一种毛新杨种苗的组织培养方法

摘要

本发明提供了一种毛新杨种苗的组织培养方法，包括以下步骤：(1)取毛新杨外植体并进行灭菌处理，得到脱毒外植体；(2)将所述脱毒外植体接种于诱导培养基中进行诱导培养，得到不定芽；(3)将所述不定芽接种于继代培养基中进行继代培养，得到继代苗；(4)将所述继代苗接种于生根培养基中进行生根培养，得到生根苗。本发明解决了毛新杨繁殖效率低，无法实现工厂化生产的问题，并高效诱导出毛新杨不定芽，筛选出繁殖系数达3.8的培养基配方，缩短了毛新杨繁殖周期。

说明书

技术领域

本发明涉及杨树繁育技术领域，具体涉及一种毛新杨种苗的组织培养方法。

背景技术

毛新杨花枝来自于中国农业大学校园内，是五十年代徐纬英教授等人培育毛白杨和新疆杨杂交而得的品种，它具有毛白杨的优良特性。并且与毛白杨相比，毛新杨不飘絮，二冠幅呈菱形成长。因此，毛新杨的栽培值得大力推广。

目前我国已经使用组织培养的方法对杨树进行繁育。即采用茎段或茎尖为外植体，经灭菌后接种在培养基上，获得生根率高的试管苗。然而，目前没有针对毛新杨的相应组织培养方法。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种毛新杨种苗的组织培养方法。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

本发明涉及一种毛新杨种苗的组织培养方法，包括以下步骤：

(1)取毛新杨外植体并进行灭菌处理，得到脱毒外植体；

(2)将所述脱毒外植体接种于诱导培养基中进行诱导培养，得到不定芽；

(3)将所述不定芽接种于继代培养基中进行继代培养，得到继代苗；

(4)将所述继代苗接种于生根培养基中进行生根培养，得到生根苗。

优选地，步骤(1)中，所述外植体为毛新杨的半木质化嫩枝，或毛新杨顶芽下2-3片的叶片。

优选地，步骤(1)中，所述灭菌处理为将所述外植体依次使用酒精溶液和升汞溶液浸泡后，然后用无菌水冲洗。

优选地，步骤(1)中，所述酒精溶液的体积分数为75％，所述升汞溶液的质量浓度为0.2％。

优选地，步骤(2)中，所述诱导培养基是以MS培养基为基础，并添加6-BA、IBA、蔗糖和琼脂得到，所述诱导培养基中6-BA的浓度为0.3mg/L，IBA的浓度为0.2mg/L，蔗糖的浓度为30g/L，琼脂的浓度为6g/L，且所述诱导培养基的pH值为5.8～6.0。

优选地，步骤(2)中，所述诱导培养为将所述脱毒外植体接种于诱导培养基中，在温度为25±1℃、光照强度为1800～2200Lx、光照时间为12～16h/天的条件下进行培养15～25天，直至生成不定芽。

优选地，步骤(3)中，所述继代培养基是以MS培养基为基础，并添加6-BA、IBA、蔗糖和琼脂得到，所述继代培养基中6-BA的浓度为0.2mg/L，IBA的浓度为0.1mg/L，蔗糖的浓度为30g/L，琼脂的浓度为6g/L，且所述继代培养基的pH值为5.8～6.0。

优选地，步骤(3)中，所述继代培养为将所述不定芽接种于继代培养基中，在温度为25±1℃、光照强度为1800～2200Lx、光照时间为12～16h/天的条件下进行培养，每隔20～25天进行一次继代培养，每次继代培养更换培养基，并对不定芽进行分化，直至得到继代苗。

优选地，步骤(4)中，所述生根培养基是以1/2MS培养基为基础，并添加NAA、IBA、蔗糖和琼脂得到，所述生根培养基中NAA的浓度为0.1mg/L，IBA的浓度为0.1mg/L，蔗糖的浓度为30g/L，琼脂的浓度为6g/L，且所述生根培养基的pH值为5.8～6.0。

优选地，步骤(4)中，所述生根培养为将所述继代苗接种于生根培养基中，在温度为25±1℃、光照强度为1800～2200Lx、光照时间为12～16h/天的条件下，培养20～30天，得到生根苗。

