用于通过侧脑室施用治疗亨特综合征的方法和组合物

摘要

在一个方面中，本发明涉及包含艾杜糖醛酸‑2‑硫酸酯酶β(IDS‑β)的药物组合物，其可每4周1次施用到侧脑室中以在对象中治疗亨特综合征。与相同剂量活性物质的单次施用相比，本发明由于长时段内重复施用而在治疗亨特综合征方面表现出优异的效果，并且还具有从单次施用的结果中无法预期的以下效果：治疗或恢复受损的脑结构；以及显著地治疗或改善脑功能，特别地，改善记忆和学习。

说明书

技术领域

本发明涉及用于治疗亨特综合征

背景技术

亨特综合征或黏多糖贮积症II型(Mucosaccharidosis type II)是溶酶体贮积病(lysosomal storage disease，LSD)之一，其中由于艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(iduronate-2-sulfatase，IDS或I2S)缺陷，黏多糖例如糖胺聚糖(Glycosaminoglycan，GAG)在体内不会降解，并因此在溶酶体中积聚。GAG在整个身体的细胞中积聚，并引起多种症状。所述症状包括明显的面部特征、大头、由增大的肝或脾引起的腹胀等，其与听觉损失、心脏瓣膜病、阻塞性呼吸疾病、睡眠呼吸暂停等一起发生。另外，当中枢神经系统受影响时，积聚的GAG也可限制关节运动，并可引起神经症状和延迟发育。已知亨特综合征在162,000个活产中发生约1例，并以X连锁隐性(X-linked recessive)模式遗传。

作为亨特综合征的治疗方法之一的酶替代治疗(Enzyme replacement therapy，ERT)是其中将外部产生的IDS施用到身体中的方法。这样的方法就施用而言具有简单的优点，同时具有高治疗成本的缺点，因为该酶需要连续施用。作为重组产生的酶替代治疗并已被美国FDA批准的

酶替代治疗通过向对象全身性施用天然存在的或重组来源的蛋白质和/或酶来实现。经批准的酶替代治疗通常静脉内施用，并且通常在治疗由造成疾病或病症的酶缺陷导致的身体症状方面有效。然而，这些酶替代治疗是有问题的，因为静脉内施用的蛋白质和/或酶被有限地分布在中枢神经系统(central nervous system，CNS)的细胞和组织中。特别地，对于具有CNS病因的疾病的治疗，这样的酶替代治疗是有问题的，因为静脉内施用的蛋白质和/或酶不通过血脑屏障(blood-brain barrier，BBB)。

为了克服由于血脑屏障的这些问题，已尝试开发这样的治疗方法，其中通过鞘内(intrathecal，IT)注射将蛋白质和/或酶直接施用到对象的脑脊液中；然而，就稳定性和有效性而言，这样的尝试尚未取得成功。

因此，需要开发可有效治疗患有中枢神经病症的亨特综合征患者并且最终在这些患者中实现改善的脑功能的治疗方法。

本发明人已发现，在其中长时间将艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶β重复施用到对象的侧脑室中的情况下，这样的施用具有抑制和改善在患有亨特综合征的患者中观察到的脑功能衰退的出人意料的效果；并因此完成了本发明。

技术问题

本发明的一个目的是提供用于显著地治疗或改善由亨特综合征引起的中枢神经系统变性，特别是脑功能衰退的治疗方法和药物组合物。

问题的解决方案

为了实现以上目的，本发明提供了用于在对象中治疗亨特综合征的药物组合物，其包含艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶β并且每4周1次施用到侧脑室中；以及用于使用所述药物组合物治疗亨特综合征的方法。

本发明的有利效果

根据本发明一个方面的药物组合物表现出例如在患有亨特综合征的对象中实际上改善脑功能的作用。在本发明中，已确定即使在临床实践中，施用这样的组合物可充分地抑制脑功能丧失。

