通过使用鼻分泌物样本中的β淀粉样蛋白低聚物用于筛查阿尔茨海默病的进行性发展的组合物以及使用该组合物用于筛查阿尔茨海默病的进行性发展的方法

摘要

本发明涉及通过使用鼻分泌物样本中的β淀粉样蛋白用于筛查阿尔茨海默病的进行性发展的组合物、和以及通过使用该组合物用于筛查阿尔茨海默病的进行性发展的方法，更具体地，涉及用于筛查阿尔茨海默病的进行性发展的组合物和试剂盒，所述组合物和所述试剂盒各自包含用于测量鼻分泌物样本中的56kDaβ淀粉样蛋白低聚物和72kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达水平的试剂；并涉及用于筛查阿尔茨海默病的进行性发展的方法，所述方法包括测量鼻分泌物样本中的56kDaβ淀粉样蛋白低聚物和72kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达水平的步骤。

说明书

技术领域

本申请要求2018年01月16日提交的韩国专利申请号10-2018-0005761的优先权，以引用的方式将其整体内容并入本文。

本发明涉及使用鼻分泌物样本的β淀粉样蛋白用于筛查阿尔茨海默病的进行性发展(ongoing progress)的组合物以及使用该组合物筛查阿尔茨海默病的进行性发展的方法，更具体地，涉及用于筛查阿尔茨海默病的进行性发展的组合物和试剂盒，所述组合物和试剂盒包含测量鼻分泌物样本中的56kDaβ淀粉样蛋白低聚物和72kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达水平的试剂；并涉及筛查阿尔茨海默病的进行性发展的方法，所述方法包括测量鼻分泌物样本中的56kDaβ淀粉样蛋白低聚物和72kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达水平。此外，本发明涉及筛查用于轻度阿尔茨海默病或中度阿尔茨海默病的治疗剂的方法，所述方法包括测量鼻分泌物样本中的56kDaβ淀粉样蛋白低聚物和72kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达水平；并涉及用于筛查轻度阿尔茨海默病或中度阿尔茨海默病的治疗剂的试剂盒，所述试剂盒包含用于测量鼻分泌物样本中56kDaβ淀粉样蛋白低聚物和72kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达水平的试剂。

背景技术

退行性脑病是指随着大脑衰老而发生的疾病。作为迄今未知的原因，特定脑细胞群逐渐丧失其在大脑中的功能，已知是由如下引起的：对脑神经系统的交流最重要的脑神经细胞的死亡、在脑细胞和脑细胞之间传递信息的突触的形成或功能的问题、或脑神经的电活动的异常增加或减少。退行性脑病可通过考虑主要症状和受影响的大脑区域来区分，并且阿尔茨海默病(AD)可通过与其它脑部疾病相比的疾病特异性蛋白的表达、特定细胞群的死亡以及由此的特异性症状来鉴别。

近年来，阿尔茨海默病迅速增加，因此迫切需要早期诊断、预防和治疗。迄今为止，阿尔茨海默病只能通过神经心理学测试来诊断，例如简版老年抑郁量表(Short Form ofGeriatric Depression Scale，GDS)或细微精神状态检查(mini-mental stateexamination，MMSE)或专门的MRI成像，它们是耗时且昂贵的方法。

例如，作为用于诊断阿尔茨海默病的现有方法，有一种使用高分辨率脑成像设备对脑部进行成像的技术。对于使用脑部成像的阿尔茨海默病的早期诊断，对疑似具有阿尔茨海默病的患者进行脑部成像，以测量β淀粉样蛋白的异常聚集程度，并通过研究脑成像装置的精度，比较和分析患者的脑组织测试后的结果。然而，这种基于成像的诊断方法不仅对患者要求很高的成本，而且还在已发展出大脑收缩或损伤的状态下检测疾病，以致延迟了疾病的检测。

另一种有代表性的诊断方法是通过测量脑脊液中的β淀粉样蛋白含量的变化来诊断脊髓液。然而，已知脑脊液分析方法本身对于患者来说是一种非常痛苦的方法，而且作为缺点被指出检查伴随着风险。

在此背景下，本发明人开发了一种使用由无创性方法收集的鼻液样本来诊断颅神经疾病的方法，并在韩国专利公开号10-2015-0144283中将其公开。具体而言，所述公开公开了一种通过测量鼻液样本中的β淀粉样蛋白低聚物的表达水平来诊断颅神经疾病的方法。然而，该方法只能确认颅神经疾病是否已经发生，而且在使用鼻液样本时需要复杂的淀粉样蛋白分解预处理过程。

因此，仍然需要一种无创性诊断方法，该方法使样本的预处理过程最少化，并通过对颅神经疾病的进展阶段和颅神经疾病的发展进行分级来进行精确诊断。

发明内容

技术问题

因此，本发明人通过开发筛查阿尔茨海默病的进行性发展的方法而完成了本发明，该方法通过测量鼻分泌物样本中的不同类型β淀粉样蛋白低聚物的表达水平来进行，而无需对样本进行预处理。

因此，本发明的一个目的是提供用于筛查阿尔茨海默病的进行性发展的组合物，所述组合物包含测量鼻分泌物样本中的不同类型β淀粉样蛋白低聚物的表达水平的试剂。

本发明的另一目的是提供用于筛查阿尔茨海默病的进行性发展的试剂盒，所述试剂盒包含所述组合物。

本发明的另一目的是提供通过测量鼻分泌物样本中的不同类型β淀粉样蛋白低聚物的表达水平来筛查阿尔茨海默病的进行性发展的方法。

本发明的另一目的是提供筛查用于轻度阿尔茨海默病的治疗剂的方法，所述方法通过如下进行：将用于治疗轻度阿尔茨海默病的候选物质处理至从患有轻度阿尔茨海默病患者分离的鼻分泌物样本中，然后测量不同类型的β淀粉样蛋白低聚物的表达水平。