优选地，步骤(4)结束后，还包括步骤(5)：将所述生根苗连同生根培养基置于温室大棚的苗床上，在自然光下培育7～10天，然后将生根苗洗净后，在基质中培养30～40天得到移栽苗。

优选地，所述基质中草炭、蛭石、珍珠岩的体积比为3：2：1。

本发明的有益效果：

本发明提供了一种针对毛新杨的标准化组织培养种苗的方法，具体操作方式包括：将毛新杨当年生幼嫩茎段经消毒灭菌，再切掉两端接种于诱导培养基中进行诱导培养至生成不定芽；然后将不定芽切成块后，置于继代培养基中进行继代培养得到继代苗；再将继代苗切分成单株后，置于生根培养基中进行生根培养得到生根苗；最后将生根苗驯化后定植得到移栽苗，成活率达到90％以上。本发明解决了毛新杨繁殖效率低，无法实现工厂化生产的问题，并高效诱导出毛新杨不定芽，筛选出繁殖系数达3.8的培养基配方，缩短了毛新杨繁殖周期。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。

本发明实施例涉及一种毛新杨种苗的组织培养方法，包括以下步骤：

(1)外植体灭菌处理：

取毛新杨外植体并进行灭菌处理，得到脱毒外植体。

其中，外植体是作为离体培养材料的植物器官或组织的片段，其具有代谢旺盛，再生能力强的特点。在本发明的一个实施例中，外植体为毛新杨的半木质化嫩枝，或毛新杨顶芽下2-3片的叶片。

在本发明的一个实施例中，灭菌处理为将外植体依次使用酒精溶液和升汞溶液浸泡后，然后用无菌水冲洗。升汞的学名是氯化汞，形态为白色晶体、颗粒或粉末，可作为消毒剂和防腐剂。其中，酒精溶液的体积分数可以为75％，升汞溶液的质量浓度可以为0.2％。

在本发明的一个具体实施例中，步骤(1)包括：将毛新杨当年生嫩茎在质量浓度为75％的酒精中消毒灭菌40～60秒后，转移到质量浓度为0.2％的升汞溶液中消毒灭菌10～15分钟，然后用无菌水冲洗3～5次，得到脱毒外植体。

(2)不定芽培养：

将脱毒外植体接种于诱导培养基中进行诱导培养，得到不定芽。

在本发明的一个实施例中，诱导培养基是以MS培养基为基础，并添加6-BA、IBA、蔗糖和琼脂得到，诱导培养基中6-BA的浓度为0.3mg/L，IBA的浓度为0.2mg/L，蔗糖的浓度为30g/L，琼脂的浓度为6g/L，且诱导培养基的pH值为5.8～6.0。

其中，IBA为吲哚丁酸，对植物抽枝或芽、苗等的顶部芽端形成有促进作用，也可以将其替换为吲哚乙酸。6-BA为苄氨基腺嘌呤，为人工合成的细胞分裂素，具有高效、稳定、廉价和易于使用等特点。6-BA的主要作用是促进芽的形成，也可以诱导愈伤组织发生。

在本发明的一个实施例中，诱导培养的具体条件为：在温度为25±1℃、光照强度为1800～2200Lx、光照时间为12～16h/天的条件下进行培养15～25天，直至生成不定芽。

在本发明的一个具体实施例中，步骤(2)包括：在无菌工作环境中，将消毒后的茎段切掉与消毒剂接触的两端，然后将茎段剪成长度为0.5cm～1cm，有1～2个生长点的分段，接种于诱导培养基中：诱导培养基是以MS培养基为基础，并添加6-BA、IBA、蔗糖和琼脂得到，诱导培养基中6-BA的浓度为0.3mg/L，IBA的浓度为0.2mg/L，蔗糖的浓度为30g/L，琼脂的浓度为6g/L，且pH值为5.8～6.0。在温度为25±1℃、光照强度为1800～2200Lx、光照时间为12～16h/天下培养15～25天，直至生成不定芽。

(3)继代培养：

将不定芽接种于继代培养基中进行继代培养，得到继代苗。

在本发明的一个实施例中，继代培养基是以MS培养基为基础，并添加6-BA、IBA、蔗糖和琼脂得到，继代培养基中6-BA的浓度为0.2mg/L，IBA的浓度为0.1mg/L，蔗糖的浓度为30g/L，琼脂的浓度为6g/L，且继代培养基的pH值为5.8～6.0。

