一种急性重症病毒性心肌炎基因标志物

摘要

本发明提供了一种急性重症病毒性心肌炎基因标志物，属于心脏医学技术领域。本发明通过检测急性重症病毒性心肌炎患者外周血单个核细胞，正常人外周血单个核细胞，治疗后明显好转的急性重症病毒性心肌炎患者外周血单个核细胞发现，LINC02092基因在急性重症病毒性心肌炎患者的诊断和预后方面均具有明显的差异和优异的诊断价值，因此，可将其用于制备诊断急性重症病毒性心肌炎的诊断试剂。

说明书

技术领域

本发明属于心脏医学技术领域，尤其涉及一种急性重症病毒性心肌炎基因标志物。

背景技术

病毒性心肌炎是继发性扩张型心肌病的最常见病因，其是由病毒感染导致的心肌弥散性或局灶性炎病病变。近年来，病毒性心肌炎的发病率明显升高。少数病例起病急骤，发展迅速，患者会在短时间内出现严重的心力衰竭，新源性休克。而且，病毒性心肌炎是法医病理鉴定工作中常见的心血管感染性疾病，是造成青少年猝死的主要原因之一。由于大多数感染者仅有轻微的临床症状，只有少部分较为严重的感染者会出现明显的并发症，所以目前对于病毒性心肌炎的诊断缺乏有效而特异的检测手段。而且重症病毒性心肌炎在诊断时容易与急性心肌梗死之间发生误诊。因此，寻找新的诊断病毒性心肌炎的基因标志物，并且有效的区分病毒性心肌炎和急性心肌梗死，对于患者的及早诊断和对症治疗具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够有效的诊断病毒性心肌炎的基因标志物。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案。

本发明提供了如下技术方案：

本发明提供了检测LINC02092表达量的引物对在制备急性重症病毒性心肌炎产品中的应用。

优选地，所述LINC02092的转录本序列如SEQ ID NO.1所示。

优选地，所述引物对的正向引物如SEQ ID NO.2所示，所述引物对的反向引物如SEQ ID NO.3所示。

优选地，其特征在于所述产品为试剂盒，芯片和制剂。

此外，本发明提供了检测LINC02092表达量的引物对在制备诊断急性重症病毒性心肌炎荧光定量PCR试剂盒中的应用，所述LINC02092的转录本序列如SEQ ID NO.1所示；所述引物对的正向引物如SEQ ID NO.2所示，所述引物对的反向引物如SEQ ID NO.3所示。

优选地，所述荧光定量PCR试剂盒还包括GAPDH引物对，SYBR Green荧光染料和ddH2O。

此外，本发明提供了一种长链非编码RNA，所述长链非编码RNA为LINC02092，所述LINC02092在急性重症病毒性心肌炎患者中高表达，通过检测LINC02092的表达量可以诊断急性重症病毒性心肌炎。

除此之外，本发明提供了一种检测急性重症病毒性心肌炎的荧光定量试剂盒，所述试剂盒中含有检测LINC2092表达量的引物对。

本发明的有益效果在于：

本发明首次证明了长链非编码RNALINC02092在急性重症病毒性心肌炎患者的外周血单个核细胞中高表达，而且在治疗恢复后的患者的外周血单个核细胞中的表达量相较于未治疗的患者会显著下调，且对于急性重症病毒性心肌炎的诊断和预后均具有优异的灵敏度和特异性。除此之外，本发明证明检测LINC02092可以用于区分急性重症病毒性心肌炎和急性心肌梗死，从而实现急性重症病毒性心肌炎患者的早诊断，和精准治疗。

附图说明

图1健康对照组，急性重症病毒性心肌炎组和治疗恢复组样本中的LINC02092的相对表达量

图2 健康对照组和急性重症病毒性心肌炎组之间的ROC曲线

图3 急性重症病毒性心肌炎组和治疗恢复组之间的ROC曲线

图4 健康对照组和急性心肌梗死组样本中的LINC02092的相对表达量。

具体实施方式

样本为山东齐鲁医院（青岛）心内科临床诊断的急性重症病毒性心肌炎患者外周血血液（35例）和正常人外周血血液（35例），治疗后症状明显好转患者的外周血血液（20例）。诊断符合全国心肌炎、心肌病专题座谈会制定的（病毒性心肌炎诊断标准），除外既往有高血压、冠心病、风湿性心脏病、心肌病、心律失常者，排除药物影响、中毒、代谢风湿性疾病等所导致的其他特异性心肌病变者。

