使用小分子化合物使人成纤维细胞直接转化为神经干细胞的方法

摘要

本发明涉及一种使人成纤维细胞转化成神经干细胞的方法，并且更具体地，涉及一种仅使用小分子化合物的组合而不引入外源基因使人成纤维细胞直接转化成神经干细胞的方法；及其用途。本发明的仅使用小分子物质而不引入基因使人成纤维细胞直接转化成神经干细胞的方法可用于脑疾病的细胞治疗剂，因为其可通过诱导遗传稳定的神经干细胞而确保足够量的用于细胞疗法的细胞，并分化成各种类型功能性神经细胞，并且不引起肿瘤。

说明书

技术领域

本发明涉及一种使人成纤维细胞转化为神经干细胞的方法，并且更具体地，涉及一种仅使用小分子化合物的组合而不引入任何外源基因使人成纤维细胞直接转化为神经干细胞的方法。

背景技术

自从在2007年报道了表明由人成纤维细胞产生诱导性多能干细胞(inducedpluripotent stem cell)的研究，对重编程(reprogramming)的兴趣快速增加。用于以前的干细胞研究的人胚胎干细胞的问题在于，当移植未分化的胚胎干细胞时，它们由于使用人胚胎而引起伦理问题、导致免疫排斥并且形成畸胎瘤(teratoma)。此外，成体干细胞的问题在于，它们难以获得，并且其分化潜力受限制。然而，诱导性多能干细胞避免了伦理问题，并且没有免疫排斥，但是当移植未分化的干细胞时，仍可能导致与畸胎瘤形成有关的问题。尽管诱导性多能干细胞具有与胚胎干细胞相似的性质，但是主要用来形成诱导性多能干细胞的病毒系统可通过基因的随机整合而引起突变。为了克服病毒系统的问题，使用质粒、蛋白质、RNA等，但是它们效率低，并且由于使用致癌基因而可能引起新的问题。

为了克服这种诱导性多能干细胞的问题，已经报道了对使用直接转化法使人成纤维细胞直接转化为所需细胞的研究。其中，积极地进行使用成纤维细胞直接转化为神经细胞来治疗顽固性脑疾病，并且通过已向人成纤维细胞中引入神经元相关转录因子的各种组合，成功产生神经细胞的研究。这些研究表明它们用作针对顽固性脑疾病的细胞治疗剂的潜力，但是难以获得足够量的神经细胞用于细胞疗法，因为神经细胞是已经分化的细胞。

由于这样的问题，近年来，已经研究了使成纤维细胞直接分化为神经干细胞的方法。大多数方法通过使用病毒系统引入各种转录因子而由成纤维细胞诱导神经干细胞，然而，最近，其已经达到能仅使用单一转录因子诱导神经干细胞的水平。神经干细胞是可自我更新的(self-renewable)，并且因此可获得所需的量，并能够分化为神经细胞。此外，在移植后，通过直接转化而从每个个体的成纤维细胞中得到的神经干细胞不会引起伦理问题、不具有免疫排斥并且不诱导肿瘤形成。因此，诱导神经干细胞作为针对顽固性脑疾病的细胞治疗剂是非常有用的。

细胞疗法是移植实验得到的健康细胞来代替人体中受损的细胞和组织的治疗方法。在患者具有由遗传因素引起的疾病的情况下，皮肤细胞可被直接转化为所需细胞，并且所需细胞在其中的异常基因通过基因操作而被正常基因代替之后可以移植。然而，由于以前研究的直接转化法是引入外源基因的方法，通过这些方法获得的细胞实际上难以用作细胞治疗剂。

因此，本发明的发明人做出广泛的努力以使用小分子化合物而不引入任何外源基因由成纤维胞诱导神经干细胞，结果是，已经发现了可产生能够增殖为移植所需的足够量并且是遗传稳定的(基因组DNA稳定性)神经干细胞，而不诱导肿瘤形成，从而完成本发明。

