氘代匹诺塞林的合成及在制备抗脑卒中药物中的应用

摘要

本发明公开了氘代匹诺塞林的制备方法及在治疗和预防脑卒中等脑血管疾病药物中的应用。本发明发现，采用催化还原法、加成合成法等方法可以制备氘代匹诺塞林，氘代匹诺塞林能显著改善脑缺血再灌注大鼠的神经行为学缺损症状，显著降低脑缺血再灌注大鼠的脑梗死体积，显著降低脑缺血再灌注大鼠的脑水肿程度。同时，氘代匹诺塞林能显著减轻脑出血大鼠的血脑屏障的开放程度和通透性，降低脑出血损伤。另外，氘代匹诺塞林相比于匹诺塞林原型药物具有更优的药代动力学性质和更高的脑组织浓度。氘代匹诺塞林可用于制备治疗和预防脑卒中的药物，并且其作用优于匹诺塞林原型药物。本发明为脑卒中疾病的治疗和预防提供一种有效的解决办法。

说明书

技术领域

本发明涉及氘代匹诺塞林在制备药物中的新应用，主要涉及氘代匹诺塞林在制备预防和治疗抗脑卒中药物中的应用，属于医药技术领域。

背景技术

脑卒中具有高发病率、高致残率、高致死率的特点，是一种严重威胁人类健康的全球性疾病。脑卒中的主要分为缺血性脑卒中、出血性脑卒中和短暂性脑缺血发作。缺血性脑卒中主要是由于血管栓塞和/或动脉硬化而使脑组织血液供应不足，造成脑组织损伤。而出血性脑卒中主要是由于脑部血管破裂，血液渗入大脑，导致正常脑组织血流中断，从而造成脑组织损伤。脑卒中的发病机制和病理生理过程复杂，其中氧化应激、炎症反应、钙超载和兴奋性毒性等多种机制均参与了其发生发展过程。

目前，临床上可用的抗脑卒中药物数量有限。FDA批准的组织型纤溶酶原激活剂(tPA)是较为公认的脑卒中治疗药物之一。但是，tPA的溶栓治疗时间窗窄、出血风险大、再灌注损伤严重，因而其仅能使小部分临床病人因溶栓治疗而受益。所以，开发新型治疗脑卒中药物势在必行。

氘代药物是将药物活性分子集团中的氢替换成同位素氘，因其无毒无放射性，且比碳氢键稳定约6-9倍，可以封闭代谢位点而延长药物的半衰期，从而降低治疗剂量，同时又不影响药物的药理活性，而被认为是一种优良的修饰方法。

发明内容

本发明解决的技术问题在于提供氘代匹诺塞林的合成方法及其在制备预防和治疗抗脑卒中药物中的应用，从而为脑卒中的治疗提供一种有效的解决办法。

匹诺塞林(Pinocembrin)化学名为(2S)-5,7-dihydroxy-2-phenyl-2,3-dihydrochromen-4-one，分子式为C

为此，本发明提供了如下技术方案：

发明提供了氘代匹诺塞林的合成及其在制备预防和治疗抗脑卒中药物中的应用。

进一步，所述的氘代匹诺塞林合成包括以下步骤：

(1)以5,7－二羟基黄酮为原料，氘气为氘供体，在催化剂条件下发生催化还原反应，得到氘代匹诺塞林I；

(2)氘代匹诺塞林I在强碱条件下与D

(3)氘代匹诺塞林III在醇类溶剂伴随加热的条件下反应，生成氘代匹诺塞林II；

进一步，所述的制备方法步骤(3)中所述的醇类溶剂为甲醇、乙醇、乙二醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、戊醇、戊二醇、正己醇或辛醇；