急性心肌梗死患者外周血血液（30例），诊断严格遵循中华医学会心血管分化所制定的我国急性心肌梗死诊断标准。

实施例1

分组为：健康对照组（正常人外周血血液），急性重症病毒性心肌炎组（急性重症病毒性心肌炎患者外周血血液）和治疗治疗恢复组（治疗后症状明显好转患者的外周血血液）。

1.提取血液中的外周血单个核细胞

（1）取4ml的淋巴细胞分离液加入到离心管中，缓慢的将4ml血液样品沿着离心管的管壁加入到分离液中；

（2）将离心管置于离心机中，2000rpm离心30min；

（3）小心的收集乳白色的淋巴细胞层细胞，放入到新的2ml离心管中，加入PBS洗涤，1500rpm离心10min，重复2次，即得到外周血单个核细胞；

2.RNA提取

（1）加入1mlTRIZOL试剂，用移液枪反复的吹打至液体澄清，静置5min；

（2）加入200μL氯仿，颠倒混匀，冰上静置5min，置于离心机中，12000rpm离心15min；

（3）将上层的水相转移至新的无酶离心管中，加入等体积的异丙醇混匀，置于离心机中，4℃，12000rpm离心10min；

（4）去除上清，在白色沉淀中加入500μL预冷的70%乙醇，震荡溶解沉淀，置于离心机中8000rpm/min，离心5min；

（5）弃去上清，室温干燥5-10min，加入50μL DEPC水，即得到所需RNA。

3.逆转录反应

（1）去除基因组DNA

反应试剂：5×gDNA Eraser Buffer 2.0μl，

gDNA Eraser 1.0μl，

Total RNA 1.0μg，

RNase Free dH2O up to 10.0μl。

反应条件：42℃ 2分钟，4℃。

（2）逆转录反应

反应试剂：步骤（1）的反应液 10.0μl，

PrimeScript RT Enzyme Mix I 1.0μl，

RT Primer Mix 1.0 μl，

5×PrimeScript Buffer 2 4.0 μl，

RNase Free dH2O 4.0 μl。

反应条件：37℃ 15分钟，85℃ 5秒，4℃。

4.荧光定量PCR反应

根据Invitrogen公司的2xSYBR Green PCR Master Mix说明书进行实验：

（1）引物序列设计

（2）反应体系

反应条件：95℃ 1min；95℃ 20s，60℃ 30s 40个循环。

采用2

健康对照组和急性重症病毒性心肌炎患者之间的ROC曲线如图2所示，ROC曲线的AUC值为0.9718，Std. Error为0.01529，95% confidence interval为0.9419-1.002，Pvalue < 0.0001。

急性重症病毒性心肌炎样本和治疗恢复组样本之间的ROC曲线如图3所示，ROC曲线的AUC值为0.9000，Std. Error为0.03961，95% confidence interval为0.8224-0.9776，P value < 0.0001。

综上所述，LINC02092能够用于急性重症病毒性心肌炎的诊断标志物，并且能够作为急性重症病毒性心肌炎的预后标志物，且具有优异的灵敏度和特异性。

实施例2

检测健康对照组和急性心肌梗死组LINC02092的表达差异

单个核细胞提取，RNA提取，逆转录反应，荧光定量PCR反应步骤均同实施例1。

实验结果如图4所示，从图中可以看出，健康对照组样本和急性心肌梗死组样品的单个核细胞中的LINC02092表达量没有明显的差异（急性心肌梗死组的LINC02092的相对表达量为1.092±0.065，P=0.3542）。

综上所述，LINC02092能够用于急性重症病毒性心肌炎的诊断和预后，并且能够用于区分急性重症病毒性心肌炎患者和急性心肌梗死患者。

序列表

<110> 山东大学齐鲁医院（青岛）

<120> 一种急性重症病毒性心肌炎基因标志物

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2489

<212> DNA

<213> 人源(Human)