另外，与其中通过单次施用给予相同剂量的活性成分的情况相比，在长时段内重复施用的根据本发明的药物组合物对亨特综合征具有更好的治疗作用，并且还具有从单次施用所获得结果中无法预期的效果，例如治疗或恢复受损的脑结构，以及显著地治疗或改善脑功能，特别是，改善记忆和学习功能。

附图简述

图1示出了示出在测试例1中根据本发明的一个方面的制剂所施用的位置的图，其中所指出的位置是指小鼠侧脑室。

图2示出了在测试例2中从小鼠脑提取脑脊液的照片，其中最右边的照片示出了收集于微量移液器中的脑脊液。

图3示出了作为测试例2的结果的图，其示出了小鼠的脑和脑脊液中积聚的硫酸乙酰肝素(heparan sulfate，HS)的量。

图4示出了作为测试例2的结果的图，其示出了在单次施用之后28天的时间点以及在根据实施例进行的6次重复施用之后28天的时间点，小鼠的脑和脑脊液中积聚的HS量的比较。

图5a示出了作为测试例3的结果的、通过小鼠的脑磁共振成像获得的照片；并且图5b示出了示出小鼠中相对于总脑体积的脑室体积的比例的图。

图6示出了作为测试例4的结果的照片，其示出了通过对小鼠脑组织进行苏木精和伊红染色而获得的结果。

图7示出了作为测试例5的结果的照片，其示出了通过对小鼠脑组织进行免疫组织化学染色而获得的结果。

图8示出了作为测试例6的结果的图，其示出了通过进行用于评价小鼠的学习记忆能力的恐惧条件实验而获得的结果。

图9示出了作为测试例7的结果的图，其示出了通过进行用于评价小鼠的多动特征的旷场试验而获得的结果。

发明详述

为了更好地理解本发明，如下对某些术语进行定义。在本说明书通篇阐述了对如下所示的术语和另一些术语的进一步解释。

当应用于一个或更多个数值时，本文中使用的术语“约”是指类似于所述参考数值的数值。在本发明的一个方面中，除非另外说明或上下文另有清楚地说明(除其中这样的数目超过可能数值的100％的情况之外)，否则术语“约”是指落入所述数值的任一方向(大于或小于)上的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小以内的数值范围。

本文中使用的术语“治疗”是指部分地或完全地减轻、改善、缓解特定疾病、障碍和/或病症(例如，亨特综合征)的一种或更多种症状或特征，抑制、延迟其发作，降低其严重程度和/或降低其发生率的治疗性蛋白质(例如溶酶体酶)的任何施用。这样的治疗可施加于未表现出相关的疾病、障碍和/或病症的体征的对象，和/或施加于仅表现出所述疾病、障碍和/或病症的早期体征的对象。任选地或另外地，这样的治疗可施加于表现出相关的疾病、障碍和/或病症的一种或更多种确定体征的对象。

在下文中，将详细地描述本发明。

在一个方面中，本发明可涉及包含艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶β(“IDS-β”)的药物组合物。

在本发明的一个方面中，所述药物组合物可用于在对象中治疗亨特综合征。

在本发明的一个方面中，所述药物组合物可用于在患有亨特综合征的对象中治疗或抑制脑室扩大。

在本发明的一个方面中，所述药物组合物可用于在患有亨特综合征的对象中改善脑功能。

在本发明的一个方面中，IDS-β可包括具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的蛋白质。SEQ ID NO：1是重组人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶蛋白。在本发明的一个方面中，IDS-β可还包括具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的蛋白质。SEQ ID NO：2是其中第59位氨基酸半胱氨酸被甲酰基甘氨酸(Formylglycine，Fgly)替换的重组人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶蛋白。

在本发明的一个方面中，IDS-β可包括等于或小于约20至35mol％的具有SEQ IDNO：1的氨基酸序列的蛋白质，以及等于或小于约65至80mol％的具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的蛋白质。特别地，在本发明的一个方面中，IDS-β可包括等于或小于约35mol％的具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的蛋白质，以及等于或小于约65mol％的具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的蛋白质。