进一步，所述氘代匹诺塞林的作用包括对脑卒中发生后的预防与治疗作用；

进一步，所述脑卒中的治疗为各种因素引起的急性缺血性脑卒中、短暂性脑缺血发作、慢性脑供血不足以及出血性脑卒中的治疗；

进一步，所述脑卒中的预防为各种因素引起的急性缺血性脑卒中、短暂性脑缺血发作、慢性脑供血不足以及出血性脑卒中的预防；

进一步，氘代匹诺塞林对脑卒中的治疗作用的特征是针对急性发作后的任何阶段，包括急性期、亚急性期和恢复期的治疗；

进一步，氘代匹诺塞林对脑卒中的预防作用的特征是针对没有急性症状的高危人群，以及已经发生脑卒中获得治疗后的病人，其目的在于避免再次发作；

进一步，所述氘代匹诺塞林可与药学上可接受的辅料按常规制剂方法制成各种剂型的抗脑卒中药物。

本发明因此还涉及以本发明化合物作为活性成分的药物组合物。该药物组合物可根据本领域公知的方法制备。可通过发明所述氘代匹诺塞林与一种或多种药学上可接受的固体或液体赋形剂和/或辅料组合，制成与人或动物使用的任何剂型。本发明化合物在其药物组合物中的含量通常为0.1-99％。

本发明化合物或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可以为胃肠道或非肠道，如口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、鼻腔、口腔粘膜、眼、肺和呼吸道、皮肤、阴道、直肠等。

所述的药物组合剂型包括口服制剂、注射给药剂型和皮肤黏膜途径给药剂型。

所述的口服制剂包括片剂、胶囊剂、缓释剂、控释剂、滴丸剂、散剂、颗粒剂、溶液剂、乳剂、混悬剂；所述的注射给药剂型包括肌肉注射、静脉注射、静脉滴注；所述皮肤黏膜途径给药剂型包括外用溶液剂、洗剂、搽剂、软膏剂、硬膏剂、糊剂、贴剂、滴眼剂、滴鼻剂、眼用软膏剂、含漱剂、舌下片剂、粘贴片、贴膜剂。

给药剂型可以是液体剂型、固体剂型或半固体剂型。液体剂型可以是溶液剂(包括真溶液和胶体溶液)、乳剂(包括o/w型、w/o型和复乳)、混悬剂、注射剂(包括水针剂、粉针剂和输液)、滴眼剂、滴鼻剂、洗剂和搽剂等；固体剂型可以是片剂(包括普通片、肠溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡腾片、口腔崩解片)、胶囊剂(包括硬胶囊、软胶囊、肠溶胶囊)、颗粒剂、散剂、微丸、滴丸、栓剂、膜剂、贴片、气(粉)雾剂、喷雾剂等；半固体剂型可以是软膏剂、凝胶剂、糊剂等。

本发明化合物可以制成普通制剂、也制成是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。

为了将本发明化合物制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种赋形剂，包括稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、助流剂。稀释剂可以是淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙、碳酸钙等；湿润剂可以是水、乙醇、异丙醇等；粘合剂可以是淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纤维素、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羧丙基甲基纤维素、乙基纤维素、丙烯酸树脂、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等；崩解剂可以是干淀粉、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、碳酸氢钠与枸橼酸、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠等；润滑剂和助流剂可以是滑石粉、二氧化硅、硬脂酸盐、酒石酸、液体石蜡、聚乙二醇等。

本发明的化合物可进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。

为了将给药单元制成胶囊剂，可以将氘代匹诺塞林与稀释剂、助流剂混合，将混合物直接置于硬胶囊或软胶囊中。也可将氘代匹诺塞林先与稀释剂、黏合剂、崩解剂制成颗粒或微丸，再置于硬胶囊或软胶囊中。用于制备本发明化合物片剂的各稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、助流剂品种也可用于制备本发明化合物的胶囊剂。