发明内容

技术问题

本发明的目的是提供一种通过在含有小分子化合物的培养基中培养人成纤维细胞而产生神经干细胞作为治疗脑疾病的细胞治疗剂的方法。

技术方案

为实现上述目的，本发明提供一种产生神经干细胞的方法，其包括在含有Thiazovivin、丙戊酸(Valproic acid)、Purmorphamine、A8301、SB431542和CHIR99021的培养基中培养人成纤维细胞的步骤。

本发明还涉及提供一种治疗脑疾病的细胞治疗剂，其含有通过上述方法产生的神经干细胞。

附图说明

图1显示添加13种不同小分子化合物之后观察细胞形态学变化的结果。

图2显示添加13种小分子化合物之后分析基因表达的结果。

图3显示使用4种、6种和8种不同小分子化合物之后观察细胞形态学变化的结果。

图4显示观察成纤维细胞源性神经干细胞的形态学、标志物基因和蛋白质表达的结果。

图5显示在初期阶段和晚期阶段观察成纤维细胞源性神经干细胞的形态学、标志物基因和蛋白质表达的结果。

图6显示通过染色体组型(karyotype)分析来分析成纤维细胞源性神经干细胞的染色体的结果。

图7显示分析成纤维细胞源性神经干细胞的生长速率作为时间函数的结果。

图8显示通过亚硫酸氢盐PCR分析来分析成纤维细胞源性神经干细胞的表观遗传变化的结果。

图9显示检查成纤维细胞源性神经干细胞分化为三种主要类型的神经细胞的结果。

图10显示检查成纤维细胞源性神经干细胞分化为各种类型的神经细胞的结果。

图11显示分析用成纤维细胞源性神经干细胞移植的小鼠大脑的结果。

具体实施方式

除非另有定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。通常，本发明使用的术语和以下将描述的实验方法是本领域中公知和常用的那些。

在本发明中，建立从人成纤维细胞中得到神经干细胞的小分子化合物的最佳组合，并且检查各种小分子化合物中每个的功能。结果是，通过使用含有小分子化合物的组合的培养基从人成纤维细胞得到人神经干细胞，并且获得具有遗传稳定性而无染色体异常的神经干细胞，并且还在很长一段时间内建立生长和保持成纤维细胞源性神经干细胞的最佳培养条件。然后，检查人神经干细胞的基础特征，并且确证人神经干细胞分化为三种主要类型的神经细胞和各种类型的神经细胞的能力。此外，已经发现，在移植后成纤维细胞源性人神经干细胞分化为三种主要类型的神经细胞而无肿瘤形成。此外，已经发现一些小分子化合物调节内胚层特异性基因和中胚层特异性基因的表达，其表明它们具有得到内胚层细胞和中胚层细胞的潜力。

因此，在一方面，本发明涉及一种产生神经干细胞的方法，其包括在含有Thiazovivin、丙戊酸、Purmorphamine、A8301、SB431542和CHIR99021的培养基中培养人成纤维细胞的步骤。

已知用于本发明的“Thiazovivin(N-苄基-2-(嘧啶-4-基氨基)噻唑-4-甲酰胺)”阻断诱导神经细胞和神经干细胞的细胞死亡的Rho/ROCK信号，并且阻断抑制神经干细胞生长的PTEN信号，其表明Thiazovivin可抑制神经干细胞的细胞死亡，并且增加神经干细胞自我更新和生长的能力(Matthias Groszer等,Science 294:2186,2001)。Thiazovivin是选择性抑制ROCK的ROCK(Rho相关激酶)抑制剂。Y27632等也可用于代替Thiazovivin。培养基用Thiazovivin处理以便含有有效浓度的Thiazovivin。在此，有效浓度可根据包括培养基种类和培养方法的本领域中公知的因素而变化。

