人组蛋白H3 Ser10和Ser28在鉴定人早期胚胎的发育分期中的应用

摘要

本发明涉及一种检测人H3Ser10和H3Ser28磷酸化状态产品的新用途。H3Ser10的磷酸化状态可用于鉴定或辅助鉴定人胚胎中雄原核数量、人胚胎发育时期、人卵母细胞的生长时期、或筛选人胚胎或人卵子；H3Ser28的磷酸化状态可用于鉴定或辅助鉴定人胚胎发育时期、人卵母细胞的生长时期、或筛选人胚胎或人卵子。

说明书

技术领域

本发明涉及人类辅助生殖技术领域，尤其涉及人组蛋白H3 Ser10(第10位丝氨酸)和Ser28(第28位丝氨酸)在鉴定人早期胚胎的发育分期中的应用。

背景技术

表观遗传学是遗传学的一门分支学科，它是研究在非DNA序列变化的前提下，引起的可以传给下一代的基因表达变化。它的研究范畴包括DNA甲基化(DNA methylation)，组蛋白翻译后修饰(post translational modifications,PTMs)，基因组印记(genomicimprinting)，RNA编辑(RNA editing)，基因沉默(gene silencing)，母体效应(maternaleffects)和休眠转座子激活等。表观遗传学不仅与维持细胞正常增值与凋亡有关，而且与胚胎发育、细胞恶性转变密切相关。在生殖细胞的生长及受精后的胚胎发育过程中，每一步都要有精确而复杂的表观遗传修饰变化。

在遗传表观修饰中，组蛋白翻译后修饰是较为普遍的一种修饰方式。它包含了组蛋白的磷酸化、乙酰化、甲基化、ADP核糖基及化泛素化等。其中，组蛋白磷酸化是组蛋白N-端氨基酸残基的磷酸化修饰过程，组蛋白H3的磷酸化的主要位点是第10位丝氨酸(Ser10)、第28位丝氨酸(Ser28)、第3位苏氨酸(Thr3)以及第11位苏氨酸上(Thr11)。在哺乳动物组蛋白磷酸当中，最具有代表意义的就是组蛋白H3 Ser10(H3第10位丝氨酸)和H3 Ser28(第28位丝氨酸)的磷酸化，随着卵母细胞的减数分裂成熟，H3Ser10磷酸化和H3Ser28磷酸化的分布与表达也发生着变化。

王强等人在小鼠中关于H3Ser10以及H3Ser28的研究表明，在生发泡(GV)期卵母细胞中，H3Ser10磷酸化有明显的信号并与DNA共定位，减数分裂恢复后，H3Ser10磷酸化的信号遍布在整个染色体上，但在第一次减数分裂中期着丝粒周围的异染色质中信号最强；但Swain等人的研究表明，在小鼠GV期未发现磷酸化的H3Ser10。在对猪卵母细胞成熟过程的研究发现，H3Ser10在GV期磷酸化的信号较弱，随着生发泡破裂，H3Ser10磷酸化的信号逐渐增强，从前中期到第二次分裂中期一直分布于整个染色体上；H3Ser28磷酸化信号在GV期时比较弱，从Pre-MI到MII一直环绕于染色体周围，后期消失。对于兔卵母细胞组蛋白磷酸化的研究表明，H3Ser10磷酸化发生于生发泡破裂期，并且在生发泡破裂期达到顶峰，在第一次减数分裂中发生部分的去磷酸化，磷酸化信号变弱，但在第二次减数分裂时磷酸化水平又再次慢慢升高。

从现有报道可以看出，组蛋白H3的磷酸化在卵母细胞成熟过程中具有代表性，但是，在不同物种之间的磷酸化模式并不相同，尤其是针对同一物种(小鼠)也有不同的研究结果，尤其是目前还没有对于人类卵母细胞成熟过程中组蛋白H3磷酸化状态的报道。

