猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型、美洲型双重微滴数字PCR绝对定量检测试剂盒

摘要

本发明公开了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型、美洲型双重微滴数字PCR绝对定量检测试剂盒。本发明提供了的引物探针组合由LV‑F1R1P1和VR2332‑F1R1P1组成；LV‑F1R1P1由LV‑F1、LV‑R1和LV‑P1组成；LV‑F1为序列1所示；LV‑R1为序列2所示；LV‑P1如序列3所示；VR2332‑F1R1P1由VR2332‑F1、VR2332‑R1和VR2332‑P1组成；VR2332‑F1为序列4所示；VR2332‑R1为序列5所示；VR2332‑P1如序列6所示。本发明对于猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型和/或猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型的防控具有重大的应用价值，有助于从源头控制疫情、有效预防猪疫病的大规模爆发。

说明书

技术领域

本发明属于病毒检测领域，具体涉及一种猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型、美洲型双重微滴数字PCR绝对定量检测试剂盒。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndromevirus,PRRSV)引起的一种以怀孕母猪繁殖障碍、尤其哺乳仔猪呼吸困难为特征的高度接触性传染病。本病在1987年首次暴发于美国，随后在加拿大、欧洲与亚洲相继出现，目前已经在世界范围内流行，每年造成巨大的经济损失。我国在1995年首次出现PRRS，随后迅速蔓延。2006年在我国全面暴发了体温高、发病率高、死亡率高为主要临床特征的猪“高热病”，而导致该病的病原是较之前在国内流行的经典PRRSV发生变异的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒。目前为止，PRRSV有两种型，即以ATCCVR-2332(VR株)毒株为代表的美洲型和以Lelystadvirus(LV株)为代表的欧洲型，而美洲型又分为两种亚型，经典美洲株和高致病性美洲株，三种亚型毒株在基因序列上存在一定差异。我国国内主要流行的为美洲型毒株，而欧洲株在国内也偶有发现，因此在临床上需要一种能够快速诊断PRRSV的检测方法。

传统的PRRSV检测方法主要包括病毒的分离与鉴定、免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)、间接免疫荧光试验(IFA)和间接酶联免疫吸附试验(间接ELISA)等。目前最常用核酸检测方法有RT-PCR和荧光RT-PCR。传统的PRRSV检测方法存在需要使用高成本仪器设备，试验所需时间较长等不足。RT-PCR和荧光RT-PCR虽然较之以往方法具有特异性更强、灵敏度高、重复性好，且自动化程度高等特点，但是上述方法均只能实现定性和半定量的检测，无法对病毒核酸进行精确定量，在灵敏度和敏感性特异性上仍存在一定的局限性。

数字化PCR(Digital PCR，dPCR)的概念早在1999年就由Bert Vogelstein采用并发表相关文献，其初衷是为了能够从临床样品(如尿液、淋巴液、血浆、粪便等)大量的正常体细胞中检测出微量的突变细胞，但由于当时能用于稀释样品的耗材只是384孔板，因此还不能非常好地体现数字PCR的核心理念——“无限稀释”(terminal dilution)。Bio-Rad公司的QX200系统核心的微滴化技术能够将一份样品分成20,000个纳升级的微滴，本质上将传统定量PCR的一个test变成20,000个test，大大提高了核酸序列检测的灵敏度和精准度，是对“无限稀释”这一概念的完美演绎，其方法原理可称为微滴式数字化PCR(DropletDigital PCR，ddPCR)。QX200ddPCR系统包括两台仪器：微滴发生器和微滴分析仪，及其相关的耗材。微滴发生器将每个样品分成20,000个均匀的纳升级微滴，其中每个微滴或不含待检核酸靶分子，或者含有一个至数个待检核酸靶分子。每个微滴都作为一个独立的PCR反应器。随后微滴转移至96孔PCR板上，开展终点PCR扩增。采用微滴分析仪(droplet reader)逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，最终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，分析软件可计算给出待检靶分子的浓度或拷贝数。与传统的定量PCR相比，数字PCR的精确度和灵敏度更佳。利用微滴式数字PCR技术，研究人员可以检测稀有突变，精确测定拷贝数变异，并对基因表达进行绝对定量。凭借QX200系统的高灵敏度，研究人员如今可检测浓度低至1/1,000,000的靶分子。

发明内容

本发明的目的是提供一种猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型、美洲型双重微滴数字PCR绝对定量检测试剂盒。