本发明的另一目的是提供筛查用于中度阿尔茨海默病的治疗剂的方法，所述方法通过如下进行：将用于治疗中度阿尔茨海默病的候选物质处理至从患有中度阿尔茨海默病患者分离的鼻分泌物样本中，然后测量不同类型的β淀粉样蛋白低聚物的表达水平。

本发明的另一目的是提供用于治疗轻度阿尔茨海默病和中度阿尔茨海默病的筛查试剂盒，所述筛查试剂盒包含测量鼻分泌物样本中不同类型β淀粉样蛋白低聚物的表达水平的试剂。

技术方案

为了解决上述问题，本发明提供了用于筛查阿尔茨海默病的进行性发展的组合物，所述组合物包含测量分离的鼻分泌物样本中的56kDaβ淀粉样蛋白低聚物和72kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达水平的试剂。

根据本发明的优选实施方式，测量56kDaβ淀粉样蛋白低聚物和72kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达水平的试剂可以是特异性结合56kDaβ淀粉样蛋白低聚物和72kDaβ淀粉样蛋白低聚物的抗体或适配体。

本发明还提供了用于筛查阿尔茨海默病的进行性发展的试剂盒，所述试剂盒包含上述组合物。

本发明还提供了筛查阿尔茨海默病的进行性发展的方法，所述方法包括：

(a)测量分离的鼻分泌物样本中的56kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达水平；以及

(b)测量步骤(a)样本中的72kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达水平。

根据本发明的优选实施方式，如果在步骤(a)中，56kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达水平与正常对照组的表达水平相比增加，并且72kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达水平与正常对照组的表达水平没有差异，则可诊断为轻度阿尔茨海默病。

本发明还提供了诊断和治疗轻度阿尔茨海默病的方法，所述方法包括：

(a)测量分离的鼻分泌物样本中的56kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达水平；

(b)测量步骤(a)样本中的72kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达水平；

(c)当在步骤(a)中，56kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达水平与正常对照组的表达水平相比增加，并且72kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达水平与正常对照组的表达水平没有差异时，诊断为轻度阿尔茨海默病；以及

(d)向诊断为轻度阿尔茨海默病的受试者给予抑制56kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达或活性的试剂。

本发明还提供了筛查和治疗阿尔茨海默病的进行性发展的方法，所述方法包括：

(a)测量分离的鼻分泌物样本中的56kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达水平；以及

(b)测量步骤(a)样本中的72kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达水平。

根据本发明的另一优选的实施方式，如果在步骤(a)中，与正常对照组相比，56kDaβ淀粉样蛋白低聚物和72kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达水平均增加，则诊断为中度阿尔茨海默病。

本发明还提供了诊断和治疗中度阿尔茨海默病的方法，所述方法包括：

(a)测量分离的鼻分泌物样本中的56kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达水平；

(b)测量步骤(a)样本中的72kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达水平；

(c)当在步骤(a)中，56kDaβ淀粉样蛋白低聚物和72kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达水平与正常对照组的表达水平相比均增加时，诊断为中度阿尔茨海默病；以及

(d)向诊断为中度阿尔茨海默病的受试者给予抑制56kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达或活性的试剂和/或抑制72kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达或活性的试剂。

根据本发明的另一优选的实施方式，可通过蛋白质印迹法(Western blot)、ELISA(酶联免疫吸附测定法，enzyme linked immunosorbent assay)、免疫沉淀测定法(immunoprecipitation assay)、补体结合测定法(complement fixation assay)、流式细胞术(荧光激活细胞分选仪，Fluorecence Activated Cell Sorter，FACS)或蛋白质芯片(protein chip)来进行步骤(a)和步骤(b)。

本发明还提供了筛查用于轻度阿尔茨海默病的治疗剂的方法，所述方法包括：

(a)将用于治疗轻度阿尔茨海默病的候选物质处理至从患有轻度阿尔茨海默病的患者分离的鼻分泌物样本中；

(b)测量步骤(a)样本中的56kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达水平；以及

(c)测量步骤(b)样本中的72kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达水平。

根据本发明的优选的实施方式，如果步骤(b)中的56kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达水平相比处理候选物质之前的表达水平降低，并且步骤(c)中的72kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达水平与处理候选物质之前的表达水平没有差异，可将该候选物质选为用于轻度阿尔茨海默病的治疗剂。

本发明还提供了筛查用于中度阿尔茨海默病的治疗剂的方法，所述方法包括：

(a)将用于治疗中度阿尔茨海默病的候选物质处理至从患有中度阿尔茨海默病的患者分离的鼻分泌物样本中；

(b)测量步骤(a)样本中的56kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达水平；以及

(c)测量步骤(b)样本中的72kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达水平。

根据本发明的优选实施方式，如果步骤(b)中的56kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达水平相比处理候选物质之前的表达水平降低，并且步骤(c)中的72kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达水平相比处理候选物质之前降低，可将该候选物质选为用于中度阿尔茨海默病的治疗剂。

本发明还提供了用于筛查用于轻度阿尔茨海默病或中度阿尔茨海默病的治疗剂的试剂盒，所述试剂盒包含用于测量分离的鼻分泌物样本中的56kDaβ淀粉样蛋白低聚物和72kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达水平的试剂。

本发明还提供了包含56kDaβ淀粉样蛋白低聚物和72kDaβ淀粉样蛋白低聚物的组合物在制备用于筛查阿尔茨海默病的进行性发展的试剂中的用途。

有益效果

根据本发明的筛查阿尔茨海默病的进行性发展的方法，通过同时识别鼻分泌物样本中的两种β淀粉样蛋白低聚物，能够以无创性方式准确和快速地筛查阿尔茨海默病的进行性发展。此外，不需要复杂的样本预处理，通过检测一种蛋白质的形态和含量，可以容易、准确地筛查出阿尔茨海默病的病发和发展阶段，而且在成本方面是经济的。因此，本发明的用于筛查阿尔茨海默病的进行性发展的方法可极大地协助建立治疗阿尔茨海默病的以病人为中心且有效的策略。