本发明采用特异性抗体和免疫荧光技术，探究了人卵母细胞成熟过程及早期胚胎发育过程中的组蛋白H3磷酸化进程，填补了人类辅助生殖生育技术相关的基础研究空白。

发明内容

本文中的人组蛋白H3 Ser10是指人组蛋白H3的第10位丝氨酸，Ser28是指第28位丝氨酸，如无特殊说明，本文中的H3Ser10即指人组蛋白H3第10位丝氨酸，H3Ser28即指人组蛋白H3第28位丝氨酸。

本发明一方面提供了检测人组蛋白H3 Ser10和Ser28的磷酸化的产品，所述产品优选抗人组蛋白H3 Ser10和Ser28磷酸化的抗体，优选单克隆抗体。

另一方面，本发明提供了检测人组蛋白H3 Ser10和Ser28的磷酸化的产品的用途，所述用途为鉴定人卵母细胞成熟分期，所述人卵母细胞成熟分期包括GV期(生发泡期)、MI期(第一次减数分裂中期)、ATI期(第一次减数分裂后末期)和MII期(第二次减数分裂中期)。

在一个实施方式中，H3Ser10的磷酸化存在于人卵母细胞的GV期、MI期、ATI期和MII期，H3Se28的磷酸化存在于人卵母细胞的MI期、ATI期和MII期，H3Ser28的磷酸化并不存在于人卵母细胞的GV期。

在一个实施方式中，H3Ser10和H3Ser28同时磷酸化表明人卵母细胞处于MI期、ATI期和MII期，H3Ser10磷酸化、而H3Ser28不磷酸化表明人卵母细胞处于GV期，同时检测H3Ser10和H3Ser28的磷酸化状态可提高鉴定结果的准确性。

优选的，所述卵母细胞来源于ICSI(intracytoplasmic sperm injection，卵胞浆内单精子显微注射)

在另一个实施方式中，检测人组蛋白H3 Ser10和Ser28的磷酸化的产品还可用于鉴定人早期胚胎的发育分期，所述人早期胚胎的发育分期包括原核期和1-细胞期，所述原核期是指精子进入卵子后，卵子及精子的遗传物质形成两个明显可见原核的时期，所述1-细胞期是指原核消失后，胚胎发生第一次细胞分裂前的阶段。

在一个实施方式中，H3Ser10磷酸化在人早期胚胎的原核期主要出现在雄原核，并在1-细胞期均匀分布于染色体上；H3Ser28在人早期胚胎的原核期并未出现磷酸化信号，但随着胚胎的进一步发育，在1-细胞期可以看到其定位于染色体上。

在一个实施方式中，H3Ser10和H3Ser28同时磷酸化表明人早期胚胎处于1-细胞期，H3Ser10磷酸化、而H3Ser28不磷酸化表明人早期胚胎处于原核期。

优选的，所述人早期胚胎来源于IVF(in vitro fertilization，体外受精)和/或ICSI(intracytoplasmic sperm injection，卵胞浆内单精子显微注射)。

优选的，所述人早期胚胎为2原核(pronucleus，2PN)胚胎或3原核(pronucleus，3PN)胚胎。

在另一个实施方式中，H3Ser10磷酸化、而H3Ser28不磷酸化表明人早期胚胎处于原核期，同时，H3Ser10磷酸化的原核数量可反映雄原核的数目；当处于原核期的人早期胚胎中n个原核的H3Ser10发生磷酸化时，则判断该人早期胚胎中雄原核数量为n，优选的，n为整数，且n≥1。

另一方面，本发明还提供了一种鉴定人卵母细胞成熟分期的试剂盒，所述试剂盒包括检测人组蛋白H3 Ser10和Ser28的磷酸化的产品，所述人卵母细胞成熟分期包括GV期(生发泡期)、MI期(第一次减数分裂中期)、ATI期(第一次减数分裂后末期)和MII期(第二次减数分裂中期)。

另一方面，本发明还提供了一种鉴定人早期胚胎发育分期的试剂盒，所述试剂盒包括检测人组蛋白H3 Ser10和Ser28的磷酸化的产品，所述人早期胚胎的发育分期包括原核期和1-细胞期。