本发明提供了一种引物探针组合，由引物探针组LV-F1R1P1和引物探针组VR2332-F1R1P1组成；

所述引物探针组LV-F1R1P1由引物LV-F1、引物LV-R1和探针LV-P1组成；

所述引物LV-F1为如下(a1)或(a2)：

(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；

(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；

所述引物LV-R1为如下(a3)或(a4)：

(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；

(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；

所述探针LV-P1，一个末端具有荧光报告基团，另一个末端具有荧光淬灭基团，核苷酸序列为如下(a5)或(a6)：

(a5)如序列表的序列3所示；

(a6)如将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加所示；

所述引物探针组VR2332-F1R1P1由引物VR2332-F1、引物VR2332-R1和探针VR2332-P1组成；

所述引物VR2332-F1为如下(a1)或(a2)：

(a1)序列表的序列4所示的单链DNA分子；

(a2)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；

所述引物VR2332-R1为如下(a3)或(a4)：

(a3)序列表的序列5所示的单链DNA分子；

(a4)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子；

所述探针VR2332-P1，一个末端具有荧光报告基团，另一个末端具有荧光淬灭基团，核苷酸序列为如下(a5)或(a6)：

(a5)如序列表的序列6所示；

(a6)如将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加所示；

所述探针LV-P1和所述探针VR2332-P1具有不同颜色的荧光报告基团。

具体来说，探针LV-P1探针的5’末端标记荧光基团FAM，3’末端标记荧光淬灭基团BHQ1。

具体来说，探针VR2332-P1的5’末端标记荧光基团HEX，3’末端标记荧光淬灭基团BHQ1。

所述引物探针组合的用途为如下(b1)、(b2)、(b3)、(b4)、(b5)或(b6)：

(b1)鉴定猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型和/或猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型；

(b2)制备用于鉴定猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型和/或猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型的试剂盒；

(b3)检测待测样本是否含有猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型和/或猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型；

(b4)制备用于检测待测样本是否含有猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型和/或猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型的试剂盒；

(b5)检测待测样本中猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型和/或猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型的含量；

(b6)制备用于检测待测样本中猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型和/或猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型含量的试剂盒。

本发明还保护所述引物探针组合的应用，为如下(b1)、(b2)、(b3)、(b4)、(b5)或(b6)：

(b1)鉴定猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型和/或猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型；

(b2)制备用于鉴定猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型和/或猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型的试剂盒；

(b3)检测待测样本是否含有猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型和/或猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型；

(b4)制备用于检测待测样本是否含有猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型和/或猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型的试剂盒；

(b5)检测待测样本中猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型和/或猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型的含量；

(b6)制备用于检测待测样本中猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型和/或猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型含量的试剂盒。

本发明还保护一种试剂盒，包括所述引物探针组合；所述试剂盒的功能为如下(c1)、(c2)或(c3)：(c1)鉴定猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型和/或猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型；(c2)检测待测样本是否含有猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型和/或猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型；(c3)检测待测样本中猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型和/或猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型的含量。

所述试剂盒还包括记载有方法Ⅰ和/或方法Ⅱ的和/或方法Ⅲ的载体。

本发明还保护一种检测待测病毒是否为猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型和/或猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型的方法(方法Ⅰ)，包括如下步骤：以待测病毒的总RNA为模板，采用所述引物探针组合进行数字RT-PCR；如果基于探针LV-P1相应的荧光基团的检测结果为阳性、待测病毒为或候选为猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型，如果基于探针LV-P1相应的荧光基团的检测结果为阴性、待测病毒为或候选为非猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型；如果基于探针VR2332-P1相应的荧光基团的检测结果为阳性、待测病毒为或候选为猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型，如果基于探针VR2332-P1相应的荧光基团的检测结果为阴性、待测病毒为或候选为非猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型。

本发明还保护一种检测待测样本是否含有猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型和/或猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型的方法(方法Ⅱ)，包括如下步骤：以待测样本的总RNA为模板，采用所述引物探针组合进行数字RT-PCR；如果基于探针LV-P1相应的荧光基团的检测结果为阳性、待测样本含有猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型，如果基于探针LV-P1相应的荧光基团的检测结果为阴性、待测样本不含有猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型；如果基于探针VR2332-P1相应的荧光基团的检测结果为阳性、待测样本含有猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型，如果基于探针VR2332-P1相应的荧光基团的检测结果为阴性、待测样本不含有猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型。