用于本发明的“丙戊酸(VPA,2-丙基戊酸)”是抑制组蛋白脱乙酰基酶的组蛋白脱乙酰基酶抑制剂，并且已知其诱导高度乙酰化的染色质以促进细胞生长抑制剂和诱导分化所必需的基因的表达，从而诱导细胞(癌细胞)的分化、抑制血管生成、使细胞周期阻滞在G1期中以诱导癌症的凋亡。因此，其表明丙戊酸具有有效的细胞生长抑制性抗癌活性。已知组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)通过pRB/E2F抑制基因转录，并且组蛋白乙酰化的破坏与各种癌变有关。此外，已知HDAC在包括低氧、低葡萄糖水平、细胞癌变的不良环境条件中高度表达，以抑制细胞生长抑制剂的表达，从而促进细胞生长，其表明HDAC在细胞癌变和分化中是一种重要的调节剂。具体地，已知VPA诱导肌醇的减少，抑制GSK-3β、激活ERK通路并刺激PPAR活性。

除了HDAC抑制剂VPA(丙戊酸、2-丙基戊酸)以外，还可使用曲古抑菌素(trichostatin)(TSA)或其衍生物，其中衍生物包括各种药学上可接受的无机盐或有机盐。如果培养基中VPA的浓度过低，那么VPA将几乎无效，并且如果VPA的浓度过高，那么VPA将是有毒的。由于这些原因，培养基中VPA的浓度应当根据细胞的类型来确定。

用于本发明的“Purmorphamine”是一种已知参与Shh信号传导通路的嘌呤化合物。Purmorphamine没有被特别限制，只要其能够诱导Shh信号，并且可使用其各种衍生物。例如，可使用市售的2-(1-萘氧基)-6-(4-吗啉代苯胺基)-9-环己基嘌呤)等。Purmorphamine可包含在一般用于诱导为神经干细胞样细胞的培养基中。当培养基含有作为Shh类似物的Purmorphamine时，优点在于基因不需要被引入到人成纤维细胞中以产生神经干细胞。培养基用Purmorphamine处理以便含有有效浓度的Purmorphamine。在此，有效浓度可根据包括培养基种类和培养方法的本领域中公知的因素而变化。

用于本发明的“A-8301”是结合TGF-βI型受体以干扰TGF-βI型正常信号传导的TGF-βI型受体抑制剂(Tojo M等,Cancer Sci.96:791-800,2005)。TGF-βI型(转化生长因子-βI型)是对细胞增殖、分化和各种类型的细胞具有不同作用的多功能肽。已知该多功能性在各种组织的生长和分化中发挥关键作用，包括脂肪细胞形成、肌细胞形成、骨细胞形成和上皮细胞分化，并且抑制神经干细胞的生长。除了TGF-βI型受体抑制剂A-8301以外，可使用包括SB432542的任一TGF-βI型受体抑制剂。可用于本发明的低分子量物质TGF-βI型受体抑制剂A-8301为市售的或能够制造的。通过抑制剂的处理促进神经干细胞的增殖。用TGF-βI型受体抑制剂A-8301处理培养基以便含有有效浓度的TGF-βI型受体抑制剂A-8301。在此，有效浓度可根据包括培养基种类和培养方法的本领域中公知的因素而变化。

本发明中的“SB432542”是用于诱导快速分化以改善染色体稳定性的ALK5(激活素受体样激酶5)抑制剂。

用于本发明的“CHIR99021”是GSK(糖原合成酶激酶)抑制剂，其靶向作为涉及GSK信号传导通路的上游分子的GSK1/2。CHIR99021是一种氨基嘧啶衍生物。除了CHIR99021之外，可使用任一GSK抑制剂。

在本发明中，培养基进一步优选包含DZNep(去氮腺嘌呤A(Deazaneplanocin A))或5-AZA，但不限于此。此外，培养基进一步优选包含一种或多种选自下组的小分子化合物：PD0325901、抗坏血酸、PS48、毛喉素(forskolin)和反苯环丙胺(tranylcypromine)，但不限于此。