在本发明的一个方面中，IDS-β可包括具有与SEQ ID NO：1具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列的蛋白质。在本发明的一个方面中，IDS-β可包括具有与SEQ ID NO：2具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列的蛋白质。

在本发明的一个方面中，IDS-β的浓度可以为约0.1mg/ml至约60mg/ml、约1mg/ml至约10mg/ml，或约6mg/ml。

在本发明的一个方面中，单次施用时的IDS-β的剂量可以为约1μg至60μg、约15μg至约60μg、约20μg至约40μg、约25μg至约35μg、约29μg至约31μg、或约30μg；并且这样的剂量可以是在施用于哺乳动物(例如小鼠)的情况下的剂量。然而，本发明不限于此。另外，在本发明的一个方面中，单次施用时的IDS-β的剂量可以为约1mg至60mg、约15mg至约60mg、约20mg至约40mg、约25mg至约35mg、约29mg至约31mg，或约30mg；并且这样的剂量可以是在施用于人的情况下的剂量。然而，本发明不限于此。

在本发明的一个方面中，药物组合物可每4周1次施用到对象的侧脑室中。

在本发明的一个方面中，药物组合物可直接施用于对象的侧脑室的任一侧或两侧。

在本发明的一个方面中，药物组合物的施用可在患有亨特综合征的对象中降低或抑制脑室扩大；改善对象的脑功能；改善对象的学习和记忆能力；抑制对象的多动特征；降低脑细胞中的细胞空泡形成；或者抑制脑细胞中溶酶体相关膜蛋白2(

在本发明的一个方面中，药物组合物的施用可降低对象的脑(例如，脑细胞)或脑脊液中硫酸乙酰肝素(HS)的积聚。在本发明的一个方面中，与对照相比，HS积聚可降低20％、40％、50％、60％、80％、90％、1倍、1.5倍、2倍或3倍。

在本发明的一个方面中，药物组合物的施用可向对象进行3次或更多次。在本发明的一个方面中，药物组合物的施用可进行3次或更多次、4次或更多次、5次或更多次、6次或更多次、7次或更多次、8次或更多次、9次或更多次、或者10次或更多次；并且可特别地向对象进行6次。

在本发明的一个方面中，药物组合物的施用可进行12周或更长时间并且48周或更短时间。在本发明的一个方面中，药物组合物的施用可进行12周或更长时间、16周或更长时间、20周或更长时间、24周或更长时间、28周或更长时间、32周或更长时间、36周或更长时间、40周或更长时间、44周或更长时间，或者48周或更长时间；并且可特别地进行24周。

在本发明的一个方面中，对象可以是人或哺乳动物。在本发明的一个方面中，哺乳动物可以是小鼠、大鼠、啮齿动物、猫、兔、狗、猪、马或牛。

在本发明的一个方面中，药物组合物的施用可通过包含储器和连接至所述储器的导管的脑室内导管系统来进行。在如稍后所述的测试例中，由于施用是对小鼠进行的，因此需要单独的三维定位装置和三维定位坐标系。然而，在临床应用中，本发明的药物组合物可通过简单的脑室内导管系统来施用。

在本发明的一个方面中，药物组合物的施用可用包括以下步骤的方法进行：1)手术插入导管系统，其中储器位于对象的头皮下方，并且导管的末端位于对象的侧脑室中，以使得侧脑室内部空间通过导管内部空间与储器内部空间连接，从而使得脑脊液能够从侧脑室流至储器，并使储器填充有脑脊液；2)以0.1至60ml/分钟的速率从储器中抽出约0.1至5ml的脑脊液；3)以0.1至60ml/分钟的速率将0.1至5ml的药物组合物注射到储器中；以及4)使得药物组合物能够通过导管从储器流至侧脑室。