本发明还保护一种检测待测样本中猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型和/或猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型的含量的方法(方法Ⅲ)，包括如下步骤：以待测样本的总RNA为模板，采用所述引物探针组合进行数字RT-PCR；根据猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型阳性微滴的数量得到待测样本中猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型的含量，猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型阳性微滴为基于探针LV-P1相应的荧光基团的检测结果为阳性的微滴；根据猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型阳性微滴的数量得到待测样本中猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型的含量，猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型阳性微滴为基于探针VR2332-P1相应的荧光基团的检测结果为阳性的微滴。

所述方法Ⅰ或方法Ⅱ或方法Ⅲ中，所述数字RT-PCR的反应体系中，引物LV-F1的浓度为0.9μM，引物LV-R1的浓度为0.9μM，探针LV-P1的浓度为0.2μM，引物VR2332-F1的浓度为0.9μM，引物VR2332-R1的浓度为0.9μM，探针VR2332-P1的浓度为0.2μM。

所述方法Ⅰ或方法Ⅱ或方法Ⅲ中，所述数字RT-PCR的反应体系可由2×One-stepRT-ddPCR Supermix for probes、引物LV-F1、引物LV-R1、探针LV-P1、引物VR2332-F1、引物VR2332-R1、探针VR2332-P1和模板组成。

所述方法Ⅰ或方法Ⅱ或方法Ⅲ中，所述数字RT-PCR的反应体系可由2×One-stepRT-ddPCR Supermix for probes、引物LV-F1、引物LV-R1、探针LV-P1、引物VR2332-F1、引物VR2332-R1、探针VR2332-P1、模板和RNase Free dH₂O组成。

所述方法Ⅰ或方法Ⅱ或方法Ⅲ中，所述数字RT-PCR的反应程序可为：50℃反转录10min；95℃预变性10min；94℃变性30sec、55℃退火60sec，共40个循环；98℃10min。

所述方法Ⅰ或方法Ⅱ或方法Ⅲ中，所述数字RT-PCR的反应程序中，升降温速度设置为2.5℃/sec。

本发明还保护一种预混液，其中含有引物LV-F1、引物LV-R1、探针LV-P1、引物VR2332-F1、引物VR2332-R1和探针VR2332-P1；所述预混液中，引物LV-F1的浓度为1μM，引物LV-R1的浓度为1μM，探针LV-P1的浓度为2/9μM，引物VR2332-F1的浓度为1μM，引物VR2332-R1的浓度为1μM，探针VR2332-P1的浓度为2/9μM。所述预混液的功能为如下(c1)、(c2)或(c3)：(c1)鉴定猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型和/或猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型；(c2)检测待测样本是否含有猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型和/或猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型；(c3)检测待测样本中猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型和/或猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型的含量。

本发明还保护一种试剂盒，包括所述预混合和微滴发生油。所述试剂盒还包括阴性对照和阳性对照；所述阴性对照为RNase Free dH₂O；所述阳性对照为含有猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型的总RNA和猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型的总RNA的溶液。所述试剂盒的功能为如下(c1)、(c2)或(c3)：(c1)鉴定猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型和/或猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型；(c2)检测待测样本是否含有猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型和/或猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型；(c3)检测待测样本中猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型和/或猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型的含量。

本发明还保护所述预混液或所述试剂盒的应用，为如下(c1)、(c2)或(c3)：(c1)鉴定猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型和/或猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型；(c2)检测待测样本是否含有猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型和/或猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型；(c3)检测待测样本中猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型和/或猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型的含量。

所述试剂盒还包括记载有方法Ⅳ和/或方法Ⅴ和/或方法Ⅵ的载体。

所述方法Ⅳ为一种通过数字RT-PCR检测待测病毒是否为猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型和/或猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型的方法，包括如下步骤：将待测病毒的总RNA或其稀释液作为模板溶液，将2μL模板溶液和18μL所述预混液混合后与70μL微滴发生油同置于微滴生成仪中形成微滴，然后进行RT-PCR扩增，然后在微滴分析仪中进行检测；如果基于探针LV-P1相应的荧光基团的检测结果为阳性、待测病毒为或候选为猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型，如果基于探针LV-P1相应的荧光基团的检测结果为阴性、待测病毒为或候选为非猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型；如果基于探针VR2332-P1相应的荧光基团的检测结果为阳性、待测病毒为或候选为猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型，如果基于探针VR2332-P1相应的荧光基团的检测结果为阴性、待测病毒为或候选为非猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型。