在一个实施方式中，所述检测人组蛋白H3 Ser10和Ser28的磷酸化的产品为抗人组蛋白H3 Ser10和Ser28磷酸化的抗体，优选单克隆抗体；所述试剂盒包括抗H3Ser10磷酸化单克隆抗体一抗和抗H3Ser28磷酸化单克隆抗体一抗，优选的，所述试剂盒还包括：所述试剂、抗内参蛋白(如α-tubulin)单克隆抗体及其它免疫荧光染色方法检测相关试剂如被标记的二抗。

另一方面，本发明还提供了鉴定人卵母细胞成熟分期的方法，所述方法包括检测人组蛋白H3Ser10和H3Ser28的磷酸化的步骤，所述所述人卵母细胞成熟分期包括GV期(生发泡期)、MI期(第一次减数分裂中期)、ATI期(第一次减数分裂后末期)和MII期(第二次减数分裂中期)。在一个实施方式中，所述H3Ser10和H3Ser28同时磷酸化表明人卵母细胞处于MI期、ATI期和MII期，在另一个实施方式中，所述H3Ser10磷酸化、H3Ser28不磷酸化表明人卵母细胞处于GV期。优选的，所述检测人组蛋白H3Ser10和H3Ser28的磷酸化通过免疫检测，更优选的，采用单抗进行检测。

另一方面，本发明还提供了鉴定人早期胚胎发育分期的方法，所述方法包括检测人组蛋白H3Ser10和H3Ser28的磷酸化的步骤，所述人早期胚胎的发育分期包括原核期和1-细胞期。在一个实施方式中，H3Ser10和H3Ser28同时磷酸化表明人早期胚胎处于1-细胞期，在另一个实施方式中，H3Ser10磷酸化、而H3Ser28不磷酸化表明人早期胚胎处于原核期，优选的，所述检测人组蛋白H3Ser10和H3Ser28的磷酸化通过免疫检测，更优选的，采用单抗进行检测，优选的，所述人早期胚胎为2原核(pronucleus，2PN)胚胎或3原核(pronucleus，3PN)胚胎。

另一方面，本发明还提供了鉴定人早期胚胎中雄原核数量的方法，所述方法包括检测人组蛋白H3Ser10和H3Ser28的磷酸化的步骤，具体而言，H3Ser10磷酸化、而H3Ser28不磷酸化表明人早期胚胎处于原核期，此时，H3Ser10磷酸化的原核数量可反映雄原核的数目；当处于原核期的人早期胚胎中n个原核的H3Ser10发生磷酸化时，则判断该人早期胚胎中雄原核数量为n，优选的，n为整数，且n≥1。

本发明的有益效果如下：

本发明首次在人卵母细胞的成熟过程中和人早期胚胎的发育过程中检测了H3Ser10和H3Ser28的磷酸化状态，对H3Ser10和H3Ser28磷酸化状态联合检测可提高对人卵母细胞成熟分期以及早期胚胎发育分期鉴定的准确性。

附图说明

图1为人卵母细胞GV期、MI期、ATI期、MII期免疫荧光染色图，抗-H3ser10ph抗体的二抗为FITC偶联(红色)，Hoechest用来染色细胞中的DNA(蓝色)，α-tubulin(绿色)。玻片在激光共聚焦显微镜下观察，标尺为10μm。

图2为人卵母细胞GV期、MI期、ATI期、MII期免疫荧光染色图，抗-H3ser28ph抗体的二抗为FITC偶联(绿色)，Hoechest用来染色细胞中的DNA(蓝色)，α-tubulin(红色)。玻片在激光共聚焦显微镜下观察，标尺为10μm。

图3为人3PN受精卵进行免疫荧光染色，抗-H3ser10磷酸化抗体的二抗为FITC偶联(红色)，Hoechest用来染色细胞中的DNA(蓝色)，α-tubulin(绿色)；抗-H3ser28磷酸化抗体所用二抗为FITC偶联(绿色)，Hoechest用来染色细胞中的DNA(蓝色)，α-tubulin(红色)。p：雄原核，m是母系原核。玻片在激光共聚焦显微镜下观察，标尺为10μm。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、材料与方法