在本发明的一个方面中，药物组合物的施用可与用于治疗亨特综合征的一种或更多种另外的酶替代治疗组合进行。特别地，在本发明的一个方面中，另外的酶替代治疗可以是IDS-β的静脉内施用和皮下施用中的至少一种。这样的静脉内施用和皮下施用可参考常规的施用方法；并且在临床应用中，本发明的侧脑室施用不需要为施用方案设定限制。

在本发明的一个方面中，药物组合物可还包含氯化钠和聚山梨酯20，并且pH可以为约5至约7。在本发明的一个方面中，药物组合物的pH可以为约6。

在本发明的一个方面中，药物组合物中包含的氯化钠的浓度可以为约100mM至约200mM。在此，氯化钠的浓度可对应于上述范围内存在的所有整数值的范围。具体地，氯化钠的浓度可以为约150mM。

在本发明的一个方面中，药物组合物中包含的聚山梨酯20的浓度可以为约0.01mg/ml至0.5mg/ml。在此，聚山梨酯20的浓度可对应于上述范围内存在的所有十进制值的范围。具体地，聚山梨酯20的浓度可以为约0.05mg/ml。在本发明的一个方面中，药物组合物的施用可不引起任何严重的不良作用。在本发明的一个方面中，严重的不良作用可指但不限于引起显著性免疫应答、毒性或死亡的任何作用。

本文中使用的术语“显著性免疫应答”可指重度或严重的免疫应答，例如显著性的适应性T细胞介导的免疫应答。

在本发明的一个方面中，在以单剂量进行施用的情况下，药物组合物可以以填充到容器，例如小瓶、注射器或预填充注射器中的形式提供，以及可以以填充到一次性塑料注射器中的形式提供。在本发明的一个方面中，药物组合物可以以约1μL至约10μL的体积、约3μL至约7μL的体积、约4μL至约6μL的体积，或约5μL的体积施用；然而，本发明不限于此。另外，在本发明的一个方面中，药物组合物可以以约1mL至约10mL的体积、约3mL至约7mL的体积、约4mL至约6mL的体积，或约5mL的体积施用；然而，本发明不限于此。

在一个方面中，本发明可涉及用于在患有亨特综合征的对象中治疗或抑制脑室扩大的药物组合物，其包含约150mM氯化钠、约0.05mg/ml的聚山梨酯20以及约5mg/ml的艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶β(IDS-β)，其中所述药物组合物的pH为约6，并且每4周1次施用到侧脑室中。

在一个方面中，本发明可涉及用于在患有亨特综合征的对象中改善脑功能的药物组合物，其包含约150mM氯化钠、约0.05mg/ml的聚山梨酯20以及约5mg/ml的艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶β(IDS-β)，其中所述药物组合物的pH为约6，并且每4周1次施用到侧脑室中。

在一个方面中，本发明提供了用于治疗亨特综合征的方法，其包括向对象施加本发明的药物组合物的步骤。

在本发明的一个方面中，提供了本发明的药物组合物用于治疗亨特综合征的用途。

在本发明的一个方面中，提供了本发明的药物组合物用于制备用于治疗亨特综合征的药物的用途。

在下文中，将通过实施例和测试例更详细地描述本说明书的配置和效果。然而，这些实施例和测试例仅出于举例说明的目的提供以帮助理解本说明书，并且本说明书的范围不受以下实施例的限制。

[制备例1]用于施用的IDS-β制剂的制备

使用150mM氯化钠和0.05mg/ml的吐温20溶液(Merck Millipore，Darmstadt，Germany)作为载体溶液。在上述载体溶液中稀释从Green Cross Co.，Ltd.获得的IDS-β溶液(50mg/ml或15mg/ml)，以制备浓度为6mg/ml的IDS-β制剂。将如此制备的IDS-β制剂用于以下测试例中。