所述方法Ⅴ为一种通过数字RT-PCR检测待测样本是否含有猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型和/或猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型的方法，包括如下步骤：将待测样本的总RNA或其稀释液作为模板溶液，将2μL模板溶液和18μL所述预混液混合后与70μL微滴发生油同置于微滴生成仪中形成微滴，然后进行RT-PCR扩增，然后在微滴分析仪中进行检测；如果基于探针LV-P1相应的荧光基团的检测结果为阳性、待测样本含有猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型，如果基于探针LV-P1相应的荧光基团的检测结果为阴性、待测样本不含有猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型；如果基于探针VR2332-P1相应的荧光基团的检测结果为阳性、待测样本含有猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型，如果基于探针VR2332-P1相应的荧光基团的检测结果为阴性、待测样本不含有猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型。

所述方法Ⅵ为一种通过数字RT-PCR检测待测样本中猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型和/或猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型的含量的方法，包括如下步骤：将待测样本的总RNA或其稀释液作为模板溶液，将2μL模板溶液和18μL所述预混液混合后与70μL微滴发生油同置于微滴生成仪中形成微滴，然后进行RT-PCR扩增，然后在微滴分析仪中进行检测；根据猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型阳性微滴的数量得到待测样本中猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型的含量，猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型阳性微滴为基于探针LV-P1相应的荧光基团的检测结果为阳性的微滴；根据猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型阳性微滴的数量得到待测样本中猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型的含量，猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型阳性微滴为基于探针VR2332-P1相应的荧光基团的检测结果为阳性的微滴。

所述方法Ⅳ或方法Ⅴ或方法Ⅵ中，所述数字RT-PCR的反应程序可为：50℃反转录10min；95℃预变性10min；94℃变性30sec、55℃退火60sec，共40个循环；98℃10min。

所述方法Ⅳ或方法Ⅴ或方法Ⅵ中，所述数字RT-PCR的反应程序中，升降温速度设置为2.5℃/sec。

以上任一所述数字RT-PCR具体可为微滴式数字化RT-PCR。

以上任一所述试剂盒具体可为微滴数字RT-PCR绝对定量检测试剂盒。

以上任一所述数字RT-PCR具体采用QX200Droplet Digital PCR系统。

以上任一所述待测样本可为待测猪组织样本，例如猪肺样本。

以上任一所述待测病毒可为猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒、2型猪圆环病毒、伪狂犬病病毒或猪瘟病毒。以上任一所述猪繁殖与呼吸综合征病毒可为猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型或猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型。以上任一所述猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型具体可为VR-2332毒株。以上任一所述猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型具体可为LV毒株。以上任一所述猪细小病毒具体可为NADL-2毒株。以上任一所述2型猪圆环病毒具体可为08TJ毒株。以上任一所述伪狂犬病病毒具体可为Bartha毒株。以上任一所述猪瘟病毒具体可为C-strain毒株。

本发明的发明人设计并筛选得到了可以鉴定猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型和/或猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型的引物探针组合，并且进一步摸索了引物和探针的浓度，找到了最适的引物和探针的工作浓度，以提高ddPCR的扩增效率。

本发明提供了具有高灵敏度、高特异性、高准确度、高精确度、可实现精确定量的微滴式数字化RT-PCR试剂盒，用于猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型和/或猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型的检测，可直接定量，无需标准曲线、操作简便、结果准确可靠，特别适合现场检测。本发明对于猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型和/或猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型的防控具有重大的应用价值，有助于从源头控制疫情、有效预防猪疫病的大规模爆发。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例中的数字PCR均采用Bio-Rad Laboratories,Inc.的QX200DropletDigital PCR系统(包括两个仪器：QX200微滴生成仪和QX200微滴分析仪)。实施例中所用的热封仪为PX1^TMPCR热封仪，实施例中所用的微滴发生卡为DG8^TM微滴发生卡(8×3)，实施例中所用的底座为发生卡底座，实施例中所用的微滴发生油为微滴发生油(用于探针)，均为Bio-Rad>

实施例中所用的猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型毒株为VR-2332^TM，在GENBANK中的序列号为U87392。实施例中所用的猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型毒株为LV(Lelystad>VR-742^TM，在GENBANK中的序列号为KF913351。实施例中所用的2型猪圆环病毒毒株为08TJ，在GENBANK中的序列号为HQ395021。实施例中所用的伪狂犬病病毒毒株为Bartha，在GENBANK中的序列号为JF797217。实施例中所用的猪瘟病毒毒株为C-strain，在GENBANK中的序列号Z46258。