用于本发明的“5-阿扎胞苷(5-Azacitidine,5-AZA)”称为“4-氨基-1-β-D-呋喃核糖基-1,3,5-三嗪-2(1H)-酮”，并且已知具有DNA去甲基化活性。此外，5-阿扎胞苷也被称为对白血病、淋巴瘤和各种实体瘤展现活性的抗肿瘤药。5-阿扎胞苷能够通过一般的化学合成法经合成获得或为市售的(例如，Sigma-Aldrich(St Louis,Mo,USA))。

在本发明中，PD0325901是一种MEK/ERK信号传导通路抑制剂，并且抗坏血酸是一种水溶性维生素，并且具有强抗氧化活性。

在本发明中，毛喉素用于直接激活腺苷酸环化酶的催化亚基以增加细胞内cAMP的浓度，并且反苯环丙胺用于抑制单胺氧化酶(MAO)，其为一种通常在突触裂隙中降解去甲肾上腺素的酶。

在本发明中，培养基包括通常用于培养神经干细胞的任一培养基。用于培养的培养基一般包括碳源、氮源和微量元素组分。培养基优选由DMEM/F12、N2、B27、bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)和EGF(表皮生长因子)制成，但不限于此。

作为本发明中用于培养诱导性神经干细胞的培养基，可使用本领域中已知的任一基础培养基，而没有限制。用于本发明的基础培养基可为合成性基础培养基或市售基础培养基。市售基础培养基的实例包括DMEM(达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(Dulbecco'smodified eagle's medium))、MEM(最小必需培养基)、BME(伊格尔基础培养基(basalmedium eagle))、RPMI 1640、F-10、F-12、α-MEM(α-最小必需培养基)、G-MEM(格拉斯哥氏最小必需培养基(Glasgow's minimal essential medium))和伊思柯夫氏改良达尔伯克氏培养基(Isocove's modified Dulbecco's medium)，但不限于此。市售基础培养基可为DMEM。在本发明的具体实施例中，诱导性神经干细胞在DMEM培养基中培养。

在本发明中，人成纤维细胞的培养期优选10-15天，但不限于此。

本发明的方法进一步优选包括以下步骤：通过传代培养然后悬浮培养所述人成纤维细胞形成球体；和贴壁培养所形成的球体，然后悬浮培养所述贴壁培养的球体。然而，本发明的范围不限于此。悬浮培养和贴壁培养中的每个优选进行7-10天，并且将贴壁培养和悬浮培养的步骤重复进行2至4次，但是本发明的范围不限于此。

在本发明中，“神经干细胞”是具有自我复制能力和分化为神经元和/或神经胶质(例如星形胶质细胞、少突胶质细胞和/或施万细胞(Schwann cell))能力的未分化的细胞。神经干细胞通过分化为特定神经细胞的神经祖细胞或神经胶质祖细胞分化为神经细胞，例如神经元或神经胶质。

在本发明中，神经干细胞可表达巢蛋白(nestin)、sox1或musashi1。神经干细胞可分化为选自下组的一种或多种：星形胶质细胞、少突胶质细胞、神经元、多巴胺能神经元、GABA能神经元、运动神经元和胆碱能神经元，但不限于此。

在本发明中，神经干细胞可保持染色体的稳定性，并且可在未分化的状态中保持10次传代以上，但是本发明的范围不限于此。

将人成纤维细胞直接转化为神经干细胞的大部分方法包括引入参与神经干细胞形成的外源基因。在此，外源基因通过各种方法而引入。具体地，主要用于引入外源基因的方法使用慢病毒(lentiviral)或逆转录病毒(retroviral)载体系统。由于外源基因的随机整合，使用病毒将外源基因引入细胞可能导致基因组不稳定性，并且当将细胞临床施用于患者时可发生癌症。由于此原因，已经建议使用小分子而不引入外源基因的方法。近年来，已经积极地进行聚焦于使用各种小分子化合物诱导直接转化成纤维细胞的研究，然而，因为这些研究使用至少一种基因，所以仍然不可能将人的体细胞转化为所需神经干细胞而不引入外源基因。