[测试例1]对小鼠进行的侧脑室施用

用于如本说明书中所述的测试例中的小鼠是内部产生的小鼠，并且以使艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(IDS)基因的一部分缺失的这样的方式产生。简言之，IDS基因的缺失从外显子2至3进行。IDS KO小鼠(IDS敲除小鼠)育种自C57BL/6.129S背景品系(backgroundstrain)，并且在IDS基因中具有无效突变。野生型(WT)对照小鼠育种自C57BL/B6.129S品系。使用从尾剪物(snip)获得的DNA通过聚合酶链式反应(PCR)来检查所有小鼠的基因型。本说明书中的测试例经机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care andUse Committee)批准(批准号20140925005)，并根据三星生物医学研究机构(Seoul，Korea)

如下表1中所示对通过育种获得的小鼠进行分类和分配。

[表1]

准确的侧脑室施用需要小鼠脑坐标。该信息描述于[Paxinos，George andFranklin，Keith B.J.，Paxinos and Franklin’s The Mouse Brain in StereotaxicCoordinates，Academic Press，4th Edition，2012]中，并如图1中所示。对于在基于周的小鼠龄的情况下的侧脑室的位置，进一步参考[Paxinos，George and Franklin，Keith B.J.，Paxinos and Franklin’s The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates，AcademicPress，4th Edition，2012]。

对通过上述育种所获得的6周龄小鼠进行脑内侧脑室施用。每组在单次施用时以5μL的体积施用制备例1的载体溶液和IDS-β溶液。在施用当天，用异氟烷(HANA PHARM CO.，LTD.，Korea)通过吸入使小鼠麻醉，并将其置于立体定向仪(Stereotactic instrument)(Stoelting，USA)中。然后，将小鼠的头皮最小程度地剥离，并清洁暴露的颅。将制备例1中所制备的载体溶液和IDS-β溶液中的每一种置于一次性塑料注射器中，并使用注射器泵(KDScientific，Switzerland)以10μL/分钟的恒定速率用31号针将其注射到小鼠的侧脑室中。在施用期间，使用立体定向坐标(stereotaxic coordinate)(Stoelting，USA)监测注射器针在脑中的位置。在开始施用时针的坐标如下：尾侧至前囟点为-0.58mm、侧部至矢状缝为1.25mm，以及深度为-1.77mm。在完成5μL体积的施用之后，通过0.15mm/30秒将注射器针提升以将其从注射部位移除的动作重复4至5次。然后，以0.3mm/30秒的高度从深度为-1.00mm位置提升针的动作重复数次，以完全移除注射器针。引入这些动作以防止所施用溶液的回流，并且整个施用过程需要的时间为约30分钟/对象。在施用之后，使用医用缝合器简单地缝合包含注射部位的暴露的皮肤区域。

在该施用之后，小鼠未显示出任何严重的不良作用。未观察到由于在施用部位的显著性免疫应答、异常的身体功能等引起的对象退出。在最后施用日期之后28天进行尸检以进行以下分析。

[测试例2]小鼠的脑或脑脊液中积聚的HS的分析

在最后施用日期之后28天进行尸检时，对于根据表1的每个组，首先使用硼硅酸盐玻璃微量移液器(外径：10mm，内径：0.75mm)在目的小鼠的小脑延髓池(cisterna magna)区域收集脑脊液(参见图2)。对于HS分析，在收集之后立即使用液氮将收集的脑脊液(约5至10μL)迅速冷冻，并随后储存在超低温冻结装置中直至分析。对于脑中硫酸乙酰肝素的分析，用磷酸缓冲盐水(PBS)进行经心灌注(transcardial perfusion)，并收集脑。将收集的脑迅速冷冻，并随后储存在超低温冻结装置中直至分析。

