一株分泌抗奥美普林单克隆抗体的杂交瘤细胞株SS20及其应用

摘要

一株分泌抗奥美普林单克隆抗体的杂交瘤细胞株SS20及其应用，属于免疫化学技术领域。本发明通过常规的细胞融合技术制备了一株鼠源的单克隆细胞株SS20，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.14685。该细胞株分泌的单克隆抗体采用间接竞争酶联免疫法测定，对奥美普林的IC

说明书

技术领域

本发明涉及一株鼠源的杂交瘤细胞株SS20及其分泌的能识别奥美普林的单克隆抗体，可用于食品中奥美普林残留的检测，属于免疫化学技术领域。

背景技术

奥美普林是一种磺胺抗菌增效剂，在分类上属于二氨基嘧啶类化学合成抗菌药，广泛用于畜牧和水产养殖业。其对球虫病有显著的抗菌活性。奥美普林不仅对磺胺类抗生素的抗菌活性有增强作用，对氨基糖苷类、喹诺酮类、β-内酰胺类抗生素的抗菌活性也有增强作用。

在中国，增效剂也可以单独用来治疗动物感染的疾病。这类药物通常被当作饲料添加剂使用，并且由于这些药物的物理和化学性质都比较稳定，所以导致了这些药物在养殖业中的滥用。如果动物没过休药期就被宰杀，这些药物就会通过食物链在人体内富集，从而导致耐药菌的出现。目前国内外对于奥美普林在动物性食品中残留量的限量标准还没有相关规定。但是对于畜牧业和水产养殖业中奥美普林使用的监管，以及对动物性食品中奥美普林的残留量检测并进行监督十分重要。

目前，报道的对于奥美普林的检测仅有高效液相色谱法。这种方法的检测灵敏度好，特异性好。但是该方法有很多缺点：需要昂贵的仪器设备、样本前处理麻烦、检测时间长等等。酶联免疫分析方法（ELISA）是一种基于单克隆抗体的快速并且灵敏的高通量检测方法，对于食品中的药物残留检测具有重要意义。目前没有关于抗奥美普林单克隆抗体的报道。

发明内容

本发明的目的是开发针对奥美普林的单克隆抗体，并在此基础上建立ELISA方法。此发明内容包括两个方面：单克隆抗体的制备和其应用。

抗奥美普林单克隆抗体是通过给小鼠免疫奥美普林免疫原获得。免疫原和包被原都是通过戊二醛方法合成。第五次免疫后，筛选血清阳性高抑制好的小鼠取脾脏，将脾细胞与Sp2/0瘤细胞融合。融合后用间接ELISA方法检测细胞上清，筛选阳性高且对奥美普林抑制好的细胞进行亚克隆，进行三次亚克隆后获得纯的细胞株。将细胞株扩大培养后注射进打过石蜡油的小鼠的腹腔内制备腹水，获得的腹水用辛酸-硫酸铵方法进行纯化。测定单克隆抗体对奥美普林的半数抑制浓度(IC₅₀),以及对其结构类似物的IC₅₀,>

本发明的技术方案：一株分泌抗奥美普林单克隆抗体的杂交瘤细胞株SS20,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14685。

抗奥美普林单克隆抗体，由所述保藏编号为CGMCC No.14685的杂交瘤细胞SS20分泌产生，其IC₅₀为48.95>

所述的抗奥美普林单克隆抗体的应用，用于对食品中奥美普林的残留检测。

对牛奶和蜂蜜中奥美普林的残留检测。

本发明的有益效果：采用间接竞争ELISA测定细胞株SS20分泌的单克隆抗体，对奥美普林的其IC₅₀为48.95>

生物材料样品保藏：单克隆细胞株SS20，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.14685，保藏日期2017年9月5日。