然而，本发明的技术是从人成纤维细胞中得到基因稳定的神经干细胞而不引入外源基因的方法，并且已经设计其以克服包括引入外源基因并可诱导肿瘤形成的常规方法的缺点。

根据本发明，人成纤维细胞仅使用小分子化合物的组合直接转化为神经干细胞。因此，本发明克服了在常规技术中出现的许多问题，例如，与使用胚胎干细胞有关的伦理问题、免疫排斥、由使用胚胎干细胞和诱导性多能干细胞而引起的肿瘤形成等，并且因此根据本发明获得的神经干细胞具有用作患者的细胞治疗剂的高潜力。此外，从脑疾病患者的体细胞中直接获得的神经干细胞可用作新的细胞模型以研究由神经细胞的损坏或死亡引起疾病的机理。与诱导性多能干细胞比较，根据所述方法产生的神经干细胞以极快和有成本效益的方式产生。换言之，产生诱导性多能干细胞和使细胞分化为神经细胞所需时间和成本的量比本发明的神经干细胞所需时间和成本的量大至少两倍。

此外，根据本发明的通过交叉分化获得的神经干细胞比成体神经干细胞具有的优点在于，它们不会引起伦理问题，因为它们不需要从胎儿或成人大脑中获得，而且还在于不同于具有限制性自我更新能力的成体干细胞，它们由于其自我更新能力不受限制而可以所需的量产生。此外，因为通过直接转化获得的神经干细胞能够从患者自身的细胞中获得，所以它们没有免疫排斥，可用来产生患者特异性细胞模型，并且还可用来评价所开发药物的患者特异性毒性和开发新药。具体地，因为产生根据本发明的通过直接转化获得的神经干细胞而不使用外源基因，它们避免了由外源基因的随机整合导致的肿瘤形成的风险，并且因此具有被用作细胞治疗剂的高潜力。

因此，在另一方面，本发明涉及治疗脑疾病的细胞治疗剂，其含有通过以下方法产生的神经干细胞，所述方法包括在含有小分子化合物的培养基中培养人成纤维细胞的步骤。

在本发明中，脑肌病可为中风、脑出血、脑梗塞、阿尔茨海默病(Alzheimer'sdisease)、痴呆、亨廷顿病(Huntington's disease)、帕金森病(Parkinson's disease)、多发性硬化、多系统萎缩症、癫痫、皮克病(Pick's disease)或克雅病(Creutzfeldt-Jakobdisease)，但不限于此。

本发明的细胞可临床上用于脑疾病的治疗。当产生来自具有遗传性脑疾病的患者的神经干细胞时，这些细胞可提供脑疾病细胞模型，其可直接用于疾病机理的研究。此外，当细胞中的突变基因通过基因操作而用正常基因代替时，细胞可用作治疗具有遗传性脑肌病的患者的细胞治疗剂。

本文使用的术语“细胞治疗剂”指用于治疗、诊断和预防目的的药物，其含有通过从人中分离、培养和特定操作而制备的细胞或组织(如通过US FDA提供的)。具体地，其指通过体外繁殖和分选活的自体细胞、同种异体细胞和异种细胞，或通过其他方式改变细胞的生物特征以便恢复细胞和组织的功能的一系列行为而用于疾病的治疗、诊断和预防目的的药物。

