大叶紫金牛叶片的组织培养快速繁殖方法

摘要

本发明公开了一种大叶紫金牛叶片的组织培养快速繁殖方法，包括如下步骤：A、获取无菌外植体；B、获取无菌试管苗；C、增殖培养，增殖培养基为MS+30g/L蔗糖+3.5g/L琼脂+1g/L活性炭+0.5‑2.0mg/L6‑苄基腺嘌呤+0.3‑0.5mg/L灵发素+0.2‑0.8mg·L吲哚丁酸；D、生根培养，生根培养基为1/2MS+30g/L蔗糖+3.5g/L琼脂+1g/L活性炭+0.1‑1.0mg/L多效唑+0.1‑0.3mg/L吲哚丁酸+1.0‑2.0mg/L萘乙酸；E、炼苗与移栽。本发明具有外植体取材方便、操作步骤简单、培养时间短、增殖系数高和种苗质量好等优点。

说明书

技术领域

本发明涉及植物组织培养领域。更具体地说，本发明涉及一种大叶紫金牛叶片的组织培养快速繁殖方法。

背景技术

大叶紫金牛(Ardisia gigantifolia Stapf)又名走马胎、走马风，为紫金牛科紫金牛属植物，是民间常用的跌打损伤药。以根或全株入药，性温，味苦、微辛，具有祛风壮骨、活血化瘀、消肿止痛、止血生肌等功效，可治疗类风湿关节炎、筋骨疼痛、跌打损伤、产后瘀血、半身不遂、痈疽溃疡等。现代研究表明，大叶紫金牛富含三萜皂苷类、岩白菜素衍生物类、挥发油类等化合物，其中三萜皂苷类成分对多种肿瘤细胞活性都具有较强的抑制作用。大叶紫金牛是一种药食两用植物，人们在蒸炖食物时经常放入大叶紫金牛的根茎一起煮，可起到强身健体、提高免疫力的作用。此外，用大叶紫金牛的叶片煮水泡脚、洗澡等，还可去除疲劳和体内湿气。

近年来，大叶紫金牛的市场价格不断攀升，一株长有胎盘的大叶紫金牛植株能卖到150-200元。在巨大利益的驱动下，野生资源遭到过度采挖，濒临枯竭。因此，为了满足市场需求，人工种植势在必行。采用生物技术组织培养技术，可以有效快速地提高大叶紫金牛种苗的繁殖速度和质量，以满足生产上的需要。申请号为201510065908.5的中国专利“一种利用走马胎幼芽胚轴快速繁殖其种苗的方法”和申请号为201510522310.4的中国专利“一种走马胎愈伤组织诱导及组培苗快繁方法”公开了直接或间接利用大叶紫金牛的种子作为外植体进行组织培养的方法，然而，经科技人员多年研究发现，大叶紫金牛开花座果率不到5％，多数情况下得不到种子，好不容易得到的种子也要经过漫长的时间才能萌发，故上述2种方法均存在外植体取材困难的问题，严重阻碍了大叶紫金牛组培苗在人工栽培中的应用。申请号为201610266120.5的中国专利“一种利用走马胎叶片快速繁殖种苗的方法”，公开了利用走马胎叶片进行组织培养获得种苗的方法，但其存在转接次数多，步骤比较繁琐，获得大田移栽苗的时间长等问题。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种大叶紫金牛叶片的组织培养快速繁殖方法，其实现了大叶紫金牛组织培养外植体取材时间的周年性，且操作步骤简单，能够快速繁殖出大量适合大田移栽的大叶紫金牛优良种苗，有效提高了大叶紫金牛的种苗质量和增殖系数。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种大叶紫金牛叶片的组织培养快速繁殖方法，包括如下步骤：