附图说明

图1是示出了阿尔茨海默氏痴呆症的进展阶段与MMSE认知测试分数之间的相关性的示意图。

图2是示出了根据单体形式的β淀粉样蛋白和低聚物形式的β淀粉样蛋白(Aβ42)的浓度处理的细胞毒性测试结果的图。

图3A示出了通过蛋白质印迹法对取自正常组和阿尔茨海默病患者组的鼻分泌物样本中的目标β淀粉样蛋白低聚物的定量分析；以及，图3B示出了另外使用单体淀粉样蛋白β特异性抗体(6E10)进行免疫沉淀反应的结果(仅阿尔茨海默病患者)。

图4A和图4B是分别示出了在正常人组和阿尔茨海默病患者组中测量56kDaβ淀粉样蛋白低聚物和72kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达水平的结果的图，图4A示出了56kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达水平，图4B示出了72kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达水平。

图5A和图5B是分别示出了在正常人组和阿尔茨海默病患者组中依据性别测量56kDaβ淀粉样蛋白低聚物和72kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达水平的结果的图，图5A示出了56kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达水平，图5B示出了72kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达水平。

图6A和图6B是分别示出了在正常人组和阿尔茨海默病患者组中依据年龄测量56kDaβ淀粉样蛋白低聚物和72kDaβ淀粉样蛋白低聚物表达水平的结果的图，图6A示出了56kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达水平，图6B示出了72kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达水平。

图7A和图7B是示出了依据阿尔茨海默病的进展阶段(轻度阿尔茨海默病和中度阿尔茨海默病)测量56kDaβ淀粉样蛋白低聚物和72kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达水平的结果的图，图7A示出了56kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达水平，图7B示出了72kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达水平。

具体实施方式

下面，将更详细地描述本发明。

如上所述，仍然需要一种无创性诊断方法，该方法能够使样本的预处理过程最少化，并通过对颅神经疾病的进展阶段和颅神经疾病的发展进行分类来进行准确诊断。因此，本发明人通过开发一种通过测量鼻分泌物样本中两种不同类型的β淀粉样蛋白低聚物的表达水平来筛查阿尔茨海默病进展阶段的方法来寻求上述问题的解决方案。

在本发明的筛查阿尔茨海默病的进展阶段的方法中，通过同时确认鼻分泌物样本中的两种β淀粉样蛋白低聚物，能够以无创性方式准确、快速地筛查阿尔茨海默病的进行性发展。此外，不需要复杂的样本预处理，通过检测一种蛋白质的形态和含量，可以容易、准确地筛查出阿尔茨海默病的病发和进展阶段，而且在成本方面是经济的。

因此，本发明提供用于筛查阿尔茨海默病的进行性发展的组合物，所述组合物包含测量分离鼻分泌物样本中的56kDaβ淀粉样蛋白低聚物和72kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达水平的试剂。

用于确认阿尔茨海默病进展的现有技术包括MMSE认知测试(Folstein MF，Folstein S，McHugh P.Mini-mental state:a practical method for grading thecognitive state of patients for the clinician.J Psychiatr Res1975；12:189-98)，如图1所示，进展阶段可根据MMSE分数进行划分。

以12以上且20以下聚合的β淀粉样蛋白低聚物具有水溶特性并表现出毒性。在本发明中，仅针对表现出此种水溶性的“聚合的β淀粉样蛋白低聚物”。具体而言，如实施例中所述，将样本收集过程中溶于水溶性盐水中的鼻涕分泌物的样本用作目标，并且在离心分离后仅使用上清液，而无需特殊预处理。

在本发明中，术语“鼻分泌物样本”可包括洗鼻液样本，例如，在将盐水溶液喷入鼻子后用鼻涕吸入器采集的样本、使盐水溶液流经鼻子而获得的鼻涕样本等。

在本发明中，与从鼻分泌物样本中检测到的以12以上且20以下聚合的β淀粉样蛋白低聚物(例如，56kDaβ淀粉样蛋白低聚物和72kDaβ淀粉样蛋白低聚物)是导致细胞毒性或认知缺陷的β淀粉样蛋白低聚物。

作为用于测量的实际的β淀粉样蛋白，使用了转化后的单体，其中有毒β淀粉样蛋白和无毒β淀粉样蛋白无法区分。事实上，在血液中单体形式的“β淀粉样蛋白”的测量是否与阿尔茨海默病有关的观点之间存在冲突(参见Toledo JB，Shaw LM，Trojanowski JQ(2013)Plasma amyloid beta measurements-a desired but elusive Alzheimer'sdisease biomarker.Alzheimers Res Ther 5:8.10.1186/alzrt162 PubMed:23470128[PMC免费文章]；以及Lopez OL，Kuller LH，Mehta PD，Becker JT，Gach HM等.(2008)Plasma amyloid levels and the risk of AD in normal subjects in theCardiovascular Health Study.Neurology 70:1664-1671.10.1212/01.wnl.0000306696.82017.66PubMed:18401021)。因此，已经报道了，先前的研究示出特异性靶向毒性淀粉样蛋白以及靶向低聚物形式比简单地靶向β淀粉样蛋白本身的量更有意义。

来源于淀粉样前体蛋白的β淀粉样蛋白单体与胞外区中的另一种单体结合，形成二聚体、复合物或低聚物。如上所述，低聚物形式的Aβ*56(56kDaβ淀粉样蛋白低聚物)和AβO(72kDaβ淀粉样蛋白低聚物)是水溶性的，在阿尔茨海默病中表现出认知能力下降的表达。