使用液相色谱串联质谱(liquid chromatography tandem-mass spectrometry，LC-MS/MS)测量从小鼠收集的脑脊液和脑组织样品中的HS水平。将已在PBS中匀浆的2μL的小鼠脑脊液或脑组织样品等分以进行预处理。将每个样品在盐酸-甲醇中加热以甲醇化。将所得甲醇裂解物在氮气流下蒸发至干。使用氘化硫酸皮肤素和硫酸乙酰肝素(DS-d6和HS-d6)作为内标物(internal standard)。将如此获得的溶液转移至离心滤器并进行离心。对所得滤液进行分析。使用超高效液相色谱系统(Ultra Performance LiquidChromatography system，UPLC，Waters)和三重四极质谱仪(triple quadrupole massspectrometer)(API5000，AB/MDS Sciex)进行LC-MS/MS分析。使用Analyst 1.5.1软件处理数据。分析结果示出于图3和4中，并通过Holm-Sidak的多重比较检验进行统计学分析(在图3和4中，*：P＜0.05，**：P＜0.001，***：P＜0.0001)。

对各组中的脑和脑脊液中积聚的HS量进行比较。参照图3，确定了对于本发明的实施例，与比较例1的HS相比，在最后施用日期之后28天的时间点HS维持在更低的水平。这些结果表明，从在所施用的剂量下所述作用稳定持续一个月的角度来看，每4周1次的施用周期表现出抑制HS积聚的作用(参见图3)。

参照图4，确定了在将单次施用时已施用相同量药物的比较例2的小鼠与本发明实施例的小鼠之间HS的降低的量进行比较的情况下，与其中已进行单次施用的比较例2中的相比，在其中已进行重复施用的实施例中，HS降低得更多。这些结果表明，即使单次施用以施用相同的单剂量并且维持相同的时段(即施用之后28天)的这样的方式进行，连续施用也比单次施用产生好得多的治疗作用；并且这在临床治疗作用中具有重要意义。根据这些结果，在其中使用相同单剂量的情况下，重复施用将在患者中产生显著提高的治疗作用；并且为此必须支持患者和护理者的便利性。

[测试例3]对脑室扩大的抑制作用的评价

进行小鼠的脑MRI分析，以确定根据本发明的侧脑室施用是否不仅改善HS(其为脑和脑脊液的生化指标)而且具有抑制脑的结构性破坏或损伤的作用。

具体地，在完成6次施用之后，使用7.0-Tesla MRI系统(Bruker-Biospin，Fallanden，Switzerland)获得所有小鼠图像，并且该系统配备有能够在100毫秒的上升时间下提供高至400mT/m的20cm梯度装置。将鸟笼式线圈(birdcage coil)(内径72mm；BrukerBiospin)用于激发，并且将主动解耦相控阵线圈(actively decoupled phased arraycoil)用于信号接收。

在整个实验中，用递送至鼻锥以进行自发呼吸的氧气与氮气(3∶7)的混合物中的异氟烷(HANA PHARM CO.，LTD.，Korea)(对于诱导为5％，对于动物设置为2％，以及在MRI实验期间为1％至1.5％)使小鼠麻醉。使用咬合棒/耳棒(bite/ear bar)非常小心地固定小鼠的头部。获得包含小脑的冠状面图像，其具有以下特征：T2加权的快速自旋回波序列，192×192矩阵尺寸，19.2×19.2mm

为了评估相对于全脑的脑室的百分比体积比，获得9个冠状面MRI/小鼠。百分比体积比通过使用ParaVision 2.0.2软件(Bruker，BioSpin，Karlsruhe，Germany)以不知情方式勾勒系列图像来人工估计。在每个图像上勾勒出全脑和脑室的边界，并使用上述软件计算相应的区域。将脑室区域计算为(侧脑室区域/总脑区域)。这些结果示于图5和表2中。

在亨特综合征患者中，患有中枢神经系统变性的那些伴有脑室扩大。类似地，即使在亨特综合征小鼠(IDS KO小鼠)中，也可通过脑MRI确定脑室扩大。在该测试例中，证实了在IDS KO小鼠中通过本发明的施用是否减轻了未经处理组中的脑室扩大。作为结果，发现与未经处理组(比较例1)相比，该实施例表现出显著降低的脑室。

[表2]