在本发明的一个实施例中，继代培养的具体条件为：在温度为25±1℃、光照强度为1800～2200Lx、光照时间为12～16h/天的条件下进行培养，每隔20～25天进行一次继代培养，每次继代培养更换培养基，并对不定芽进行切段分化，直至得到继代苗。

在本发明的一个具体实施例中，步骤(3)包括：在无菌工作环境中，将不定芽切成块后置于继代培养基中：继代培养基是以MS培养基为基础，并添加6-BA、IBA、蔗糖和琼脂得到，继代培养基中6-BA的浓度为0.2mg/L，IBA的浓度为0.1mg/L，蔗糖的浓度为30g/L，琼脂的浓度为6g/L，且继代培养基的pH值为5.8～6.0。并在温度为25±1℃、光照强度为1800～2200Lx、光照时间为12～16h/天的条件下进行继代培养，每20～25天继代一次，每次继代更换上述培养基，并对不定芽进行分化，直至得到继代苗。发明人发现，如果在继代培养基中加入NAA(萘乙酸，广谱植物生长调节剂)，会降低毛新杨的株高和增殖倍数，因此优选继代培养基中不加入NAA。

(4)生根培养：

将继代苗接种于生根培养基中进行生根培养，得到生根苗。

在本发明的一个实施例中，生根培养基是以1/2MS培养基为基础，并添加NAA、IBA、蔗糖和琼脂得到，生根培养基中NAA的浓度为0.1mg/L，IBA的浓度为0.1mg/L，蔗糖的浓度为30g/L，琼脂的浓度为6g/L，且生根培养基的pH值为5.8～6.0。

在本发明的一个实施例中，生根培养的具体条件为：在温度为25±1℃、光照强度为1800～2200Lx、光照时间为12～16h/天的条件下，培养20～30天，得到生根苗。

在本发明的一个具体实施例中，步骤(4)包括：将继代苗切分成单株后，置于生根培养基中。生根培养基是以1/2MS培养基为基础，并添加NAA、IBA、蔗糖和琼脂得到，生根培养基中NAA的浓度为0.1mg/L，IBA的浓度为0.1mg/L，蔗糖的浓度为30g/L，琼脂的浓度为6g/L，且生根培养基的pH值为5.8～6.0。并在温度为25±1℃、光照强度为1800～2200Lx、光照时间为12～16h/天的条件下培养20～30天，得到生根苗。

在本发明的一个实施例中，步骤(4)结束后，还包括步骤(5)炼苗移栽。“炼苗”是指在适当控制温度、湿度、气体交换等条件下，使已生根的组培苗逐步适应大气环境的过程。具体过程为：

将生根苗连同生根培养基一同置于温室大棚的苗床上，在自然光下培育7～10天，然后将生根苗洗净后，置于质量浓度为0.1～0.2％的多菌灵中浸泡2～5min，然后移栽于基质中，待30～40天后得到移栽苗，成活率达到90％以上。

在本发明的一个实施例中，基质中草炭、蛭石、珍珠岩的体积比为3：2：1。作为基质的主体成分，蛭石是一种天然、无机，无毒的矿物质，透水性较好，能够有效地促进植物根系的生长和幼苗的稳定发育。长时间提供植物生长所必需的水分及营养，并能保持根阳光温度的稳定。蛭石可使作物从生长初期就能获得充足的水分及矿物质，促进植物较快生长，增加产量。由于移栽后的生根苗会高速生长，所以需要基质中含有较多的养分，因此基质中还要加入草炭。

实施例1

采用瓶内生根法培养毛新杨：

(1)外植体灭菌处理：

将毛新杨当年生嫩茎在质量浓度为75％的酒精中消毒灭菌40～60秒后，转移到质量浓度为0.2％的升汞溶液中消毒灭菌10～15分钟，然后用无菌水冲洗3～5次，得到脱毒外植体。