在阿尔茨海默病患者中，神经元之间的水溶性β淀粉样蛋白低聚物的聚集干扰突触形成，并且水溶性淀粉样蛋白比非水性淀粉样蛋白形式更有害于突触的形成，该非水性淀粉样蛋白形式具有加剧的低聚物(intensified oligomer)形成。公知的是，当低聚物形成加剧时，它不溶于水。如图1所示，在本发明中使用的鼻分泌物样本中，从轻度阿尔茨海默病阶段开始检测水溶性β淀粉样蛋白。

本发明人证实，在体外分泌的鼻分泌物中检测到具有这种有害影响的水溶性淀粉样蛋白是可能的。

为了确认低聚物形式的β淀粉样蛋白是否比单体形式的β淀粉样蛋白表现出更高的毒性，如实施例1中所述，使用人类神经癌细胞(SHSY5Y细胞)进行毒性测试。结果，如图2所示，β淀粉样蛋白单体即使在处理浓度增加时也没有表现出毒性，而Aβ42低聚物则随着处理浓度的增加而表现出细胞生存力的显著降低，表明只有低聚物形式表现出毒性。这意味着测量β淀粉样蛋白低聚物比测量单体更能有效地解释β淀粉样蛋白相关疾病进展中的毒性作用。

如上所述，在韩国专利公开号10-2015-0144283中，本发明人已证明通过测量鼻分泌物样本中的β淀粉样蛋白低聚物的表达水平来诊断颅神经疾病是可能的。在本发明中，利用β淀粉样蛋白特异性抗体的单体形式进一步进行免疫沉淀反应，并且证实β淀粉样蛋白的低聚物形式由一组单体组成(参见图3)。

基于上述结果，通过实施例3验证了以12以上且20以下聚合的β淀粉样蛋白低聚物(例如56kDaβ淀粉样蛋白低聚物或72kDaβ淀粉样蛋白低聚物)可用作阿尔茨海默病的诊断标记物(图4A和图4B)。

此外，为了确认56kDaβ淀粉样蛋白低聚物或72kDaβ淀粉样蛋白低聚物在阿尔茨海默病以外的其它因素中是否表现出表达水平的差异，分别在正常组和阿尔茨海默病患者组中根据性别和年龄测量了表达水平。结果，如图5A-图5B和图6A-图6B所示，未观察到56kDaβ淀粉样蛋白低聚物和72kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达水平随性别和年龄的变化。由此证明，56kDaβ淀粉样蛋白低聚物和72kDaβ淀粉样蛋白低聚物均可作为对阿尔茨海默病有特异性的标记物。

最后，本发明人根据阿尔茨海默病的进展阶段测量了56kDaβ淀粉样蛋白低聚物和72kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达水平，并且如图7所示，56kDaβ淀粉样蛋白低聚物在轻度阿尔茨海默病和中度阿尔茨海默病中都具有特异性(图7A)，然而，72kDaβ淀粉样蛋白低聚物仅对中度阿尔茨海默病具有特异性(图7B)。

从上述结果可知，阿尔茨海默病随着β淀粉样蛋白低聚物的形式从56kDa变化到72kDa而发展，并且可以看出，通过同时测量鼻分泌物样本中56kDa的β淀粉样蛋白低聚物和72kDa的β淀粉样蛋白低聚物的表达水平，可以容易和准确地筛查阿尔茨海默病的进行性发展，而无需样本的预处理过程。

在本发明中，术语“β低聚物的表达水平”是指在鼻分泌样本中由单体的聚合形成的β低聚物的水平，并且，相较测量单体的表达水平，可以通过测量低聚物的表达水平来更准确地确认阿尔茨海默病的病发和进展阶段。

在本发明中，通过观察鼻分泌物样本中56kDa和72kDa的水溶性和毒性β淀粉样蛋白低聚物的表达水平，可以诊断阿尔茨海默病的发展并筛查阿尔茨海默病的进展阶段。

本发明的术语“用于测量β低聚物的表达水平的试剂”包括与目标低聚物特异性结合的抗体或适配体，但并不特别限于此。

术语“抗体”是指针对抗原位点的特定蛋白质分子。对于本发明，抗体是指与56kDaβ淀粉样蛋白低聚物或72kDaβ淀粉样蛋白低聚物特异性结合的抗体，其包括所有多克隆抗体、单克隆抗体和重组抗体。可使用本领域公知的技术容易地制备特异性结合目标低聚物的抗体。

多克隆抗体可以通过本领域公知的方法生产，其中将目标蛋白抗原注射到动物中并且从动物采集血液以获得含有该抗体的血清。这种多克隆抗体可以从任何动物种类的宿主产生，如山羊、兔、绵羊、猴、马、猪、牛和狗。

单克隆抗体可通过本领域公知的杂交瘤方法(参见Kohler和Milstein(1976)European Journal of Immunology 6:511-519)或噬菌体抗体库(Clackson等，Nature，352:624-628，1991；Marks等，J.Mol.Biol.，222:58，1-597，1991)制备。用上述方法制备的抗体可使用诸如凝胶电泳、透析、盐沉淀、离子交换层析和亲和层析的方法分离和纯化。

此外，本发明的抗体包括具有两个全长轻链和两个全长重链的完整形式，以及抗体分子的功能片段。抗体分子的功能片段是指至少具有抗原结合功能的片段，并且包括Fab、F(ab')、F(ab')2、Fv等。

使用抗体确认与抗体结合的目标低聚物的量的分析方法包括蛋白质印迹法、ELISA(酶联免疫吸附测定法)、放射免疫测定法(RIA)、放射性免疫扩散、Ouchterlony免疫扩散法、火箭免疫电泳、组织免疫染色、免疫沉淀测定法、补体结合测定法、流式细胞术(荧光激活细胞分选仪，FACS)、蛋白质芯片(蛋白质)等，但不限于此。