实施例1、引物及探针的设计与筛选

一、用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型毒株的引物和探针的设计与筛选

通过大量序列获取、分析、比对以及预实验，设计并初步筛选得到四条引物和两条探针，核苷酸序列如下：

LV-F1(序列表的序列1)：5’-GCTGCMGGTTGCYCATACA-3’；

LV-R1(序列表的序列2)：5’-CAATCGHGGCCATTCAC-3’；

LV-P1(序列表的序列3)：5’-TGCGBCTGATTCGCGTDACTTC-3’；。

LV-F2：5’-TGCTGCMGGTTGCTCATAC-3’；

LV-R2：5’-TCAATCGCGKCCATTCA-3’；

LV-P2：5’-CGCMTGATTCGCGTGACTTCTAVATCC-3’。

以上核苷酸序列中，M代表A或C，Y代表C或T，H代表A、T或C，B代表G、T或C，D代表或G、A或T，M代表A或C，K代表G或T，V代表G、A或C。

LV-F1和LV-F2均为上游引物，LV-R1和LV-R2均为下游引物，LV-P1和LV-P2均为探针。LV-P1的5’末端标记荧光基团FAM，3’末端标记荧光淬灭基团BHQ1。LV-P2的5’末端标记荧光基团FAM，3’末端标记荧光淬灭基团BHQ1。

二、用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型毒株的引物探针组的筛选

将步骤一筛选得到的四条引物和两条探针进行随机组合，形成八个引物探针组：由LV-F1、LV-R1和LV-P1组成的引物探针组LV-F1R1P1，由LV-F1、LV-R1和LV-P2组成的引物探针组LV-F1R1P2，由LV-F1、LV-R2和LV-P1组成的引物探针组LV-F1R2P1，由LV-F1、LV-R2和LV-P2组成的引物探针组LV-F1R2P2，由LV-F2、LV-R1和LV-P1组成的引物探针组LV-F2R1P1，由LV-F2、LV-R1和LV-P2组成的引物探针组LV-F2R1P2，由LV-F2、LV-R2和LV-P1组成的引物探针组LV-F2R2P1，由LV-F2、LV-R2和LV-P2组成的引物探针组LV-F2R2P2。

1、取猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型毒株，提取总RNA。

2、以步骤1得到的总RNA为模板，分别采用各个引物探针组进行实时荧光定量RT-PCR。

RT-qPCR的反应体系(20μL)：Probe qPCR dUTP Master Mix 10μL,GoScript RT Mix for 1-step RT-QPCR 0.5μL,10μM上游引物溶液1.2μL，10μM下游引物溶液1.2μL，10μM探针溶液0.6μL，模板2μL，余量为水。

RT-qPCR的反应程序：45℃10min；95℃2min；95℃15s、60℃1min,40个循环。

采用引物探针组LV-F1R1P1进行实时荧光定量RT-PCR，△Rn峰值为1000000。采用另外七个引物探针组进行实时荧光定量RT-PCR，△Rn峰值为300000-500000。采用引物探针组LV-F1R1P1的扩增曲线的信号值最强。

三、用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型毒株的引物和探针的设计与筛选

通过大量序列获取、分析、比对以及预实验，设计并初步筛选得到四条引物和两条探针，核苷酸序列如下：

VR2332-F1(序列表的序列5)：5’-TTAGTYTGCCTACGCWTCATACHGT-3’；

VR2332-R1(序列表的序列6)：5’-TGCYAGCMCATCATSCT-3’；

VR2332-P1(序列表的序列7)：5’-CGYCTGATCHGCGTCRCAGC-3’；

VR2332-F2：5’-TYTAGTTTGCCTACGCATCATACTG-3’；

VR2332-R2：5’-ATGCCAGCHCATCATGCT-3’；

VR2332-P2：5’-ATCCGCGTCACAGCATCACBCTC-3’。

以上核苷酸序列中，Y代表C或T，W代表A或T，H代表A、T或C，M代表A或C，S代表G或C，R代表A或G，B代表G、T或C。

VR2332-F1和VR2332-F2均为上游引物，VR2332-R1和VR2332-R2均为下游引物，VR2332-P1和VR2332-P2均为探针。VR2332-P1的5’末端标记荧光基团HEX，3’末端标记荧光淬灭基团BHQ1。VR2332-P2的5’末端标记荧光基团HEX，3’末端标记荧光淬灭基团BHQ1。