为将本发明化合物制成注射剂，可以用水、乙醇、异丙醇、丙二醇或它们的混合物作溶剂并加入适量本领域常用的增溶剂、助溶剂、pH调节剂、渗透压调节剂。增溶剂或助溶剂可以是泊洛沙姆、卵磷脂、羟丙基-β-环糊精等；pH调节剂可以是磷酸盐、酷酸盐、盐酸、氢氧化钠等；渗透压调节剂可以是氯化钠、甘露醇、葡萄糖、磷酸盐、醋酸盐等。如制备冻干粉针剂，还可加入甘露醇、葡萄糖等作为支撑剂。

此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂或其它添加剂。为达到用药目的，增强治疗效果，本发明的药物或药物组合物可用任何公知的给药方法给药。本发明化合物药物组合物的给药剂量依照所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的个体情况，给药途径和剂型等可以有大范围的变化。一般来讲，本发明化合物的每天的合适剂量范围为0.001-400mg/kg体重。上述剂量可以一个剂量单位或分成几个剂量单位给药，这取决于医生的临床经验以及包括运用其它治疗手段的给药方案。

本发明的化合物或组合物可单独服用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用。当本发明的化合物与其它治疗药物存在协同作用时，应根据实际情况调整它的剂量。

本发明的有益效果在于：本发明采用脑缺血再灌注以及脑出血大鼠模型，对氘代匹诺塞林抗脑卒中作用进行了考察。结果显示，通过注射氘代匹诺塞林可显著改善脑缺血大鼠的神经行为学缺损症状，降低脑缺血大鼠脑梗死体积和脑水肿百分比，降低大鼠血脑屏障的开放程度与通透性，氘代匹诺塞林的效果优于匹诺塞林原型药物。同时，氘代匹诺塞林相比于匹诺塞林原型药物具有更优的药代动力学性质和更高的脑组织浓度。本发明为脑卒中的预防与治疗提供了一种有效的解决办法。

附图说明

图1.氘代匹诺塞林的质谱图。

图2.氘代匹诺塞林的药代动力学性质和脑组织分布(

图4.氘代匹诺塞林对脑缺血再灌注大鼠脑梗死体积的影响

图5.氘代匹诺塞林对脑缺血再灌注大鼠脑含水量百分比的影响(

图6.氘代匹诺塞林对脑出血大鼠血脑屏障开放程度的影响(

Sham：假手术对照组；I/R：模型组；I/R+Pino：匹诺塞林治疗组(10mg/kg)；I/R+Pino-I：氘代匹诺塞林I治疗组(10mg/kg)；I/R+Pino-II：氘代匹诺塞林II治疗组(10mg/kg)；I/R+Pino-III：氘代匹诺塞林III治疗组(10mg/kg)。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案、优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述。

一、化学合成实验：

氘代匹诺塞林的合成

实验材料：5，7－二羟基黄酮由中国医学科学院药物研究所制备，乙酸乙酯购自国药集团化学试剂有限公司，钯碳、氢氧化钠(NaOH)和氧化氘(D

实施例1：氘代匹诺塞林I的合成

I以5，7－二羟基黄酮为原料，5，7－二羟基黄酮为原料的投料量为10.00g，以乙酸乙酯为溶剂，氘气为氘供体，在钯碳催化下进行加成还原，反应停止后，无水硫酸钠干燥，旋蒸蒸干，最后通过硅胶柱层析得到氘代匹诺塞林I，重量7.82g，收率为78.2％。

实施例2：氘代匹诺塞林III的合成

将10.00g氘代匹诺塞林I在NaOH和D

实施例3：氘代匹诺塞林II的合成

最后，将10.00g氘代匹诺塞林III在MeOH加热条件下反应，进行置换反应，反应停止后，无水硫酸钠干燥，旋蒸蒸干，最后通过硅胶柱层析得到氘代匹诺塞林II，重量为9.32g，收率为93.2％。