此外，在本发明中，“适配体”是指对特定物质具有高特异性和亲和力的单链DNA(ssDNA)或RNA。适配子对特定物质具有非常高和稳定的亲和力，能够以相对简单的方式合成，以多种方式修饰以增加其结合力，并且靶向细胞、蛋白质以及甚至小的有机物，因此与已开发的抗体相比，其特异性和稳定性都非常高。

除非另有规定，只要其能与β淀粉样蛋白低聚物特异性结合，本发明的适配子就不受限制，并且适配子中使用的碱基可选自于由A、G、C、U及其脱氧形式的碱基组成的组。

此外，为了提高稳定性，适配体可以通过将选自于由聚乙二醇(PEG)、idT(反向脱氧胸苷)、LNA(锁核酸)、2'-甲氧基核苷、2'-氨基核苷、2'F-核苷、胺接头、硫醇接头和胆固醇组成的组中的至少一种结合至5'端位点、中间位点、3'端位点或其两端来修饰。

idT(反向脱氧胸苷)是通常用于防止对核酸酶具有弱抗性的适配体被核酸酶降解的分子之一。核酸单元通过将前一单元的3'-OH和下一单元的5'-OH结合来形成链，但idT将前一单元的3'-OH和后一单元的3'-OH结合，idT是一种通过人为改变来使5'-OH(而非3'-OH)暴露而产生抑制3'核酸外切酶(一种核酸酶)降解的作用的分子。

本发明还涉及用于筛查阿尔茨海默病的进行性发展的试剂盒，所述试剂盒包含上述组合物。

本发明的试剂盒可包含能够测量鼻分泌物样本中的56kDaβ淀粉样蛋白低聚物或72kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达水平的试剂，一种或多种适于分析表达水平的组合物、溶液或装置。例如，试剂盒可包含底物、适当的缓冲液、用检测标签标记的二级抗体和显色底物等以用于抗体免疫检测。

作为“测量56kDaβ淀粉样蛋白低聚物和72kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达水平的试剂”，如上所述，可以使用能够与目标低聚物特异性结合的抗体或适配体等，并且试剂能够以含有所述试剂的蛋白质芯片的形式包含在试剂盒中。

此外，试剂盒可进一步包含能够检测抗体或适配体的二级抗体，所述二级抗体并不特别局限于此，但它可以与能够与蛋白质芯片结合的56kDaβ淀粉样蛋白或72kDaβ淀粉样蛋白结合，并且其可以用荧光材料、放射性同位素等标记。

具体而言，用于筛查阿尔茨海默病的进展阶段的试剂盒的特征可在于，包含进行ELISA所需的基本要素以实施各种ELISA方法，例如ELISA试剂盒和夹心ELISA。ELISA试剂盒可包含对蛋白质具有特异性的抗体或适配体。抗体可以分别对56kDaβ淀粉样蛋白低聚物或72kDaβ淀粉样蛋白低聚物具有较高的特异性和亲和力，并且与其它蛋白质的交叉反应性很小，可以是单克隆抗体、多克隆抗体或重组抗体。此外，ELISA试剂盒可包含对对照蛋白具有特异性的抗体或适配体。其它ELISA试剂盒可包括能够检测结合抗体的试剂，例如标记的二次抗体、发色团、酶以及能够结合其底物或抗体的其它物质。

此外，该试剂盒可以是用于实施蛋白质印迹法、ELISA(酶联免疫吸附测定法)、免疫沉淀测定法、补体结合测定法、流式细胞术(荧光激活细胞分选仪，FACS)、蛋白质芯片等的试剂盒，并且可以另外包含适于每种分析方法的附加成分。通过这些分析方法，可以通过比较抗原-抗体复合物形成的量来准确地诊断和筛查阿尔茨海默病的进展阶段，并且可以提供根据进展阶段的患者特异性治疗方法。

如上所述，本发明提供了能够连续简单地检查进展步骤的筛查方法和试剂盒，同时，通过交叉检查两种不同的β淀粉样蛋白低聚物，同时提高阿尔茨海默病诊断的准确性。

此外，本发明涉及筛查阿尔茨海默病的进行性进展的方法，所述方法包括：(a)测量分离的鼻分泌物样本中的56kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达水平；以及(b)测量步骤(a)样本中的72kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达水平。

具体而言，如果在步骤(a)中，56kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达水平与正常对照组的表达水平相比增加，并且72kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达水平与正常对照组的表达水平没有差异，则可诊断为轻度阿尔茨海默病。

在步骤(a)中，当56kDaβ淀粉样蛋白低聚物和72kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达水平与正常对照组相比均增加时，可诊断为中度阿尔茨海默病。

在本发明的筛查阿尔茨海默病的进展阶段的方法中，可将鼻分泌物样本从待确认阿尔茨海默病诊断或进展阶段的个体分离，从鼻分泌物样本中分离蛋白质的过程可以使用已知的方法来进行，并且可以通过上述各种抗原-抗体复合物测量方法来测量蛋白质水平。然而，在本发明中，鼻分泌物样本的预处理过程按其原样确认低聚物型β淀粉样蛋白，该过程不需要复杂的淀粉样蛋白分解过程。此外，不需要用于测量的浓缩步骤。如实施例2-3所述，使用水溶性盐水收集的鼻分泌物样本在离心分离后仅提取上清液。

56kDaβ淀粉样蛋白低聚物或72kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达水平的测量可以使用特异性结合56kDaβ淀粉样蛋白低聚物或72kDaβ淀粉样蛋白低聚物的抗体或适配体来进行。更具体地，抗体可以是对56kDa的β淀粉样蛋白低聚物或72kDa的β淀粉样蛋白低聚物具有特异性的单克隆抗体或多克隆抗体，并且可以是具有抗原结合活性的抗体的功能片段，但不限于此。