本文使用的术语“治疗”指由于施用细胞治疗剂而产生疾病症状的改善或疾病的有益改变的任一行为。

本发明的治疗剂可通过任意一般途径施用，只要其可到达所需组织。本发明的细胞治疗剂组合物可肠胃外施用，例如腹膜内、静脉内、肌内、皮下、经皮施用，但不限于此。

细胞治疗剂组合物可使用通常用于细胞治疗的药学上可接受的载体以适当形式配制。当对人施用时，本文使用的术语“药学上可接受的组合物”指生理学上可接受的并且不导致胃疾病、过敏反应(如胃肠道疾病或眩晕)或类似反应的组合物。药学上可接受的载体的实例包括用于肠胃外施用的载体，如水、合适的油、盐水溶液、葡萄糖水溶液和乙二醇。本发明的细胞治疗剂组合物可进一步包含稳定剂和防腐剂。合适的稳定剂包括抗氧化剂，如亚硫酸氢钠、亚硫酸钠和抗坏血酸。合适的防腐剂包括苯扎氯铵、对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯，以及氯丁醇。其他药学上可接受的载体可参见Remington'sPharmaceutical Sciences,19th ed.,Mack Publishing Company,Easton,Pa.,1995。

此外，本发明的细胞治疗剂可通过能够将细胞治疗剂递送到目标细胞中的任一装置来施用。

本发明的细胞治疗剂可包含治疗有效量的用于疾病治疗目的的细胞治疗剂。

本文使用的术语“治疗有效量”是指在组织系统、动物或人中导致生物或医学反应并且由研究人员、兽医、医生或其他临床医生考虑的活性成分或药物组合物的量。治疗有效量包含引起正在治疗的疾病或病症的症状缓解的量。

对本领域技术人员显而易见的是，在本发明的组合物中含有的细胞治疗剂将根据所需效果而变化。因此，本发明的组合物中细胞治疗剂的最佳含量可容易由本领域技术人员确定，并且可根据包括以下的各种因素来调节：疾病的类型和严重性，组合物中含有的其他组分的含量，制剂的类型，患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食，施用时间，施用途径，组合物的分泌速率，治疗的持续时间和同时使用的药物。重要的是，本发明的细胞治疗剂应当含有可展现最大作用而不引起副作用的量的神经干细胞。所述量应当考虑所述因素来确定。例如，本发明的神经干细胞的每日剂量可为1.0×10⁴至1.0×10¹⁰个细胞/kg体重，优选1.0×10⁵至1.0×10⁹个细胞/kg体重，其可每日施用一次或以几次分份施用。然而，应当理解的是，活性成分的实际剂量应当考虑各种相关因素来确定，其包括所治疗的疾病，疾病的严重性，施用的途径和患者的体重、年龄和性别。因此，剂量不以任何方式限制本发明的范围。

此外，在本发明的治疗方法中，本发明的包含细胞治疗剂作为活性成分的组合物可通过直肠内、静脉内、动脉内、腹膜内、肌内、胸骨内、经皮、局部、眼内或皮内途径以常规方式施用。