三种氘代匹诺塞林经质谱仪负离子模式检测的谱图及相应的m/z如图1所示。

二、药理实验：

实验例1：氘代匹诺塞林的药代动力学性质和脑组织分布

实验材料：SPF级雄性SD大鼠，体重240～260克，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号：SCXK(京)2014-0004。氘代匹诺塞林由中国医学科学院药物研究所制备。甲醇和乙腈均为色谱纯(Fisher，USA)，其余试剂为市售分析纯。

实验仪器：Agilent 1200series高效液相色谱仪(G1379B在线脱气机，G1311A四元梯度泵，G1329A自动进样器，G1316A DAD检测器)。Agilent 6110单四级杆质谱。

实验分组：SD大鼠随机分为匹诺塞林组(Pino，10mg/kg)、氘代匹诺塞林I组(Pino-Ⅰ，10mg/kg)、氘代匹诺塞林II组(Pino-Ⅱ，10mg/kg)、氘代匹诺塞林III组(Pino-Ⅲ，10mg/kg)，每组6只，静脉注射给药。

SD大鼠给药前禁食12h，然后于给药前及给药后不同时间点，由眼内眦静脉丛取血于肝素化EP管中，5000rpm，4℃离心10min，取上层血浆存于-80℃备用。检测时，取血浆150μL处理后用于HPLC-MS分析。采用DAS 2.0软件进行数据处理统计。

结果：如图2和表1所示，静脉注射药物后，氘代匹诺塞林I、II、III的药代动力学性质相比于匹诺塞林原型药物得到明显改善。氘代匹诺塞林I、II、III的AUC

表1大鼠静脉注射氘代匹诺塞林后药代动力学参数(

实验例2：氘代匹诺塞林对脑缺血再灌注大鼠神经行为学缺损症状的影响

实验材料：SPF级雄性SD大鼠，体重240～260克，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号：SCXK(京)2014-0004。氘代匹诺塞林由中国医学科学院药物研究所制备。

实验分组：SD大鼠随机分为假手术对照组(Sham)、模型组(I/R)、匹诺塞林组(I/R+Pino，10mg/kg)、氘代匹诺塞林I组(I/R+Pino-Ⅰ，10mg/kg)、氘代匹诺塞林II组(I/R+Pino+Ⅱ，10mg/kg)、氘代匹诺塞林III组(I/R+Pino-Ⅲ，10mg/kg)，每组10只。

脑缺血再灌注动物模型建立：采用线栓法制备大脑中动脉闭塞/再灌注(MCAO/R)模型。采用异氟烷麻醉大鼠，仰卧位固定，颈正中线切口，钝性分离，沿胸锁乳突肌内缘分离肌肉和筋膜，分离右侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA)。用1号缝合线勒紧CCA近心端及ICA，结扎ECA远心端，并于ECA下埋线用于固定线栓，ECA上剪出斜行切口，插入线栓，进入18mm左右，固定线栓。缺血1.5h后，拔出线栓，实现再灌注，同时尾静脉注射给药。逐层缝合伤口后，大鼠归笼饲养，每隔12h静脉注射10mg/kg药物。

神经行为学缺损评分(Neurological deficit score)：再灌注48h，处死动物前进行神经行为学缺损评分。具体操作：提起鼠尾离开地面，观察大鼠两前肢伸展状况，然后将大鼠置于水平地面，观察其爬行情况，推动其双肩，观察两侧抵抗力有无差异。采用五级评分法(0～4分)，分数越高，说明其神经行为损伤越严重。

结果：如图3所示，模型组大鼠的神经行为学缺损评分为3.80±0.42；匹诺塞林组大鼠的神经行为学缺损评分为2.90±0.74，与模型组相比显著降低(P<0.01)；氘代匹诺塞林I组大鼠的神经行为学缺损评分为2.60±0.52，与模型组相比显著降低(P<0.001)；氘代匹诺塞林高II组大鼠的神经行为学缺损评分为2.20±0.42，与模型组相比神经行为学缺损症状改善更明显(P<0.001)；氘代匹诺塞林高III组大鼠的神经行为学缺损评分为2.00±0.47，与模型组相比神经行为学缺损症状改善更明显(P<0.001)。同时，以上数据提示氘代匹诺塞林相比匹诺塞林具有更显著的改善脑缺血再灌注引起的神经功能损伤的作用。