(2)不定芽培养：

在无菌工作环境中，将消毒后的茎段切掉与消毒剂接触的两端，然后将茎段剪成长度为0.5cm～1cm，有1～2个生长点的分段，接种于诱导培养基中：诱导培养基是以MS培养基为基础，并添加6-BA、IBA、蔗糖和琼脂得到，诱导培养基中6-BA的浓度为0.3mg/L，IBA的浓度为0.2mg/L，蔗糖的浓度为30g/L，琼脂的浓度为6g/L，且pH值为5.8～6.0。在温度为25±1℃、光照强度为1800～2200Lx、光照时间为12～16h/天下培养15～25天，直至生成不定芽。

(3)继代培养：

在无菌工作环境中，将不定芽切成块后置于继代培养基中：继代培养基是以MS培养基为基础，并添加6-BA、IBA、蔗糖和琼脂得到，继代培养基中6-BA的浓度为0.1～0.3mg/L，IBA的浓度为0.1～0.3mg/L，蔗糖的浓度为30g/L，琼脂的浓度为6g/L，且继代培养基的pH值为5.8～6.0。并在温度为25±1℃、光照强度为1800～2200Lx、光照时间为12～16h/天的条件下进行继代培养，每20～25天继代一次，每次继代更换上述培养基，并对不定芽进行分化，直至得到继代苗。

(4)生根培养：

将继代苗切分成单株后，置于生根培养基中。生根培养基是以1/2MS培养基为基础，并添加NAA、IBA、蔗糖和琼脂得到，生根培养基中NAA的浓度为0.1mg/L，IBA的浓度为0.1mg/L，蔗糖的浓度为30g/L，琼脂的浓度为6g/L，且生根培养基的pH值为5.8～6.0。并在温度为25±1℃、光照强度为1800～2200Lx、光照时间为12～16h/天的条件下培养20～30天，得到生根苗。

(5)炼苗移栽：

将生根苗连同生根培养基一同置于温室大棚的苗床上，在自然光下培育7～10天，然后将生根苗洗净后，置于质量浓度为0.1～0.2％的多菌灵中浸泡2～5min，然后移栽于基质中，待30～40天后得到移栽苗。基质中草炭、蛭石、珍珠岩的体积比为3：2：1。

实施例1-1至实施例1-5

改变步骤(3)继代培养基中的试剂种类与用量，观察不同激素组合对毛新杨不定芽繁殖系数的影响，结果见表1。其中，增殖倍数＝外植体生长点增殖总数/分化外植体总数，采用求平均值的方法算出。

表1

从表1可看出，对比实施例1-1至1-3，当6-BA浓度为0.2mg/L时，毛新杨的株高和增殖倍数最好。然而，从实施例1-3至1-5可知，当IBA浓度为0.1mg/L，6-BA浓度为0.2mg/L时，株高和增殖效果最明显，特别是当不使用NAA时，增殖倍数在3.8以上。因此对于继代培养步骤，最适宜的继代培养基配方是MS+0.2mg/L的6-BA+0.1mg/L的IBA。

实施例2

在步骤(3)的继代培养中，继代培养基中6-BA的浓度为0.2mg/L，IBA的浓度为0.1mg/L，蔗糖的浓度为30g/L，琼脂的浓度为6g/L，不使用NAA，且继代培养基的pH值为5.8～6.0。

在步骤(4)的生根培养中，生根培养基中NAA的浓度为0.1～0.3mg/L，IBA的浓度为0.1～0.5mg/L，蔗糖的浓度为30g/L，琼脂的浓度为6g/L，且生根培养基的pH值为5.8～6.0。其它步骤和操作方式同实施例1。

实施例2-1至实施例2-5

改变步骤(4)生根培养基中的试剂种类与用量，观察不同激素组合对毛新杨生根率和生根条数的影响，结果见表2。

表2

从表2可看出，毛新杨在实施例2-1至2-5的生根培养基上都可以生根，但当NAA和IBA浓度不满足要求时生根率低，说明毛新杨是不易生根的植物。对比上述实施例可知，最适宜的生根培养基配方是1/2MS+0.1mg/L的NAA+0.1mg/L的IBA。

对比例1

采用实施例1的方法培养毛白杨，除杨树品种不同外，其它操作同实施例1，结果见表3。

表3

表3的平均株高和增殖倍数与表1相比下降较大，说明本发明的方法只适用于培养毛新杨，对于其它杨树品种不适用。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。