[测试例4]对细胞空泡形成的抑制作用的评价

在对每组中的小鼠进行尸检时，在小鼠脑组织中，收集小脑、髓质、丘脑和皮质的切片以进行组织染色，将其用4％多聚甲醛溶液(BIOSESANG，Korea)固定过夜，进行组织处理，并随后包埋在石蜡中。制备4μm厚切片用于苏木精/伊红(H&E)染色。

对从每组中的小鼠收集的脑组织切片进行苏木精/伊红染色。

具体地，将在其上固定脑组织切片的载片浸入二甲苯溶液中以进行载片的脱蜡。然后，将载片依次浸入100％乙醇至更低浓度乙醇的乙醇中，以去除二甲苯。随后，将载片用流水洗涤，并随后通过浸入苏木精溶液中5至8分钟进行染色。在染色之后，将载片用流水洗涤，将其浸入1％盐酸中片刻，并随后用流水再次洗涤。将载片浸入1％氨溶液中，并随后用流水再次洗涤。随后，将载片通过浸入伊红溶液中2分钟进行染色。然后，将载片用乙醇溶液脱水，并用二甲苯密封。

用ScanScope AT(aperio，Leica，German)装置扫描经染色的载片，并随后用ImageScope(aperio，Leica，German)装置对其进行分析以评价组织病理学形态。经扫描的载片的照片示出于图6中。

苏木精/伊红染色显示，对于亨特综合征小鼠，由于糖胺聚糖(GAG)的积聚，整个脑都在发生结构性破坏。具体地，与参考例中的小鼠相比，对于比较例1中患有亨特综合征的小鼠，在整个小鼠脑发现了细胞空泡形成，其为溶酶体贮积病的典型标志物(参见图6)。在图6中参考例1的经染色载片的照片中，由箭头指示细胞空泡形成。在另一方面，发现对于实施例中患有亨特综合征的小鼠，在根据本发明的施用之后，在由箭头指示的区域中细胞空泡形成大幅降低。

[测试例5]对LAMP2蛋白表达的抑制作用的评价

用作为一抗的抗LAMP-2IgG(Santa Cruz Biotechnology，USA)对在测试例4中制备的各组的脑组织切片进行染色，并通过DAB方法使其显影以使LAMP2蛋白的表达可视化。LAMP2蛋白是溶酶体相关膜蛋白，并用作溶酶体活性的指标。在通过DAB方法显影之后，针对LAMP2蛋白阳性细胞和核，用苏木精对脑组织切片进行复染。

具体地，使4μm厚组织切片在室温下在10％正常山羊血清(Dako，Carpinteria，CA，USA)中静置20分钟，并随后使其与抗LAMP-2抗体以1∶100的比例一起在室温下静置30分钟。将组织切片用PBS洗涤数次。然后，使组织切片与经HRP标记的聚合物缀合的二抗一起在室温下静置30分钟。使组织切片在3，3-二氨基联苯胺底物-色原溶液(Dako，Carpinteria，CA，USA)中静置5分钟，并用水洗涤。然后，用苏木精进行核染色。

用ScanScope AT(aperio，Leica，Germany)装置扫描经染色的载片，并随后用ImageScope(aperio，Leica，Germany)装置对其进行分析以评价组织病理学形态。经扫描的载片的照片示出于图7中。

参照图7，发现与参考例中的小鼠相比，在比较例1中患有亨特综合征的小鼠表现出显著高的LAMP2蛋白表达水平，所述LAMP2蛋白是脑细胞以及血管周细胞中溶酶体活性和疾病状态的标志物。在另一方面，发现在根据本发明的施用之后，实施例中患有亨特综合征的小鼠在整个脑组织中表现出显著抑制的LAMP2蛋白表达水平。