1、研究对象

本研究的研究对象为郑州大学第一附属医院生殖中心行试管婴儿助孕治疗的患者。纳入标准：1.年龄≤35岁；2.卵泡刺激素(FSH)＜12mIU/L；3.促排方案为长方案或超长方案。患者均已签署《知情同意书》，该研究经郑州大学医学伦理委员会批准。

2、卵母细胞的获取

收集的卵母细胞为行卵胞浆内单精子显微注射时(intracytoplasmic sperminjection,ICSI)未成熟的卵母细胞。常规来说，注射人绒毛膜促性腺激素(Hcg)后36h取卵，取卵后4-6小时行卵胞浆内单精子显微注射。而这个时候只有生长到第二次减数分裂中期的卵母细胞才被认为是成熟卵母细胞，可以注射。我们收集剩下的不成熟的处于生发泡期或者第一次减数分裂期的卵母细胞，或者直接固定，或者继续体外培养。

3、促排卵方案和取卵过程

长方案：上次月经中期，用促性激素释放激素激动剂(GnRH-a,达必佳,辉灵，瑞士，或达菲林,益普生，法国)降调节,完全降调后,(即血清FSH＜5mIU/mL，E2＜50pg/mL LH＜5mIU/mL，子宫内膜厚度＜5mm,双侧卵巢内最大卵泡直径＜5mm)。月经第3-5天使用基因重组促卵泡生长激素(r-FSH,果纳芬,默克雪兰诺，瑞士，或普利康，默沙东，美国或福特蒙，伊伯萨，瑞士)或尿源性促卵泡素(HMG，丽珠，中国，或贺美奇，辉灵，瑞士)促排卵,根据卵泡大小、内分泌水平调整Gn用量，最大卵泡＞20mm或＞16mm卵泡数目占总数目2/3以上使用HCG扳机。注射hCG 36h后行B超引导下经阴道卵巢穿刺取卵术(Oocyte pick-up,OPU)。

超长方案：月经初期即月经的第2-3天皮下注射长效促性激素释放激素激动剂3.75mg(达菲林,益普生，法国)，间隔28天后清晨空腹抽血监测激素水平同时行阴道B超检查；根据患者情况择期行促排卵，根据卵泡大小、内分泌水平调整Gn用量，最大卵泡＞20mm或＞16mm卵泡数目占总数目2/3以上使用HCG扳机。注射hCG 36h后行B超引导下经阴道卵巢穿刺取卵术。

取卵术前1天阴道冲洗，手术当日再次阴道冲洗，置巾。同时采用静脉麻醉。在穿刺针进入前，超声首先确认盆腔血管位置，之后确定双侧卵巢位置及大小，卵泡的数目及大小以及子宫内膜的情况。安置好穿刺架，自阴道后穹窿或侧穹隆进针，在超声监视引导下沿着穿刺线由近及远，一次性逐一穿刺所有卵泡，抽吸负压为15kpa。成熟卵泡的卵泡液多为淡黄色，最后部分为血性。将10mm以上的卵泡逐一穿刺；一侧穿刺完毕后，换至对侧穿刺。

获取的卵冠丘复合物迅速送至实验室，实验室内拾卵者先用肉眼观察有无半透明不定形的松散粘液团块，然后在解剖镜下观察确认卵丘卵母细胞复合体(COC)，用巴斯德吸管将COC移入G-MOPS皿中。COC复合体周围如果有血块或粗黑的颗粒细胞等，可在解剖镜下用吸管割除，然后把COC放入捡卵皿中。用另一吸管把COC移入卵子漂洗液的Falcon3001皿(60ml G-IVFTM添加6.7ml SSSTM)中吹打清洗去除血细胞等，将COC放入培养液内，然后置于37℃、6％CO₂的培养箱中。4、废弃胚胎的获取

所用人早期胚胎是行体外受精(in vitro fertilization,IVF)—胚胎移植助孕病人中不符合移植及冷冻标准的废弃胚胎。胚胎来源包括：①卵裂期发育延缓，按照传统的通过定点进行形态学系列评估的III-IV级不适合移植和冷冻标准的2原核(pronucleus，2PN)胚胎；②受精异常的3原核(pronucleus，3PN)胚胎。囊胚来源包括：1.第三天不能进行移植或冷冻的废弃胚胎培养获得。2.行囊胚培养患者所得不符合移植标准的废弃囊胚(内细胞团和滋养层评分均为C级)。

