组蛋白乙酰化对小鼠体外卵母细胞和胚胎发育的影响及早期胚胎组蛋白乙酰化模式的研究

摘要

组蛋白修饰作为表观遗传的一种主要方式，它在细胞分化、细胞癌变的发生、细胞多能性等诸多方面都有很好的诠释。组蛋白乙酰化是翻译后修饰最为重要的方式之一，它有助于基因转录起始及染色质的重塑。组蛋白乙酰化修饰在哺乳动物卵母细胞的成熟及早期胚胎发育尤为重要。然而，在哺乳动物中组蛋白乙酰化修饰在卵母细胞减数分裂和胚胎发育过程中的功能相关性研究却鲜有报道。
　　本研究揭示了组蛋白乙酰化在小鼠卵母细胞减数分裂和小鼠早期胚胎发育过程中组蛋白乙酰化动态模式。(1)实验使用不同浓度的组蛋白去乙酰化酶抑制剂丁酸钠，体外处理GⅤ期卵母细胞14小时。结果发现，低浓度丁酸钠(0.1，0.5，1.0mM)处理下，卵母细胞成熟率没有显著差异，然而5.0mM和10.0mM NaBu处理下成熟率分别为为53.3±2.93％、30.2±0.05％ VS78.2±5.72％（对照组）。这些结果表明，丁酸钠具有抑制小鼠卵母细胞减数分裂恢复并以剂量依赖的方式发生。(2)为了进一步研究丁酸钠在卵母细胞减数分裂GⅤ期至MⅠ期的影响，卵母细胞在不含丁酸钠的培养液中培养3h后转入2.0mM丁酸钠5h，另一实验组在2.0mM丁酸钠体外培养8h。实验结果发现，空白对照组卵母细胞体外培养8h到第一次减数分裂中期，可检测到圆锥状纺锤体状牵引着染色体，染色体整齐的排列在赤道板位置。相比于实验组，染色体则混乱分布并呈凝集的状态，且伴随异常的纺锤体出现。同时我们利用免疫蛋白印迹方法检测MAPK磷酸化状态。实验结果显示ERK1/2和P-ERK1/2蛋白水平随丁酸钠处理时间增加而显著下调(P＜0.05）。
　　利用免疫荧光技术分析并进一步确定小鼠体内胚、体外胚、孤雌胚组蛋白H3K9乙酰化动态模式。实验结果发现:在胚胎2-细胞与8-细胞阶段，体内胚、体外胚及孤雌胚组蛋白H3K9乙酰化水平没有显著差异。在胚胎4-细胞阶段，体内胚组蛋白H3K9乙酰化水平(0.76±0.27)显著高于孤雌胚(0.29±0.78)(P＜0.05)。桑葚胚和囊胚期，体外胚和孤雌胚组蛋白H3K9乙酰化水平明显低于体内胚(P＜0.05)。在8-细胞阶段，三种胚胎的组蛋白H3K9乙酰化均达到最低水平。以上的结果表明，小鼠的体内胚、体外胚及孤雌胚组蛋白H3K9乙酰化呈现动态变化的。
　　本研究还评估了丁酸钠对体外受精胚胎发育率的影响。并且对组蛋白乙酰化调控基因HDAC1和多能性转录因子(Pou5f1，Sox2)mRNA表达进行了检测。(1)受精卵置于2.0mM NaBu的KSOM+AA培养液处理24h。相比于空白对照组发现，在卵裂率和桑葚胚率没有明显变化。然而在囊胚阶段，囊胚率显著高于空白对照组。(2)对于NaBu处理组，胚胎2-细胞时期体外胚胎HDAC1 mRNA、Pou5f1和Sox2mRNA水平显著升高(P＜0.05)。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 文献综述

1．1 卵母细胞发育

1．2 表观遗传概述

1．2．1 DNA甲基化

1．2．2 组蛋白修饰与组蛋白密码

1．2．3 组蛋白甲基化

1．2．4 组蛋白乙酰化

1．2．5 组蛋白磷酸化

1．3 研究目的与意义

第二章 组蛋白去乙酰化酶抑制剂丁酸钠对小鼠卵母细胞减数分裂的影响

2 材料和实验方法

2．1 实验动物

2．2 实验主要仪器

2．3 实验器材与药品及配制

2．4 分子生物学软件及引物设计

2．5 实验方法

2．6 实验方案

2．7 实验结果

2．8 讨论

2．9 小结

第三章 小鼠早期胚胎发育过程组蛋白乙酰化模式和组蛋白去乙酰化酶抑制剂丁酸钠对胚胎发育的影响

3 材料与方法

3．1 实验动物

3．2 实验主要仪器

3．3 实验器材与药品试剂

3．4 实验方法

3．5 实验设计

3．6 实验结果

3．7 讨论

3．8 小结

创新与不足

参考文献

致谢