A、选择抽出新叶数量较多的大叶紫金牛单株，从中选择叶龄9-10天的新叶，截取茎尖部位的幼嫩叶片，经消毒处理后，切成0.8-1.0cm的小段，获得无菌外植体；

B、将步骤A得到的无菌外植体接种到诱导培养基中，在培养温度24-26℃，光照强度1500lux，光照时间10-12h/d的条件下培养25d，获到无菌试管苗；

C、将步骤B中得到的无菌试管苗切成1.0-2.0cm的小段，并接种到增殖培养基中，在培养温度24-26℃，光照强度1500lux，光照时间10-12h/d的条件下培养30d，获得不定芽，其中，所述增殖培养基是以MS为基本培养基，并添加30g/L蔗糖、3.5g/L琼脂、1g/L活性炭、0.5-2.0mg/L的6-苄基腺嘌呤、0.3-0.5mg/L的灵发素和0.2-0.8mg·L的吲哚丁酸，pH值为5.8；

D、将步骤C中得到的不定芽切成带顶芽或叶芽的茎段，并接种到生根培养基中，在培养温度24-26℃，光照强度1500lux，光照时间为10-12h/d的条件下培养30d，得到完整的带根苗，其中，所述生根培养基是以1/2MS为基本培养基，并添加30g/L蔗糖、3.5g/L琼脂、1g/L活性炭、0.1-1.0mg/L的多效唑、0.1-0.3mg/L的吲哚丁酸和1.0-2.0mg/L的萘乙酸，培养基pH值为5.8；

E、在室温为23-25℃的室内将步骤D得到的带根苗的瓶盖打开，并在瓶中加入少量炼苗液淹没所述生根培养基，炼苗3-5d后，用镊子将带根苗取出，洗净根部培养基，并移栽到育苗大棚内的育苗基质中继续培养40d，得大田移栽苗。

优选的是，所述的大叶紫金牛叶片的组织培养快速繁殖方法，步骤A中，所述消毒处理是将截取的茎尖部位的幼嫩叶片置于质量百分数为0.05％洗洁精水溶液浸泡5min，经流水冲洗15min，再移置于超净工作台上，用添加了2-3滴吐温-20的质量百分数为0.1％升汞消毒8-10min，然后用无菌水冲洗3-5次，并用无菌吸水纸吸干表面水分。

优选的是，所述的大叶紫金牛叶片的组织培养快速繁殖方法，步骤B中，所述诱导培养基是以MS为基本培养基，并添加30g/L蔗糖、3.5g/L琼脂、1.0mg/L的6-苄基腺嘌呤、0.4mg/L激动素和0.1mg/L的萘乙酸，pH值为5.8。

优选的是，所述的大叶紫金牛叶片的组织培养快速繁殖方法，步骤C中，所述增殖培养基是以MS为基本培养基，并添加30g/L蔗糖、3.5g/L琼脂、1g/L活性炭、1.0mg/L的6-苄基腺嘌呤、0.4mg/L的灵发素和0.8mg·L的吲哚丁酸，pH值为5.8。

优选的是，所述的大叶紫金牛叶片的组织培养快速繁殖方法，步骤D中，所述生根培养基是以1/2MS为基本培养基，并添加30g/L蔗糖、3.5g/L琼脂、1g/L活性炭、1.0mg/L的多效唑、0.3mg/L的吲哚丁酸和1.5mg/L的萘乙酸，培养基pH值为5.8。

优选的是，所述的大叶紫金牛叶片的组织培养快速繁殖方法，步骤E中，所述炼苗液的制备方法为：将6.0-8.0mg的纳米氧化锌加入1L的磁化水中，初混后，将其置于200的高斯磁场中磁化处理8h，即得。

优选的是，所述的大叶紫金牛叶片的组织培养快速繁殖方法，步骤E中，所述育苗基质由泥炭土和细河沙按照重量比3:1混合制得；培养条件为：培养温度25-30℃，相对湿度为85-95％，遮光度60-75％。

本发明至少包括以下有益效果：

第一、采用生物技术对大叶紫金牛叶片进行组织培养快速繁殖，既解决了以种子为外植体时取材困难的问题，又保持了原有品种的优良性状，且操作步骤简单，仅需128-130天即可培育出大量可供大田栽培的大叶紫金牛幼苗，有效降低了培养成本，提高了大叶紫金牛组培种苗的生产效率；