在本发明的筛查阿尔茨海默病的进展阶段的方法中，蛋白质印迹法、ELISA(酶联免疫吸附测定法)、免疫沉淀测定法、补体结合测定法、流式细胞术(荧光激活细胞分选仪，FACS)或蛋白质芯片(protein chip)可示例为从鼻分泌物样本中检测β淀粉样低聚蛋白质的方法，但不限于此。

本发明还涉及诊断和治疗轻度阿尔茨海默病的方法，所述方法包括：

(a)测量鼻分泌物样本中的56kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达水平；

(b)测量步骤(a)样本中的72kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达水平；

(c)当在步骤(a)中，56kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达水平与正常对照组的表达水平相比增加，并且72kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达水平与正常对照组的表达水平没有差异时，诊断为轻度阿尔茨海默病；以及

(d)向诊断为轻度阿尔茨海默病的受试者给予抑制56kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达或活性的试剂。

本发明还提供了诊断和治疗中度阿尔茨海默病的方法，所述方法包括：

(a)测量分离的鼻分泌物中的56kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达水平；

(b)测量步骤(a)样本中的72kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达水平；

(c)当在步骤(a)中，56kDaβ淀粉样蛋白低聚物和72kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达水平与正常对照组的表达水平相比均增加时，诊断为中度阿尔茨海默病；以及

(d)向诊断为中度阿尔茨海默病的受试者给予抑制56kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达或活性的试剂和/或抑制72kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达或活性的试剂。

如图7A和图7B所示，与正常对照组的表达水平相比，轻度阿尔茨海默病组和中度阿尔茨海默病组中的56kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达水平均显著增加，然而与正常对照组的表达水平相比，中度阿尔茨海默病组中的72kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达水平显著增加，并且轻度阿尔茨海默病组无显著差异。

因此，向诊断为轻度阿尔茨海默病的患者给予抑制56kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达或活性的试剂，并向诊断为中度阿尔茨海默病的患者给予抑制56kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达或活性的试剂和/或抑制72kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达或活性的试剂，因此，能够根据阿尔茨海默病的进展阶段，以患者为中心的方式有效地治疗轻度阿尔茨海默病和中度阿尔茨海默病。

在本发明的诊断和治疗轻度阿尔茨海默病的方法中，可以在步骤(d)中给予用于轻度阿尔茨海默病的公知的治疗剂。

用于轻度阿尔茨海默病的治疗剂可以是，例如，多奈哌齐(donepezil)(产品名称：Aricept)、利凡斯的明(rivastigmine)(产品名称：Exelon)或加兰他敏(galantamine)(产品名称：Razadyne)，但不限于此。

在本发明的诊断和治疗轻度阿尔茨海默病的方法中，针对步骤(d)中诊断为轻度阿尔茨海默病的个体，可将抑制56kDa的β淀粉样蛋白低聚物的表达或活性的试剂与用于轻度阿尔茨海默病的常规治疗剂组合使用。

在本发明的诊断和治疗中度阿尔茨海默病的方法中，可在步骤(d)中给予用于中度阿尔茨海默病的公知的治疗剂。

用于治疗中度阿尔茨海默病的试剂可包括例如美金刚(memantine)(产品名称：Namenda、Ebixa、Axura)或多奈哌齐和美金刚的复合药物(产品名称：Namzaric)，但不限于此。

在本发明的诊断和治疗中度阿尔茨海默病的方法中，在步骤(d)的诊断为中度阿尔茨海默病的个体中，抑制56kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达或活性的试剂和抑制72kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达或活性的试剂可与用于中度阿尔茨海默病的治疗剂共同给予。

此外，本发明涉及筛查用于轻度阿尔茨海默病的治疗剂的方法，所述方法包括：

(a)将用于治疗轻度阿尔茨海默病的候选物质处理至从患有轻度阿尔茨海默病的患者分离的鼻分泌物样本中；

(b)测量步骤(a)样本中的56kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达水平；以及

(c)测量步骤(b)样本中的72kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达水平。

具体而言，如果步骤(b)中的56kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达水平相比处理候选物质之前的表达水平降低，并且步骤(c)中的72kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达水平与处理候选物质之前的表达水平没有差异，则可将该候选物质选为用于轻度阿尔茨海默病的治疗剂。

此外，本发明涉及筛查用于中度阿尔茨海默病的治疗剂的方法，所述方法包括：

(a)将用于治疗中度阿尔茨海默病的候选物质处理至从患有中度阿尔茨海默病的患者分离的鼻分泌物样本中；

(b)测量步骤(a)样本中的56kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达水平；以及

(c)测量步骤(b)样本中的72kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达水平。

具体而言，如果步骤(b)中的56kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达水平相比处理候选物质之前的表达水平降低，并且步骤(c)中的72kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达水平相比处理候选物质之前的水平降低，则可将该候选物质选为中度阿尔茨海默病的治疗剂。

在本发明的用于治疗轻度阿尔茨海默病或中度阿尔茨海默病的治疗剂的筛查方法中，目标低聚物的表达水平的增加意为相比正常对照组的蛋白质表达水平增加，并且目标低聚物的表达水平在处理前后不存在差异可意为与正常对照组相比没有显著差异。

此外，本发明涉及用于筛查轻度阿尔茨海默病或中度阿尔茨海默病的试剂盒，所述试剂盒包含用于测量分离的鼻分泌物样本中的56kDaβ淀粉样蛋白低聚物和72kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达水平的试剂。