四、用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型毒株的引物探针组的筛选

将步骤一筛选得到的四条引物和两条探针进行随机组合，形成八个引物探针组：由VR2332-F1、VR2332-R1和VR2332-P1组成的引物探针组VR2332-F1R1P1，由VR2332-F1、VR2332-R1和VR2332-P2组成的引物探针组VR2332-F1R1P2，由VR2332-F1、VR2332-R2和VR2332-P1组成的引物探针组VR2332-F1R2P1，由VR2332-F1、VR2332-R2和VR2332-P2组成的引物探针组VR2332-F1R2P2，由VR2332-F2、VR2332-R1和VR2332-P1组成的引物探针组VR2332-F2R1P1，由VR2332-F2、VR2332-R1和VR2332-P2组成的引物探针组VR2332-F2R1P2，由VR2332-F2、VR2332-R2和VR2332-P1组成的引物探针组VR2332-F2R2P1，由VR2332-F2、VR2332-R2和VR2332-P2组成的引物探针组VR2332-F2R2P2。

1、取猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型毒株，提取总RNA。

2、以步骤1得到的总RNA为模板，分别采用各个引物探针组进行实时荧光定量RT-PCR。

RT-qPCR的反应体系(20μL)：Probe qPCR dUTP Master Mix 10μL，GoScript RT Mix for 1-step RT-QPCR 0.5μL，10μM上游引物溶液1.2μL，10μM下游引物溶液1.2μL，10μM探针溶液0.6μL，模板2μL，余量为水。

RT-qPCR的反应程序：45℃10min；95℃2min；95℃15s、60℃1min,40个循环。

采用引物探针组VR2332-F1R1P1进行实时荧光定量RT-PCR，△Rn峰值为1000000。采用另外七个引物探针组进行实时荧光定量RT-PCR，△Rn峰值为300000-500000。采用引物探针组VR2332-F1R1P1的扩增曲线的信号值最强。

实施例2、数字PCR中相关反应参数的优化

一、退火温度的优化

1、取猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型毒株，提取总RNA。

2、取猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型毒株，提取总RNA。

3、将步骤1得到的总RNA和步骤2得到的总RNA等质量混合，得到混合RNA。

4、以步骤3得到的混合RNA为模板，采用引物探针组LV-F1R1P1和引物探针组VR2332-F1R1P1组成的引物组合进行数字RT-PCR。

(1)配制如下体系(20μL)：10μL 2×One-step RT-ddPCR Supermix for probes，1μL LV-F1，1μL LV-R1，0.5μL LV-P1，1μL VR2332-F1，1μL VR2332-R1，0.5μL VR2332-P1，2μL模板，3μL RNase Free dH₂O。体系中，上游引物的浓度为0.5μM，下游引物的浓度为0.5μM，探针的浓度为0.25μM。

(2)取微滴发生卡固定于底座上，中间一排的8个孔内每孔加入20μL步骤(1)配制的体系，底部一排的8个孔内每孔加入70μL微滴发生油，然后将固定有微滴发生卡的底座放置于微滴生成仪中形成微滴(微滴生成于微滴发生卡顶部一排的8个孔内)。

(3)取一个96孔板(命名为96孔板Ⅰ)，完成步骤(2)后，从微滴发生卡顶部一排的8个孔中，每个孔取40μL，以一一对应的方式加入96孔板Ⅰ的8个孔中，用热封仪进行封膜。取一个96孔板(命名为96孔板Ⅱ)，完成步骤(2)后，从微滴发生卡顶部一排的8个孔中，每个孔取40μL，以一一对应的方式加入96孔板Ⅱ的8个孔中，用热封仪进行封膜。取一个96孔板(命名为96孔板Ⅲ)，完成步骤(2)后，从微滴发生卡顶部一排的8个孔中，每个孔取40μL，以一一对应的方式加入96孔板Ⅲ的8个孔中，用热封仪进行封膜。取一个96孔板(命名为96孔板Ⅳ)，完成步骤(2)后，从微滴发生卡顶部一排的8个孔中，每个孔取40μL，以一一对应的方式加入96孔板Ⅳ的8个孔中，用热封仪进行封膜。取一个96孔板(命名为96孔板Ⅴ)，完成步骤(2)后，从微滴发生卡顶部一排的8个孔中，每个孔取40μL，以一一对应的方式加入96孔板Ⅴ的8个孔中，用热封仪进行封膜。取一个96孔板(命名为96孔板Ⅵ)，完成步骤(2)后，从微滴发生卡顶部一排的8个孔中，每个孔取40μL，以一一对应的方式加入96孔板Ⅵ的8个孔中，用热封仪进行封膜。

