。

本公开的非小细胞肺癌循环肿瘤细胞分选系统，通过包括：微柱分选芯片，用于分选所述非小细胞肺癌循环肿瘤细胞；振荡流系统，用于为所述非小细胞肺癌循环肿瘤细胞提供双向流场力，缓解所述非小细胞肺癌循环肿瘤细胞和血细胞在所述微柱分选芯片间的堵塞；流式细胞计数功能区，用于统计所述非小细胞肺癌循环肿瘤细胞的进样数和出样数，评估所述非小细胞肺癌循环肿瘤细胞的分选结果。能够实现自动化非小细胞肺癌循环肿瘤细胞的分选、且分选过程无生化标记，细胞损伤小、以及可以解决过程中微柱分选芯片内非小细胞肺癌循环肿瘤细胞的堵塞和气泡对非小细胞肺癌循环肿瘤细胞分选的影响问题。

在一种可能的实现方式中，所述振荡流系统包括振荡流输出系统，振荡流输出系统可以包括液泵。通过液泵提供双向流场力，其中，所述液泵可以为恒流高压液泵。通过控制液泵开启、关闭就可以实现调整y方向的振荡流输出方向，配合缓冲液提供的x方向流场力实现片上细胞操控。能够精确控制振荡流系统的流出方向和流场力还能够实现片上细胞操纵，精确排除微柱分选芯片内的气泡与堵塞问题。其中，振荡流输出系统还可以采用蠕动泵、真空泵等任意泵组及必要液流与压力控制系统组合而成的脉冲流单元提供正负压实现相似的振荡流精确控制，在此不作限定。

在一种可能的实现方式中，所述微柱曲面为抛物线型。

在一实例中，微柱曲面采用特殊设计的抛物线外观，可以实现细胞穿越微柱间隙时受挤压通过，减少因振荡流流场带动而与微柱碰撞时产生的损伤。能够通过建模仿真得到非小细胞肺癌CTC与血细胞分选过程的概率分布模型，实现基于非小细胞肺癌循环肿瘤细胞尺寸及杨氏模量双参数的无生化标记的非小细胞肺癌CTC分选并取得良好结果。

在一种可能的实现方式中，所述挤压式微柱阵列根据所述非小细胞肺癌循环肿瘤细胞的尺寸和弹性模量进行所述非小细胞肺癌循环肿瘤细胞的分选；所述渐进式微柱间距微柱阵列根据多层概率分布模型进行所述非小细胞肺癌循环肿瘤细胞的多级分选。能够减少细胞通过微柱分选芯片的变形损害。

应用示例

图3示出根据本公开一实施例的非小细胞肺癌循环肿瘤细胞分选系统图。为解决宏观试样及微柱分选芯片间的衔接问题，实现高程度自动化测试分析，准确评价微柱分选芯片的非小细胞肺癌CTC捕获分离能力，设计非小细胞肺癌循环肿瘤细胞分离系统，如图3所示，包括：流式细胞计数功能区1，进样泵组2，流速缓冲区3，微柱阵列分离区4(如图3)，振荡流生成区5(如图4)，微柱分选芯片6(如图5)，富集检测区7。其中，在进样泵组2驱动下，待测非小细胞肺癌CTC 先经流式细胞计数功能区1通过鞘液夹流实现单细胞排列通过，流式芯片鞘液独立运作，形成循环，不进入后续缓冲区，减少鞘液带来的微柱分选芯片进样量增加；随后进入流速缓冲区3，由于流式细胞计数流速与非小细胞肺癌CTC分选芯片进样流速差异很大，流速缓冲区3对经流式细胞计数的细胞样品进行降速，出口端同理；非小细胞肺癌CTC与其余样本中的血细胞进入微柱分选芯片6，包括微柱阵列分离区4和振荡流生成区5(振荡流系统)。其中，微柱阵列分离区4可以采取渐进式微柱间距微柱阵列，如图4所示，分选芯片内微柱呈整齐阵列排布，微柱间距L1由23.5μm到8μm逐层渐变，其中渐变步长为0.5μm，微柱柱间距L2 为40μm；微柱上、下底间距H1为30μm，微柱下底宽度随微柱间距调整，相邻微柱层间距H2为30μm，能够利用多层概率分布模型实现多级分离。当然，微柱阵列分离区4还可以采取挤压式微柱阵列，能够依据细胞的尺寸和弹性模量构成的综合物理特性进行分选，在此不作限定。如图5所示，振荡流生成区5包括振荡流、缓冲液、多个电磁阀和三通阀、废液等组成双向循环回路，能够提供双向交替动力，扩大非小细胞肺癌CTC和其他细胞的特性差距，解决微柱分选芯片通道的堵塞问题。