第二、在诱导培养基中添加6-苄基腺嘌呤、激动素和萘乙酸，能够诱导不定芽萌发；在增殖培养基中添加6-苄基腺嘌呤、灵发素和吲哚丁酸可促进不定芽的分化和生长；在生根培养基中添加多效唑、吲哚丁酸和萘乙酸可促进生根，获得完整的带根苗；

第三、通过向炼苗液中添加纳米氧化锌并经磁化处理，可有效提高带根苗的抗逆性，提高移栽成活率；

第四、本发明的方法显著提高了大叶紫金牛的种苗质量和增殖系数，增殖系数高达12倍，生根率高达91.79％，有效地解决了大叶紫金牛的规模化育苗问题，适用于工厂化生产，满足生产上的需要。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

需要说明的是，下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1：

一种大叶紫金牛叶片的组织培养快速繁殖方法，包括如下步骤：

A、选择抽出新叶数量较多的大叶紫金牛单株，从中选择叶龄9-10天的新叶，截取茎尖部位的幼嫩叶片，放置于烧杯中，用质量百分数为0.05％洗洁精水溶液浸泡5min，浸泡过程中用毛笔轻轻清洗叶片表面污垢，再经流水冲洗15min，移置于超净工作台上，用添加了2-3滴吐温-20的质量百分数为0.1％升汞消毒8-10min，然后用无菌水冲洗3-5次，再用无菌吸水纸吸干表面水分，切成0.8-1.0cm的小段，获得无菌外植体；

B、将步骤A得到的无菌外植体接种到诱导培养基中，在培养温度24-26℃，光照强度1500lux，光照时间10-12h/d的条件下培养25d，获到无菌试管苗，其中，所述诱导培养基是以MS为基本培养基，并添加30g/L蔗糖、3.5g/L琼脂、1.0mg/L的6-苄基腺嘌呤、0.4mg/L激动素和0.1mg/L的萘乙酸，pH值为5.8；

C、将步骤B中得到的无菌试管苗切成1.0-2.0cm的小段，并接种到增殖培养基中，在培养温度24-26℃，光照强度1500lux，光照时间10-12h/d的条件下培养30d，获得不定芽，其中，所述增殖培养基是以MS为基本培养基，并添加30g/L蔗糖、3.5g/L琼脂、1g/L活性炭、0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤、0.3mg/L的灵发素和0.2mg·L的吲哚丁酸，pH值为5.8；

D、将步骤C中得到的不定芽切成带顶芽或叶芽的茎段，并接种到生根培养基中，在培养温度24-26℃，光照强度1500lux，光照时间为10-12h/d的条件下培养30d，得到完整的带根苗，其中，所述生根培养基是以1/2MS为基本培养基，并添加30g/L蔗糖、3.5g/L琼脂、1g/L活性炭、0.1mg/L的多效唑、0.1mg/L的吲哚丁酸和1.0mg/L的萘乙酸，培养基pH值为5.8；

E、在室温为23-25℃的室内将步骤D得到的带根苗的瓶盖打开，并在瓶中加入少量炼苗液淹没所述生根培养基，炼苗3-5d后，用镊子将带根苗取出，洗净根部培养基，并移栽到育苗大棚内的育苗基质中继续培养40d，得大田移栽苗，其中，所述炼苗液为自来水，所述育苗基质由泥炭土和细河沙按照重量比3:1混合制得，培养条件为：培养温度25-30℃，相对湿度为85-95％，遮光度60-75％。

经统计，本实施例的芽增殖系数为5.86，生根率为80.28％，移栽到育苗基质中的成活率为91.83％。

实施例2：

在实施例1的基础上，所述增殖培养基是以MS为基本培养基，并添加30g/L蔗糖、3.5g/L琼脂、1g/L活性炭、0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤、0.4mg/L的灵发素和0.4mg·L的吲哚丁酸，pH值为5.8；所述生根培养基是以1/2MS为基本培养基，并添加30g/L蔗糖、3.5g/L琼脂、1g/L活性炭、0.1mg/L的多效唑、0.2mg/L的吲哚丁酸和1.5mg/L的萘乙酸，培养基pH值为5.8；其余操作同实施例1。经统计，本实施例的芽增殖系数为6.25，生根率为86.16％，移栽到育苗基质中的成活率为91.95％。