实验例3：氘代匹诺塞林对脑缺血再灌注大鼠脑梗死体积(infarct volume)的影响

实验材料：TTC(2，3，5-三苯基氯化四氮唑)购自西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)。其他相关实验材料同实验例1。

实验分组：SD大鼠随机分为假手术对照组、模型组、匹诺塞林组(10mg/kg)、氘代匹诺塞林I组(10mg/kg)、氘代匹诺塞林II组(10mg/kg)、氘代匹诺塞林III组(10mg/kg)，每组10只。

脑梗死体积测定：将大鼠脑组织置于-20℃冰箱，15min后取出置于大鼠脑切片模具中，切除嗅球、小脑和低位脑干后，间隔2mm冠状切片。然后迅速将脑切片置于0.5％TTC溶液中，于37℃避光孵育20min。经TTC染色后，正常组织呈玫瑰红色，而缺血梗死组织呈苍白色。取出脑片，置于4％的多聚甲醛溶液中固定。最后将每只大鼠的脑片排列整齐，拍照保存。采用Image J图像分析软件计算每张脑片的总面积和梗死面积，然后根据脑片厚度和测得的面积换算得到脑梗死体积。

结果：TTC是脂溶性光敏感复合物，和活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶反应，生成红色的甲臜，用来反应组织细胞的活力，因缺血组织内琥珀酸脱氢酶活性下降，不能与TTC反应，而呈苍白色。如图4所示，模型组大鼠的脑梗死体积百分比为42.12±6.55％；匹诺塞林治疗组大鼠的脑梗死体积百分比为33.23±3.19％，与模型组相比有显著降低(P<0.001)；氘代匹诺塞林I组大鼠的脑梗死体积百分比为27.68±5.27％，与模型组相比显著降低(P<0.001)；氘代匹诺塞林II组大鼠的脑梗死体积百分比为24.63±4.05％，与模型组相比脑梗死状态改善更明显(P<0.001)；氘代匹诺塞林III组大鼠的脑梗死体积百分比为19.14±2.23％，与模型组相比脑梗死状态改善更明显(P<0.001)。这提示氘代匹诺塞林相比于匹诺塞林可以更显著降低脑梗死体积。

实验例4：氘代匹诺塞林对脑缺血再灌注大鼠脑含水量(cerebral watercontent)的影响

实验分组：SD大鼠随机分为假手术对照组、模型组、匹诺塞林组(10mg/kg)、氘代匹诺塞林I组(10mg/kg)、氘代匹诺塞林II组(10mg/kg)、氘代匹诺塞林III组(10mg/kg)，每组10只。其他相关实验材料和实验方案同实验例1。

脑水肿检测：大鼠脑组织取出后，称湿重，然后将脑组织置于100℃恒温干燥箱中，烘干24h至恒重即为干重。脑含水量百分比＝(湿重-干重)/湿重×100％。

结果：如图5所示，模型组大鼠的脑含水量百分比为80.93±3.73％；匹诺塞林组大鼠的脑含水量百分比为76.74±1.70％，与模型组相比有显著降低(P<0.01)；氘代匹诺塞I组大鼠的脑含水量百分比为75.60±2.20％，与模型组相比有显著降低(P<0.001)；氘代匹诺塞II组大鼠的脑含水量百分比为75.15±2.74％，与模型组相比有显著降低(P<0.001)。氘代匹诺塞III组大鼠的脑含水量百分比为74.43±1.77％，与模型组相比降低更为显著(P<0.001)。同时，以上数据提示氘代匹诺塞林相比匹诺塞林可以更加显著的抑制脑缺血再灌注大鼠的脑水肿状态，降低脑组织损伤。