5、主要抗体及试剂

6、废弃卵母细胞的培养

收集行卵胞浆内单精子显微注射时，未成熟的卵母细胞，按照分组移入已经平衡过夜的覆盖矿物油的卵泡培养液液滴中，置于37℃、6％CO₂的培养箱中，定时观察。

7、废弃胚胎的培养

收集本中心第三天无法移植和冷冻的废弃胚胎，按照胚胎来源及实验分组移入已经过夜平衡的覆盖矿物油的囊胚培养液液滴中，放于37℃、5％CO₂培养箱中继续培养至囊胚，每日观察换液。

8、人卵母细胞及胚胎免疫荧光染色实验步骤

1)将从培养室收集到的卵母细胞或胚胎迅速置于4％的多聚甲醛固定液中，固定30min。2)将卵母细胞或胚胎从固定液转移到0.5％的Triton-X-100的透膜液中，透膜20min。3)转移卵母细胞或胚胎至含有1％的天然牛血清白蛋白的封闭液中，封闭1h。4)一抗用封闭液进行1:100稀释，制成40μl液滴，将细胞从加入到此液滴中，放入4℃冰箱过夜孵育。5)次日，用含有1％Tween-20和0.01％Trition-X-100的洗脱液，清洗卵母细胞或胚胎，洗脱三次，每次5min。6)二抗用洗脱液进行1:200稀释，制成40μl液滴，将细胞移入液滴中，孵育1h。注意避光。7)二抗孵育结束后，洗脱液再次洗脱三次，每次5min。8)室温下，用Hoechest(sigma,1ug/ml)染色15min。9)在玻璃载玻片中间滴40ul抗淬灭剂液滴，将细胞置于此液滴中。10)盖玻片封片，激光共聚焦显微镜(Zeiss LSM710)下观察。

9、统计学处理

以上每个时期卵母细胞或早期胚胎至少三次独立重复实验验证。

实施例2、人卵母细胞中H3Ser10和H3Ser28磷酸化的定位

共收集到卵母细胞104个，其中GV期28个，MI期26个，ATI期24个，MII期26个，平分至H3Ser10和H3Ser28组，分别进行抗组蛋白H3第10位丝氨酸磷酸化单克隆抗体和抗组蛋白H3第28位丝氨酸磷酸化单克隆抗体的免疫荧光染色分析。

如图1所示，抗组蛋白H3第10位丝氨酸磷酸化单克隆抗体免疫荧光分析结果显示，在卵母细胞成熟过程中，H3Ser10磷酸化始终存在(见图1中的H3/Ser10-P列)，且开始于GV期卵母细胞，并与DNA共定位，一直分布于染色体上。

如图2所示，抗组蛋白H3第28位丝氨酸磷酸化单克隆抗体免疫荧光分析结果显示，在卵母细胞成熟过程中，GV期并未发现H3Ser28的磷酸化信号，随着减数分裂的恢复，在MI期可以观察到H3Ser28的磷酸化信号，且一直持续到第二次减数分裂中期(MII期)。

实施例3、IVF来源的3PN早期胚胎中H3Ser10和H3Ser28磷酸化的定位

收集到3PN合子85个，平分至H3Ser10和H3Ser28组，分别进行抗组蛋白H3第10位丝氨酸磷酸化单克隆抗体和抗组蛋白H3第28位丝氨酸磷酸化单克隆抗体的免疫荧光染色分析。

结果如图3所示：通过免疫荧光染色发现，在人3PN受精卵中，H3Ser10和H3Ser28磷酸化的定位不同，H3Ser10磷酸化在3PN原核期主要出现在雄原核，随着进一步发育，在1-细胞期均匀分布于染色体上。而对于H3Ser28在3PN原核期并未出现磷酸化信号，但随着胚胎的进一步发育，在1-细胞期可以看到其定位于染色体上。

本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术，为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以上实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，上述所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明的保护范围。