实施例3：

在实施例1的基础上，所述增殖培养基是以MS为基本培养基，并添加30g/L蔗糖、3.5g/L琼脂、1g/L活性炭、0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤、0.5mg/L的灵发素和0.8mg·L的吲哚丁酸，pH值为5.8；所述生根培养基是以1/2MS为基本培养基，并添加30g/L蔗糖、3.5g/L琼脂、1g/L活性炭、0.1mg/L的多效唑、0.3mg/L的吲哚丁酸和2.0mg/L的萘乙酸，培养基pH值为5.8；其余操作同实施例1。经统计，本实施例的芽增殖系数为6.37，生根率为86.16％，移栽到育苗基质中的成活率为91.79％。

实施例4：

在实施例1的基础上，所述增殖培养基是以MS为基本培养基，并添加30g/L蔗糖、3.5g/L琼脂、1g/L活性炭、1.0mg/L的6-苄基腺嘌呤、0.3mg/L的灵发素和0.4mg·L的吲哚丁酸，pH值为5.8；所述生根培养基是以1/2MS为基本培养基，并添加30g/L蔗糖、3.5g/L琼脂、1g/L活性炭、0.5mg/L的多效唑、0.1mg/L的吲哚丁酸和1.5mg/L的萘乙酸，培养基pH值为5.8；其余操作同实施例1。经统计，本实施例的芽增殖系数为9.80，生根率为79.03％，移栽到育苗基质中的成活率为92.25％。

实施例5：

在实施例1的基础上，所述增殖培养基是以MS为基本培养基，并添加30g/L蔗糖、3.5g/L琼脂、1g/L活性炭、1.0mg/L的6-苄基腺嘌呤、0.4mg/L的灵发素和0.8mg·L的吲哚丁酸，pH值为5.8；所述生根培养基是以1/2MS为基本培养基，并添加30g/L蔗糖、3.5g/L琼脂、1g/L活性炭、0.5mg/L的多效唑、0.2mg/L的吲哚丁酸和2.0mg/L的萘乙酸，培养基pH值为5.8；其余操作同实施例1。经统计，本实施例的芽增殖系数为12.03，生根率为84.32％，移栽到育苗基质中的成活率为92.11％。

实施例6：

在实施例1的基础上，所述增殖培养基是以MS为基本培养基，并添加30g/L蔗糖、3.5g/L琼脂、1g/L活性炭、1.0mg/L的6-苄基腺嘌呤、0.5mg/L的灵发素和0.2mg·L的吲哚丁酸，pH值为5.8；所述生根培养基是以1/2MS为基本培养基，并添加30g/L蔗糖、3.5g/L琼脂、1g/L活性炭、0.5mg/L的多效唑、0.3mg/L的吲哚丁酸和1.0mg/L的萘乙酸，培养基pH值为5.8；其余操作同实施例1。经统计，本实施例的芽增殖系数为10.49，生根率为85.46％，移栽到育苗基质中的成活率为92.28％。

实施例7：

在实施例1的基础上，所述增殖培养基是以MS为基本培养基，并添加30g/L蔗糖、3.5g/L琼脂、1g/L活性炭、2.0mg/L的6-苄基腺嘌呤、0.3mg/L的灵发素和0.8mg·L的吲哚丁酸，pH值为5.8；所述生根培养基是以1/2MS为基本培养基，并添加30g/L蔗糖、3.5g/L琼脂、1g/L活性炭、1.0mg/L的多效唑、0.1mg/L的吲哚丁酸和2.0mg/L的萘乙酸，培养基pH值为5.8；其余操作同实施例1。经统计，本实施例的芽增殖系数为8.34，生根率为89.65％，移栽到育苗基质中的成活率为91.99％。