(4)将完成步骤(3)的各个96孔板置于不同的PCR仪中，进行RT-PCR扩增。

RT-PCR扩增程序：50℃反转录10min；95℃预变性10min；94℃变性30sec、退火60sec，共40个循环；98℃10min。采用的升降温速度设置为2.5℃/sec。

96孔板Ⅰ至96孔板Ⅵ所在的PCR仪，依次设置如下退火温度：52.0℃、54.0℃、55.0℃、56.0℃、58.0℃、60.0℃。

(5)完成步骤(4)后，取96孔板，在微滴分析仪中进行检测，猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型阳性的微滴显示蓝色荧光，猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型阳性的微滴显示绿色荧光。

采用52.0℃的退火温度，每微升模板中，猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型的检测值为1013copies，猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型的检测值为1020copies。采用54.0℃的退火温度，每微升模板中，猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型的检测值为1306copies，猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型的检测值为1298copies。采用55.0℃的退火温度，每微升模板中，猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型的检测值为1325copies，猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型的检测值为1310copies。采用56.0℃的退火温度，每微升模板中，猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型的检测值为1316copies，猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型的检测值为1309copies。采用58.0℃的退火温度，每微升模板中，猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型的检测值为1116copies，猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型的检测值为1108copies。采用60.0℃的退火温度，每微升模板中，猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型的检测值为1145copies，猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型的检测值为1132copies。

采用55.0℃的退火温度，检测值与实际值最接近。

结果表明，退火温度可以选择54-56℃，最优退火温度为55℃。

二、引物、探针浓度的优化

1、取猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型毒株，提取总RNA。

2、取猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型毒株，提取总RNA。

3、将步骤1得到的总RNA和步骤2得到的总RNA等质量混合，得到混合RNA。

4、以步骤3得到的混合RNA为模板，采用引物探针组LV-F1R1P1和引物探针组VR2332-F1R1P1组成的引物组合进行数字RT-PCR。

(1)配制不同体系，具体见表1(表格中的数字为各个组分的加入体积，单位为μL)。用于配制体系的上游引物浓度、下游引物浓度和探针浓度均为10μM。

表1

体系1体系2体系3体系4LV-F10.81.21.61.8LV-R10.81.21.61.8LV-P10.150.250.350.4VR2332-F10.81.21.61.8VR2332-R10.81.21.61.8VR2332-P10.150.250.350.42×One-step RT-ddPCR Supermix for probes10101010RNAse Free dH₂O4.52.70.90模板2222总体积20202020

(2)取微滴发生卡固定于底座上，中间一排的8个孔内每孔加入20μL步骤(1)配制的体系，底部一排的8个孔内每孔加入70μL微滴发生油，然后将固定有微滴发生卡的底座放置于微滴生成仪中形成微滴(微滴生成于微滴发生卡顶部一排的8个孔内)。

(3)取96孔板，完成步骤(2)后，从微滴发生卡顶部一排的8个孔中，每个孔取40μL，以一一对应的方式加入96孔板的8个孔中，用热封仪进行封膜。

(4)将完成步骤(3)的各个96孔板置于不同的PCR仪中，进行RT-PCR扩增。

RT-PCR扩增程序：50℃反转录10min；95℃预变性10min；94℃变性30sec、55℃退火60sec，共40个循环；98℃10min。采用的升降温速度设置为2.5℃/sec。

(5)完成步骤(4)后，取96孔板，在微滴分析仪中进行检测，猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型阳性的微滴显示蓝色荧光，猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型阳性的微滴显示绿色荧光。

采用体系1，每微升模板中，猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型的检测值为3860copies，猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型的检测值为3840copies。采用体系2，每微升模板中，猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型的检测值为3990copies，猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型的检测值为3960copies。采用体系3，每微升模板中，猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型的检测值为4090copies，猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型的检测值为4070copies。采用体系4，每微升模板中，猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型的检测值为4280copies，猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型的检测值为4265copies。

采用体系4，检测值与实际值最接近。

结果表明，反应体系中，最优的引物探针浓度如下：L-F1 0.9μM、LV-R1 0.9μM、LV-P1 0.2μM，VR2332-F1 0.9μM、VR2332-R1 0.9μM、VR2332-P1 0.2μM。