如图6所示，微柱分选芯片6采取长通道设计，能够延长非小细胞肺癌CTC分选过程，提高非小细胞肺癌CTC分选准确性。样本再一次经过流速缓冲区3、至流式细胞计数功能区1，最后，流至富集检测区7，细胞富集区采用单细胞捕获结构实现二次富集，以备进一步检测分析。通过采用多道出样口设计，能有效防止物理性质不同的细胞在分选后再次出现汇聚现象的发生。进样口的设计保证样本进入芯片前处于充分混匀状态。

图7示出根据本公开另一实施例的非小细胞肺癌循环肿瘤细胞分选方法流程图。可以采用上述非小细胞肺癌循环肿瘤细胞分选系统对非小细胞肺癌CTC 进行分析，如图7所示，该分选方法包括：

步骤S11，往所述微柱分选芯片内注满PBS缓冲液或生理盐水，及设定振荡流系统的输出模式。

图8示出根据本公开另一实施例的非小细胞肺癌循环肿瘤细胞分选方法的振荡流输出流程图。

如图8所示，可以在7.5mL全血样本中加入100个/mL的A549非小细胞肺癌细胞；打开缓冲液阀门，使得微柱分选芯片内注满PBS缓冲液或生理盐水，通过控制振荡流输出系统排除微柱分选芯片内的气泡；进样口开启开始进样，如图5所示，下方震荡流生成系统开启输出模式，上方振荡流生成系统开启输入模式，使得振荡流输出系统的正向震荡流(缓冲液由下往上流向)输出2s，振荡流停滞0.5s，下方震荡流生成系统开启输入模式，上方振荡流生成系统开启输出模式，使得振荡流输出系统的反向振荡流(缓冲液由上往下流向)输出0.5s，以此作为细胞自动片上分选振荡流输出模式，完成分选。其中，振荡流流速为 60μL/mL。

步骤S12，将所述非小细胞肺癌循环肿瘤细胞样品注入所述振荡流系统，统计所述非小细胞肺癌循环肿瘤细胞的进样数和出样数。

步骤S13，计算所述非小细胞肺癌循环肿瘤细胞的进样数和出样数的比值，计算所述非小细胞肺癌循环肿瘤细胞的分离率。

在振荡流输出系统输出10次循环，振荡流流场稳定后开始非小细胞肺癌 CTC进样，进样速度设置为50μL/mL；统计收集非小细胞肺癌CTC前端细胞进样数和后端非小细胞肺癌CTC细胞出样数，计算非小细胞肺癌CTC前端细胞进样数和后端非小细胞肺癌CTC细胞出样数的比值，计算非小细胞肺癌CTC分选率，用于指导后续人员评估非小细胞肺癌CTC细胞分选效果。

本公开的非小细胞肺癌肿瘤细胞分选方法，通过往所述微柱分选芯片内注满PBS缓冲液或生理盐水，及设定振荡流系统的输出模式；将所述非小细胞肺癌循环肿瘤细胞样品注入所述振荡流系统，统计所述非小细胞肺癌循环肿瘤细胞的进样数和出样数；计算所述非小细胞肺癌循环肿瘤细胞的进样数和出样数的比值，计算所述非小细胞肺癌循环肿瘤细胞的分离率。能够实现自动化非小细胞肺癌循环肿瘤细胞的分选、且分选过程无生化标记，细胞损伤小、以及可以解决过程中分选芯片内非小细胞肺癌循环肿瘤细胞的堵塞和气泡对非小细胞肺癌循环肿瘤细胞分选的影响问题。

以上已经描述了本公开的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。本文中所用术语的选择，旨在最好地解释各实施例的原理、实际应用或对市场中的技术改进，或者使本技术领域的其它普通技术人员能理解本文披露的各实施例。