实施例8：

在实施例1的基础上，所述增殖培养基是以MS为基本培养基，并添加30g/L蔗糖、3.5g/L琼脂、1g/L活性炭、2.0mg/L的6-苄基腺嘌呤、0.4mg/L的灵发素和0.2mg·L的吲哚丁酸，pH值为5.8；所述生根培养基是以1/2MS为基本培养基，并添加30g/L蔗糖、3.5g/L琼脂、1g/L活性炭、1.0mg/L的多效唑、0.2mg/L的吲哚丁酸和1.0mg/L的萘乙酸，培养基pH值为5.8；其余操作同实施例1。经统计，本实施例的芽增殖系数为9.18，生根率为90.15％，移栽到育苗基质中的成活率为92.41％。

实施例9：

在实施例1的基础上，所述增殖培养基是以MS为基本培养基，并添加30g/L蔗糖、3.5g/L琼脂、1g/L活性炭、2.0mg/L的6-苄基腺嘌呤、0.5mg/L的灵发素和0.4mg·L的吲哚丁酸，pH值为5.8；所述生根培养基是以1/2MS为基本培养基，并添加30g/L蔗糖、3.5g/L琼脂、1g/L活性炭、1.0mg/L的多效唑、0.3mg/L的吲哚丁酸和1.5mg/L的萘乙酸，培养基pH值为5.8；其余操作同实施例1。经统计，本实施例的芽增殖系数为7.36，生根率为91.79％，移栽到育苗基质中的成活率为92.56％。

对实施例1-9进行数据分析，发现6-苄基腺嘌呤和灵发素对大叶紫金牛的增殖系数具有显著影响，根据芽增殖系数确定的最佳培养基激素浓度为1.0mg/L的6-苄基腺嘌呤、0.4mg/L的灵发素和0.8mg/L的吲哚丁酸，此时芽增殖系数高达12.03；多效唑对大叶紫金牛组培苗的生根率具有显著影响，根据生根率确定的最佳培养基激素浓度为1.0mg/L的多效唑、0.3mg/L的吲哚丁酸和1.5mg/L的萘乙酸，此时生根率高达91.79％。

实施例10：

在实施例1的基础上，所述炼苗液的制备方法为：将6.0mg的纳米氧化锌加入1L的磁化水中，初混后，将其置于200的高斯磁场中磁化处理8h，即得，其余操作同实施例1。经统计，本实施例的芽增殖系数为5.79，生根率为80.73％，移栽到育苗基质中的成活率为96.45％。

实施例11：

在实施例1的基础上，所述炼苗液的制备方法为：将7.0mg的纳米氧化锌加入1L的磁化水中，初混后，将其置于200的高斯磁场中磁化处理8h，即得，其余操作同实施例1。经统计，本实施例的芽增殖系数为5.87，生根率为80.58％，移栽到育苗基质中的成活率为99.14％。

实施例12：

在实施例1的基础上，所述炼苗液的制备方法为：将8.0mg的纳米氧化锌加入1L的磁化水中，初混后，将其置于200的高斯磁场中磁化处理8h，即得，其余操作同实施例1。经统计，本实施例的芽增殖系数为5.84，生根率为80.26％，移栽到育苗基质中的成活率为93.79％。

实施例13：

在实施例1的基础上，所述炼苗液的制备方法为：将5.0mg的纳米氧化锌加入1L的磁化水中，初混后，将其置于200的高斯磁场中磁化处理8h，即得，其余操作同实施例1。经统计，本实施例的芽增殖系数为5.82，生根率为80.33％，移栽到育苗基质中的成活率为91.67％。

实施例14：

在实施例1的基础上，所述炼苗液的制备方法为：将9.0mg的纳米氧化锌加入1L的磁化水中，初混后，将其置于200的高斯磁场中磁化处理8h，即得，其余操作同实施例1。经统计，本实施例的芽增殖系数为5.89，生根率为80.35％，移栽到育苗基质中的成活率为88.23％。

对实施例1-9进行数据分析，发现炼苗液对大叶紫金牛移栽到育苗基质中的成活率有显著性影响，纳米氧化锌的适宜添加量为6.0-8.0mg，最佳添加量为7.0mg，此时，成活率高达99.14％，纳米氧化锌添加量过高反而会降低大叶紫金牛的成活率。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。