此外，本发明涉及包含56kDaβ淀粉样蛋白低聚物和72kDaβ淀粉样蛋白低聚物的组合物在制备用于筛查阿尔茨海默病的进行性发展的试剂中的用途。

以下，将通过实施例对本发明进行更详细地描述。这些实施例仅旨在对本发明进行更详细地说明，并且对于本领域技术人员显而易见的是，本发明的范围不受根据本发明主旨的这些实施例的限制。

实施例

[实施例1]

β淀粉样蛋白单体和β淀粉样蛋白低聚物的毒性测试

1-1.Aβ42低聚物的制备

Aβ42低聚物根据参考文献(Stine WB等，Preparing synthetic Abeta indifferent aggregation states.Methods Mol Biol 2011；670:13-32)制备。简而言之，首先将Aβ42肽(GL biochem，上海)以1mM的浓度溶于六氟异丙醇中。为了聚合，将该肽以5mM重新悬浮于干燥的二甲亚砜中，然后以100mM的最终浓度添加到Hams F-12细胞培养基(PromoCell，Labclinics，Spain)中，在4℃下持续24小时。对于单体，不进行上述聚合过程。

1-2细胞生存力测定

为了确认实施例1-1中制备的β淀粉样蛋白单体和β淀粉样蛋白低聚物的毒性，如下所示使用人类神经癌细胞SHSY5Y(

使用Calcein-AM(#C3100MP，Invitrogen，USA)测量细胞生存力。将以每孔2.5×10

[实施例2]

鼻分泌物样本中低聚β淀粉样蛋白的鉴定

2-1受试者选择

正常对照组选择在首尔神经心理学筛查测验组系(Seoul NeuropsychologicalScreening Battery，SNSB)中具有正常认知能力且不符合其它排除标准的60岁以上的人；根据NINCDS/ADRDA诊断标准，患有阿尔茨海默氏痴呆症的患者明确地为阿尔茨海默病患者，并选择在两个以上认知领域(包括记忆)衰退的人、通过神经心理学检查被鉴定为其日常生活有问题(该问题归因于认知下降而非其它原因)的人、以及不符合其它排除标准的人。

排除标准包括通过脑成像(MRI或CT)确定为无脑部结构问题的人、无其它退化性脑疾病的人、无脑血管疾病(可能导致认知缺陷)的人、无代谢性脑疾病(包括甲状腺疾病)的人、无酒精或药物成瘾的人、以及无头部创伤或精神障碍的人。

2-2.受试者体液收集方案

在门诊就诊时，当正常人和患者就诊一次时，进行神经心理学和影像学测试，并在确认测试结果后，收集所选受试者的鼻分泌物。所选受试者就诊两次。此外，本研究通过随机分组和盲法进行了全面的信息管理，以使正常人和患者的信息不会暴露给收集受试者样本的人和进行实验的人。

受试者的鼻分泌物按以下预处理方案收集。首先，在将盐水溶液喷入鼻子后，用鼻分泌物吸入器收集鼻分泌物，并将其储存在50mL的试管中。当上述方法失败时，使盐水溶液流入鼻内，收集流动鼻液，将其储存在50mL试管中，并储存在-20℃冰箱中，直到分析。此预处理过程不涉及浓缩步骤。实验中，将50μL样本超声处理10秒，通过蛋白质印迹法、ELISA和ELISPOT检测目标蛋白，并通过定量比较进行诊断。

2-3.鼻分泌物样本中β淀粉样蛋白低聚物的检测

通过蛋白质印迹法分析实施例2-2中收集的患者的鼻分泌物样本中的β淀粉样蛋白低聚物的表达水平。

为了进行蛋白质印迹法，将最初储存的患者样本添加到含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解缓冲液中，并在4℃下反应30分钟。用离心机在13,000rpm下分离反应混合物30分钟，然后仅提取上清液，并使用12％SDS-PAGE分离从组织中提取的蛋白质。将分离的蛋白质转移到硝化纤维膜(Schleicher&Schuell，Dassel，德国)中，并在室温下用封闭缓冲液(具有1％脱脂乳(10mM Tris-HCl，0.15M NaCl；pH7.4)的TBS-T)封闭1小时。封闭后，将膜用TBS-T缓冲液冲洗3次，持续10min，然后与一级抗体反应。作为一级抗体，将多克隆兔抗-Aβ-低聚物(Millipore AB9234)(1:1000)与含3％BSA的TBS-T缓冲液混合，在4℃下反应6h，并使二级抗体与HRP连接的抗兔IgG(1:5000)在室温下反应2h。每个反应用TBS-T冲洗三次，持续15分钟，以去除非特异性反应，并使用ECL(安玛西亚，Amersham)进行确认。

结果，如图3A所示，阿尔茨海默病患者(第3道至第6道)的55kDa和70kDa的表达水平高于正常(第1道和第2道)。仅针对阿尔茨海默病患者在与图3B的左侧输入(input)相同的条件下通过免疫沉淀反应再次验证了结果。

具体地，使用6E10(β淀粉样蛋白单体特异性抗体)进行免疫沉淀反应。具体地，6E10与鼻分泌物样本在4℃下孵育过夜，并与40μL蛋白G-琼脂糖混合1小时。珠子(bead)用缓冲液A洗涤两次，用缓冲液B洗涤两次，并且通过在10μL负载SDS-PAGE缓冲液中加热来洗脱蛋白。

结果，如图3B右侧所示，在1号阿尔茨海默病患者中观察到Aβ*56(56kDa的β淀粉样蛋白低聚物)和AβO(72kDa的β淀粉样蛋白低聚物)的强表达，并且在2号阿尔茨海默病患者中观察到Aβ*56(56kDa的β淀粉样蛋白低聚物)的强表达。

下表1中示出了Aβ*56和AβO蛋白的结构和生物学作用的信息。

[表1]

[实施例3]