[测试例6和7]用于评价脑功能改善的小鼠行为评估

为了确定本发明的施用对脑功能的实际作用，进行恐惧条件实验(fearconditioning test)和旷场试验(Open field test)，其是用于在动物行为评估中评价学习记忆能力的测试。这两个行为评估项目可用于通过评价小动物(例如啮齿动物)的探索能力或运动，以及它们应对足够预期的环境变化的程度来评价总体脑功能。用于进行各个测试的方法和测试结果如下。

[测试例6]恐惧条件实验

在测试例1的侧脑室施用之后(第1、第3和第6次施用之后)2至3周时，使用以下恐惧条件系统(Coulbourn instruments)评价属于每组的小鼠的恐惧记忆：在评价第1天时，在恐惧条件室中，用作为条件刺激的30秒听觉提示(80dB，3600Hz声调(tone))，以及作为非条件刺激的2秒足电击(0.6mA直流)刺激小鼠。在24小时之后的评价第2天时，将小鼠放回同一室中，并以40Hz的频率(30帧/0.75秒)视频记录300秒以评价联想记忆。在联想记忆评价之后1小时，为了评价小鼠的提示记忆，将小鼠置于新的且不同的室中并用听觉提示给予刺激。同样以40Hz的频率(30帧/0.75秒)视频记录小鼠运动300秒。

使用自动计算运动指标和运动的相对缺乏的Freeze Frame Software Ver 3.32对所记录的视频进行事后分析。当小鼠表现出运动的相对缺乏的回合长于0.75秒或2秒时，对凝滞持续时间(freezing duration)进行计数。将该凝滞持续时间除以总观察持续时间(300秒)。将所得值表示为百分比，并且情景性条件(contextual conditioning)项目和提示依赖性条件(cue-dependent conditioning)项目的图示出于图8中。具体结果示于表3中。

[表3]

参照图8，可确定的是随着施用进行，与比较例1中的小鼠相比，实施例中的小鼠表现出显著优异的学习记忆能力。在最后的第6次施用之后，实施例中的小鼠具有改善至这样的程度的脑功能：它们表现出接近于正常小鼠的学习记忆能力。对于其中在测试空间中测量联想记忆(用于评价视觉和听觉记忆)的“情景性条件”项目以及其中评价对于重复的恐惧刺激的恐惧记忆的“提示依赖性条件”项目二者，可看出，从第3次施用的时间点开始观察到明显的改善(参见图8和表3)。

[测试例7]旷场试验

在测试例1的侧脑室施用之后(在第1、第3和第6次施用之后)，使用以下旷场试验来评价每个组中小鼠的探索行为：使小鼠探索侧面有不透明壁(15.0cm高度)的顶部开放场地(open-top arena，44.5cm×44.5cm)，并视频记录其运动20分钟。分析记录的视频的探索距离、运动速度、静止时间，在中央和外围区域花费的时间以及进入每个区域的频率。中央区域意指在场地中央中标记的31.0cm×31.0cm的区域，并且外围区域意指将中央区域排除在外的场地的其余部分。各个分析结果的图示出于图9中，并且具体的结果值示于表4中。

已知亨特综合征小鼠通常表现出多动特征。这也在本发明的旷场试验结果中得到确定。20分钟观察显示，在比较例1中的小鼠中，在整个截面中行进的距离之和(即，水平路径距离(horizontal path distance))稳定地提高。然而，发现对于实施例中的小鼠，行进的距离之和降低，指示对多动特征的抑制。在同样意义上，比较例1中的小鼠也显示出静止时间(在此期间没有运动)的降低趋势，而实施例中的小鼠显示出提高的静止时间。

在特定空间中，啮齿动物具有偏爱更易于保护它们免受捕食者(例如鸟类)侵害的侧面而不是中央的本能。因此，在旷场试验中，在所准备的空间中，探索外围区域而不是中央区域是小鼠的一般行为特征。然而，发现比较例1中的小鼠显示出随着衰老中央进入的频率以及在中央区域中花费的时间均提高。在另一方面，实施例中的小鼠显示出与参考例中的小鼠(其为正常小鼠)相似的趋势。

[表4]