附图说明

图1 SS20分泌的单克隆抗体对奥美普林的标准抑制曲线。

具体实施方式

本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。

实施例1： 免疫原和包被原合成

免疫原和包被原均通过戊二醛方法合成：2.76mg 奥美普林溶解于0.3 mL N,N-二甲基甲酰胺溶液中，加入5.76 μL 25%戊二醛水溶液，室温下活化30min。10 mg 血蓝蛋白溶于2mL 0.01 M PBS中，将活化好的奥美普林缓慢滴加入蛋白溶液中，室温反应4h。反应结束后，反应物用0.01M PBS 溶液透析三天，得到的免疫原分装保存在-20℃。包被原的合成与免疫原的合成方法相同，将血蓝蛋白换成卵清白蛋白即可。

实施例 2：小鼠免疫

免疫原用生理盐水稀释到合适的浓度，再与等体积的弗氏完全佐剂乳化，在6-8周龄的BALB/c小鼠的背上进行多点注射。首次免疫用的是弗氏完全佐剂，免疫剂量为100μg。后面的加强免疫中，免疫原与弗氏不完全佐剂乳化，免疫剂量为50μg，免疫间隔为21天。第三次免疫后，通过小鼠的尾静脉采血，并通过间接ELISA来检测血清。第五次免疫后筛选效价高抑制好的小鼠进行腹腔冲刺免疫，三天以后取出小鼠脾脏进行细胞融合。

实施例3：细胞融合与筛选

小鼠脾细胞和瘤细胞在PEG 1500的作用下融合形成杂交瘤细胞，并用选择培养基过滤掉未融合上的瘤细胞。融合后第7天进行检测，筛选效价高且对奥美普林抑制好的细胞株进行亚克隆，以此类推，进行3次亚克隆获得纯的细胞株。

实施例4：单克隆抗体的纯化

筛选出的细胞株扩大培养后，注射进已经打过石蜡油的小鼠腹腔内，7到14天后可以从小鼠腹腔抽取腹水。腹水用辛酸-硫酸铵方法进行纯化获得抗体，抗体分装储存在-20℃。

实施例5：单克隆抗体的性质

抗体的灵敏度和特异性通过间接ELISA来测定。

1、单克隆抗体的交叉反应率

首先通过棋盘法确定包被抗原和单克隆抗体反应的最佳浓度。再用间接ELISA 方法测定单克隆抗体的交叉反应率。具体步骤为：将包被原用0.05M pH 9.6 碳酸盐缓冲液稀释，100 μL/孔，37℃反应2h。将板内溶液倾去，甩干，并用洗涤液PBST洗涤3次，每次3min。拍干后，加入200μL/孔封闭液，37℃反应2h。洗涤后烘干备用。酶标板的每孔里加入50μL标准物溶液和50μL抗体，在37℃下培养30 min后洗涤3次后拍干，每孔加入1︰3000稀释二抗100μL，在37℃下培养30 min后洗涤4次后拍干，加入已配制好的TMB显色液100μL，37℃培养15min，最后每孔加入50μL 2M硫酸溶液终止反应。用酶标仪测定在450nm处的吸光值。

测定了单克隆抗体对其他增效剂的IC₅₀：甲氧苄啶、二甲氧苄啶和巴喹普林。交叉反应率为类似物的IC₅₀与奥美普林IC₅₀的比值。其交叉实验结果如表1所示。

表1. 单克隆抗体SS20的交叉

2、添加回收实验

向阴性牛奶及蜂蜜中分别添加不同浓度的奥美普林，间接竞争ELISA 来测定添加样本中的目标物浓度。牛奶样本稀释5倍，蜂蜜样本稀释10倍来排除基质干扰，计算回收率。添加回收实验结果见表2。

表2. 添加回收实验

溶液配制：

碳酸盐缓冲液（CBS）：称取Na₂CO₃>3>

磷酸盐缓冲液（PBS）：8.00 g NaCl，0.2g KCl，0.2 g KH₂PO₄，2.9>2HPO₄·12>2O，溶于800>

PBST：含0.05% 吐温 20的PBS；

TMB显色液：A液：Na₂HPO₄·12H₂O>

综上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用来限定本发明的实施范围。即凡依本发明申请范围的内容所作的等效变化与修饰，都应为本发明的技术范畴。