56kDaβ淀粉样蛋白低聚物和72kDaβ淀粉样蛋白低聚物的定量

如参考文献[K.-A.Chang等，Neurochemistry International 97(2016)]中所述，通过将阿尔茨海默病患者组和正常组分类来量化56kDa的β淀粉样蛋白低聚物和72kDa的β淀粉样蛋白低聚物。

简而言之，正常对照组的分类标准包括年龄为65岁以上、认知功能测试(KMMSE/GDS/CDR)中K-MMSE分数为25或更高且记忆项目正常(3项-3分)的人；中度阿尔茨海默病的分类标准包括年龄为65岁以上、认知功能测试(KMMSE/GDS/CDR)中K-MMSE为19分或更低且CDR为1分或更高或GDS为3分或更高的人，CDR为0.5分且方格总和(sum of box)为2.5分或更高的人，通过脑部成像(MRI或CT)测试无脑部结构问题的人，无其它退化性脑疾病(如帕金森氏症)的人，无可能导致认知缺陷的脑血管疾病的人，无代谢性脑疾病(包括甲状腺疾病)的人，无酒精或药物成瘾的人，无头部创伤或精神疾病的人。使用已知的BCA定量方法进行蛋白质定量，仅使用1μL样本检查蛋白质浓度，并通过其定量相同量。

结果，如图4A和图4B所示，与正常组相比，阿尔茨海默病患者组中56kDa和72kDa的β淀粉样蛋白低聚物的表达显著增加。

[实施例4]

56kDaβ淀粉样蛋白低聚物和72kDaβ淀粉样蛋白低聚物对阿尔茨海默病的特异性的验证

如果由于阿尔茨海默病病发以外的因素导致目标低聚物的表达水平存在差异，则意味着目标低聚物并非对阿尔茨海默病具有特异性，不能用作阿尔茨海默病的特异性标记物。因此，在本实施例中，确认了56kDa和72kDa的β淀粉样蛋白低聚物的表达水平是否根据性别和年龄而变化。

4-1.根据性别确认表达水平

已分别确认了实施例3的阿尔茨海默病患者组和正常组中56kDa和72kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达水平是否根据性别而不同。以与实施例3相同的方式进行蛋白质定量。

结果，如图5A和图5B所示，在阿尔茨海默病患者组和正常组中，56kDa和72kDaβ淀粉样蛋白低聚物未显示出根据性别的表达水平上的差异。这说明性别差异并不影响低聚物的表达量。

4-2.根据年龄确认表达水平

在实施例3的阿尔兹海默病患者组和正常组中，已确认56kDa和72kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达水平是否根据年龄而不同。以与实施例3相同的方式进行蛋白质定量。

结果，如图6所示，在阿尔茨海默病患者组和正常组中，56kDa和72kDa的β淀粉样蛋白低聚物未显示出根据年龄增长的表达水平上的差异。这表明年龄不影响低聚物的表达量。

[实施例5]

根据阿尔茨海默病进展阶段鉴定56kDa和72kDaβ淀粉样蛋白低聚物表达

如参考文献[K.-A.Chang等，Neurochemistry International 97(2016)]中所示，使用认知测试分为正常对照组(正常)、轻度阿尔茨海默病患者组(轻度AD)和中度阿尔茨海默病患者组(中度AD)，并且图7中示出了证实根据阿尔茨海默病进展阶段的56kDa和72kDa的β淀粉样蛋白低聚物的表达水平的结果。

此时，正常对照组和中度阿尔茨海默病患者的分类标准如实施例3中所述，轻度阿尔茨海默病患者组属于年龄为65岁以上、认知功能测试(KMMSE/GDS/CDR)中K-MMSE为25分-20分、CDR为0.5-1或GDS为2-3或更高的人，通过脑成像(MRI或CT)测试无脑部结构问题的人，无其它退化性脑疾病(如帕金森氏病)的人，无可能导致认知缺陷的脑血管疾病的人，无代谢性脑疾病(包括甲状腺疾病)的人，无酒精或药物成瘾的人，无头部创伤或精神疾病的人。

如图7A所示，与正常对照组相比，轻度阿尔茨海默病组和中度阿尔茨海默病组中的56kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达水平均显著增加。这意味着56kDaβ淀粉样蛋白低聚物对轻度阿尔茨海默病组和中度阿尔茨海默病组均具有特异性。

此外，如图7B所示，与正常对照组相比，72kDaβ淀粉样蛋白低聚物的表达水平仅在中度阿尔茨海默病组中显著增加，而在轻度阿尔茨海默病组中没有显著差异。这意味着72kDaβ淀粉样蛋白低聚物仅对中度阿尔茨海默病组具有特异性。

从以上结果可以看出，阿尔茨海默病在不同进展阶段的特异性随β淀粉样蛋白低聚物类型而改变，并且阿尔茨海默病的进展阶段随着鼻分泌物样本中低聚物形式的变化而出现(56kDa→72kDa)。因此，同时测量56kDa和72kDa的β淀粉样蛋白低聚物的表达水平，不仅可以准确诊断阿尔茨海默病，而且可以诊断疾病的进展阶段，为建立有效的以患者为中心的阿尔兹海默病的治疗策略提供许多帮助。

工业实用性

根据本发明的筛查阿尔茨海默病的进展阶段的方法，可通过同时确认鼻分泌物样本中的两种类型β淀粉样蛋白低聚物，以无创性方式准确、快速地筛查阿尔茨海默病的进展。此外，通过检测一种蛋白质的形态和含量，而不需要对样本进行复杂的预处理，可以容易、准确地筛查阿尔茨海默病的病发和发展阶段，而且在成本方面是经济的。因此，本发明的用于筛查阿尔茨海默病进行性发展的方法可以极大地帮助建立以患者为中心且有效的治疗阿尔茨海默病的策略。