实施例3、试剂盒的制备

一、各个试剂的配制

溶液A为一步法ddPCR探针法预混液。每900μL溶液A的组成如下：500μL 2×One-step RT-ddPCR Supermix for probes，90μL LV-F1溶液(LV-F1溶液中LV-F1的浓度为10μM)，90μL VR2332-F1溶液(VR2332-F1溶液中VR2332-F1的浓度为10μM)，90μL LV-R1溶液(LV-R1溶液中LV-R1的浓度为10μM)，90μL VR2332-R1溶液(VR2332-R1溶液中VR2332-R1的浓度为10μM)，20μL LV-P1溶液(LV-P1溶液中LV-P1的浓度为10μM)，20μL VR2332-P1溶液(VR2332-P1溶液中VR2332-P1的浓度为10μM)。

溶液B为微滴发生油。

溶液C为阳性对照。溶液C的制备方法：提取猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型的总RNA，提取猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型的总RNA，将两种总RNA等质量混合，使然后用Tris-EDTA缓冲液(pH8.0、0.01M)稀释，使两种RNA的浓度均为10000个拷贝数/微升。

溶液D为阴性对照。溶液D为RNase Free dH₂O。

二、微滴数字PCR绝对定量检测试剂盒的组装

试剂盒组成如下：溶液A、溶液B、溶液C、溶液D，分别独立包装。

三、试剂盒的使用方法

待测样本为待测病毒或待测猪组织，猪组织具体可为猪肺。

1、提取待测样本的总RNA，将总RNA或其稀释液作为模板溶液。

2、取18μL溶液A，加入2μL模板溶液。用等体积溶液D代替模板溶液作为阴性对照处理。用等体积溶液C代替模板溶液作为阳性对照处理。

3、取微滴发生卡固定于底座上，中间一排的8个孔内每孔加入20μL步骤2配制的体系，底部一排的8个孔内每孔加入70μL溶液B，然后将固定有微滴发生卡的底座放置于微滴生成仪中形成微滴(微滴生成于微滴发生卡顶部一排的8个孔内)。

4、取96孔板，完成步骤3后，从微滴发生卡顶部一排的8个孔中，每个孔取40μL，以一一对应的方式加入96孔板的8个孔中，用热封仪进行封膜。

5、将完成步骤4的96孔板置于PCR仪中，进行RT-PCR扩增。

RT-PCR扩增程序：50℃反转录10min；95℃预变性10min；94℃变性30sec、55℃退火60sec，共40个循环；98℃10min。采用的升降温速度设置为2.5℃/sec。

6、完成步骤5后，取96孔板，在微滴分析仪中进行检测，猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型阳性的微滴显示蓝色荧光，猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型阳性的微滴显示绿色荧光。

同时满足如下四个条件说明结果可信：①每微升阳性对照中，猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型的检测值为10000±100拷贝数；②每微升阳性对照中，猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型的检测值为10000±100拷贝数；③每微升阴性对照中，猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型的检测值为0；④每微升阴性对照中，猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型的检测值为0。如果模板中检测到猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型阳性的微滴，说明待测样本中含有猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型，可根据阳性微滴数量得到猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型的拷贝数；如果模板中没有检测到猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型阳性的微滴，说明待测样本中不含有猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型。如果模板中检测到猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型阳性的微滴，说明待测样本中含有猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型，可根据阳性微滴数量得到猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型的拷贝数；如果模板中没有检测到猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型阳性的微滴，说明待测样本中不含有猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型。

实施例4、特异性检验

待测样本分别为：3D4/21猪肺细胞株、猪细小病毒、2型猪圆环病毒、伪狂犬病病毒、猪瘟病毒。

采用实施例3制备的试剂盒，按照试剂盒的使用方法进行检测。

各个待测样本均为阴性结果。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国动物疫病预防控制中心

<120> 猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型、美洲型双重微滴数字PCR绝对定量检测试

剂盒

<130> GNCYX171438

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)

<223> m =a or c

<220>

<221> misc_feature

<222> (13)

<223> y =c or t

<400> 1

gctgcmggtt gcycataca 19

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)

<223> h =a t or c

<400> 2

caatcghggc cattcac 17

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)

<223> b =g t or c

<220>

<221> misc_feature

<222> (17)

<223> d =g a or t

<400> 3

tgcgbctgat tcgcgtdact tc 22

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)

<223> y =c or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (16)

<223> w =a or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (23)

<223> h =a t or c

<400> 4

ttagtytgcc tacgcwtcat achgt 25

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)

<223> y =c or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)

<223> m =a or c

<220>

<221> misc_feature

<222> (15)

<223> s =g or c

<400> 5

tgcyagcmca tcatsct 17

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)

<223> y =c or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)

<223> h =a t or c

<220>

<221> misc_feature

<222> (16)

<223> r =a or g

<400> 6

cgyctgatch gcgtcrcagc 20