<400> 1

agatctgact ctgcagccat ccctcaccac tcctgcttgg acatcgccag gctcagctag 60

agaaggcaga aaaagttcct ccaactcctt ccccaggcac ctatgcaggc tccacactcc 120

tgcctgaaca gctatgattt taaaagccat cgagtcatga agagaagtgt gccagtgtgt 180

gctggactca gtttcccctg tgcaccattt tccccagtca gccctgcacc ttccaagaac 240

tatgacccga aggcacaccc tagtcagctc aggccccaca ttcctgcaaa aataaggctc 300

cagggctccc tcatcgcagc atgggttctg caggaagccc cagtgccaag tggctttcaa 360

aactagcctc agctagcaac gtggcggcta tttcagcgac cgacaaaagc agctccccca 420

gcctcccttg gtgtttgtgg tcccttttgt tccagccagg caccatgagg aaaatgcagc 480

aaccgtttgg aaacaaaggc tcgggcaggc tctctccagt ctgaaaagcc cactttcact 540

tgagtttcag gtaatttgct gtgcagcctg aattcgttag acaaattagg ctcacttgga 600

cttcaggtgg ctcaattacc tgggtgattt gcatgtttat gagtgaaggg gactgcacag 660

tagcagaaag caaatttgaa atcctgactt tgggggccct ggagcccctt tgctgcacct 720

ttactttccc taccagaaag gaggaaggac agagtagctc cccagcaagc agatcagcgg 780

atgtcacata accacagggc agtcatcagg gagcacgacc cctccccagg gccacgcagg 840

ccttagtttc tccttctgga tctgccagca aaacaaaggt aactgcctaa gaacagcttc 900

caaagatgga agaagaaagt gagaaaatct atattattga tcgttcatac ctaaggaaaa 960

gaggcaagag gattcccata gcccagctgg gaggtgccag aaacttttaa aggtgcttta 1020

taaagtatcc taaatctact ctacaaccct aaaagtgaaa tattttcact caaagaagct 1080

gagatttcaa ggttgaatat cttgcatgca cagctagtta ctgagaggtt aagaattgcc 1140

aaaaaagacc tgtgccttcc ctctgatatt ccctgggttt agttcttctc tcctccttct 1200

gccaagagac cactgagaag tgcctccgaa gagctaaggg ctgccccagg tggttatgtg 1260

ggagctggag aatttcccaa aaagcttcgt gaagagcttg aaaccccaga agagatccct 1320

tggggatggg agttgctcca ggacagaaga agcagtgagt caaggcttga ggatctggag 1380

actaagcaac tctcaagaga aagttctgct gggacccctc ccttggtctt ccctttctgc 1440

cccctctgat gcccccttca tccatccctg cctgccttct ggtctgtccc tgcagcgtga 1500

gtgccagaca gaggcctgtt ctgatgtcct gacatgctac aattatgcag atttacacag 1560

caagcataag accttctccg catgtatggc ttccccattc ccaagcagac catgaacttc 1620

ctaaggaaag tgaccgaatt ccgcacttct caaccctcgc ggaggggcag ggagatggta 1680

accatgtcac aaccagttcc tcccagagga ttcaacatca ctgctcatct cctcagacca 1740

atcaagagga ttggtcattg ggaagtcatc ctgagctgtg accactctct ggaacccaga 1800

acttcctgct tcacatggac tggatgaatg tctaggggca cagctgtttc cagacacctg 1860

gtttgtcttc agaatctcaa atcttaaagg ctttctggtc caaccatcca atgcatggtg 1920

aggccccttc tggattgccc ctgcctgcag catcctggtg tgtgcctaca tatttccagg 1980

gacagccagg aagattccat gcaattatgt gttccctgtt ccaggggagc ccacagcttg 2040

atcaggggac agactgtatc ttccatcaac tcaagaacta agactcaaat taaaaaaatg 2100

caaggctggg ggccaggatg aagaaataaa gagagggtga aatcattctg ggaagtttcc 2160

ttgaaagggg tgagtcataa agagggggtt gggtgcaggt gaggaggagg aagattacag 2220

actgcaggga tgagcaaata ccatttccca ggatttcctg aagtttttct cccctcccaa 2280

agcccaaatc tgcctctttc tggggcccag cgaggaccct ggaagacaga gatcctagaa 2340

aaagcagagg gaaaagaaga ggaagagaac atggagaaac cgccagggaa cagaactctt 2400

ggtccaggag gcgcaaacca caagtgcaat tagtcaaaaa aaaaccctga aattaaaaaa 2460

tgattccaag ctgaaaaaaa aaaaaaaaa 2489

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aatctgcctc tttctggggc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aagagttctg ttccctggcg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtcaaggctg agaacgggaa 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gccttctcca tggtggtgaa 20