实验例5：氘代匹诺塞林对脑出血大鼠血脑屏障开放程度的影响

实验材料：伊文思蓝(Evans Blue)购自Sigma-Aldrich。其他相关实验材料同实验例1。

实验分组：SD大鼠随机分为假手术对照组、模型组、匹诺塞林组(10mg/kg)、氘代匹诺塞林I组(10mg/kg)、氘代匹诺塞林II组(10mg/kg)、氘代匹诺塞林III组(10mg/kg)，每组6只。大鼠麻醉后，俯卧固定，沿头颅正中切开皮肤，暴露前囱，于右侧尾壳核体表前囱垂直3mm后，侧开1mm处，用颅骨钻开此处，用微量进样器将2μL胶原酶匀速注入，进针深度为5.5mm，留针5min，取出微量进样器，缝合切口，术后腹腔注射青霉素预防感染。

每隔12h静脉注射10mg/kg治疗药物，实验终点48h时，大鼠静脉注射4％Evansblue(0.2mL/100g)，随后灌注20mL 10U/mL的肝素钠来冲出血液。然后将大脑分离，称重，并用50％三氯乙酸溶液匀浆。400×g离心20min后，采用分光光度法以620nm进行测定。脑缺血半球Evans blue的含量以ng/g表示。

结果：Evans blue是常用的偶氮染料试剂，其分子量与血浆白蛋白相近，与血液中血浆白蛋白有着很高的亲和力。正常状态下，血浆白蛋白无法透过血脑屏障(Blood brainbarrier，BBB)，因而Evans blue无法使其着色。在脑卒中过程中，血脑屏障被破坏，Evansblue进入神经系统并使其着色。如图6所示，模型组大鼠的Evans blue渗透量明显增加(4240.0±337.6ng/g)，表明其血脑屏障被严重破坏，血脑屏障开放程度增加。匹诺塞林组大鼠的Evans blue渗透量与模型组相比有显著降低(3109.6±546.9ng/g，P<0.001)，血脑屏障开放程度降低。氘代匹诺塞林I组大鼠的Evans blue渗透量为(2740.3±618.7ng/g)，氘代匹诺塞林II组大鼠的Evans blue渗透量为(2285.4±282.3ng/g)，氘代匹诺塞林III组大鼠的Evans blue渗透量为(1926.1±224.6ng/g)，各组与模型组相比均有显著降低(P<0.001)，且各组Evans blue渗透量均低于匹诺塞林组，血脑屏障损伤程度明显降低。这提示氘代匹诺塞林相比于匹诺塞林可以更明显抑制脑出血大鼠血脑屏障损伤，降低其开放程度和通透性，发挥血脑屏障保护作用。

综上所述，本发明采用脑缺血再灌注以及脑出血大鼠模型对氘代匹诺塞林抗脑卒中作用进行了考察，结果显示，通过注射氘代匹诺塞林能显著改善脑卒中大鼠的神经行为学缺损症状，显著降低脑卒中大鼠的脑梗死体积和脑水肿程度，降低血脑屏障的通透性和开放程度。因此，氘代匹诺塞林具有抗脑卒中作用，并且其治疗作用优于匹诺塞林原型药物。同时，氘代匹诺塞林相比于匹诺塞林原型药物具有更优的药代动力学性质和更高的脑组织浓度。以氘代匹诺塞林为活性物质，单独使用或/与其他具有药理学活性的化合物或提取物组成复方使用，按照药学领域的常规制剂方法制成各种剂型的抗脑卒中药物，或与其他药物等制成复方制剂，用于在保持疗效的情况下减少药物作用中的不良反应，为脑卒中的预防与治疗提供了一种有效的解决办法。

最后说明的是，以上实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本非发明的优选实施例已对本发明进行了描述，但本领域普通技术人员应当理解，可以在实行上和细节上对其做出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求说明书所限定的本发明的精神和范围。