本发明提供一种治疗脑肌病的方法，其包括对哺乳动物施用治疗有效量的本发明的细胞治疗剂。本文使用的术语“哺乳动物”指作为治疗、观察或实验的对象的哺乳动物，优选人类。

实施例

在下文中，将参考实施例进一步详细描述本发明。对本领域普通技术人员显而易见的是，这些实施例仅用于示例性说明，并不应被解释为限制本发明的范围。

实施例1：小分子化合物及其组合的功能的研究

1-1：小分子化合物的功能的研究

为了使人成纤维细胞转化为神经干细胞，选择性地分选并使用与重编程有关的13种不同的小分子化合物(表1)。

表1

为了研究各小分子化合物的功能并发现小分子化合物的最佳组合，在60mm培养皿中制备1x10⁵个人成纤维细胞，并且在第二天，将细胞在各自补充有13种不同小分子化合物(PD0325901、SB431542、Thiazovivin、抗坏血酸、PS48、CHIR99021、去氮腺嘌呤A、丙戊酸、毛喉素、反苯环丙胺、A8301、5-AZA和Purmorphamine)之一的Neurobasal培养基(含有DMEM/F12、N2、B27、bFGF和EGF)中培养。然后，观察细胞的形态学变化，同时以2-3天的间隔替换培养基(图1)。以5天的间隔传代培养细胞，并在此阶段，取样细胞以便检查其中的基因表达模式(pattern)。在细胞样品中，使用细胞样品，通过定量PCR来分析成纤维性细胞标志物(Thy1)、神经干细胞标志物(巢蛋白、sox1、sox2、pax6)、MET或EMT标志物(snail、N-钙粘蛋白(cadherin)、E-钙粘蛋白)、内胚层和中胚层标志物(AFP、GATA4)以及与保持染色体稳定性相关的标志物(Zsacn4)的表达模式(图2)。

结果是，显示8种不同小分子化合物(Thiazovivin、丙戊酸、Purmorphamine、A8301、SB431542、CHIR99021、去氮腺嘌呤A和5-AZA)明显增加了神经干细胞标志物基因的表达。

1-2：小分子化合物的组合

为了确定产生神经干细胞的最有效条件，通过从含有实施例1-1中鉴定的全部8种不同小分子化合物的培养基中除去各个小分子化合物而获得的各种培养基用来检查成纤维细胞是否将在各个培养基中转化为神经干细胞。简言之，在60mm培养皿中制备1x10⁵个人成纤维细胞，然后观察细胞的形态学变化，同时以2-3天的间隔用下表2中显示的各种培养基的每个替换培养基。此外，取样细胞，同时传代培养，并且分析细胞样品中各种基因的表达模式。

表2

结果是，选择确认增加神经干细胞标志物基因表达的6种小分子化合物(Thiazovivin、丙戊酸、Purmorphamine、A8301、SB431542和CHIR99021)至8种小分子化合物(Thiazovivin、丙戊酸、Purmorphamine、A8301、SB431542、CHIR99021、去氮腺嘌呤A和5-AZA)的组合。因此，发现仅使用6种至8种小分子化合物可将人成纤维细胞转化为神经干细胞。此外，显示尽管它们从相同的人成纤维细胞中产生，但是发现根据其来源在此具有与神经干细胞形态学相似的细胞的时间点确实不同。

实施例2：从人成纤维细胞及其培养物中得到的神经干细胞

为了确定将人成纤维细胞转化为神经干细胞所需的小分子化合物的组合，试图建立稳定获得神经干细胞和培养物的条件。此外，为了检查用其将人成纤维细胞转化为神经干细胞的效率，使用补充有至少4种小分子化合物的培养基进行比较。简言之，制备1x 10⁵个细胞，然后在通过添加4种小分子化合物(Thiazovivin、丙戊酸、Purmorphamine和A8301)、6种小分子化合物(Thiazovivin、丙戊酸、Purmorphamine、A8301、SB431542和CHIR99021)或8种小分子化合物(Thiazovivin、丙戊酸、Purmorphamine、A8301、SB431542、CHIR99021、去氮腺嘌呤A和5-AZA)至含有DMEM/F12、N2、B27、bFGF和EGF的Neurobasal培养基而获得的三种不同培养基中培养。

结果是，观察到在从开始得到细胞后约3天细胞的形态开始缓慢变化。在约7-10天，在补充有4种不同小分子化合物的培养基中，细胞的形态与成纤维细胞的形态没有显著差异，但是在使用6种或8种不同小分子化合物补充的培养基中，形成具有与神经干细胞的相似的形态的细胞。

随后，传代培养细胞，并且使用皮氏培养皿(Petri dish)悬浮培养物，以便改善神经干细胞的性质。悬浮培养物7-10天后，细胞在补充有6种或8种不同小分子化合物的培养基中大部分形成小球体。然而，在补充有4种小分子化合物的培养基中，球体没有适当形成。将所形成的小球体粘附到涂布PLO/FN的培养皿，并进一步培养约7-10天。可见，在此阶段中细胞的形态与神经干细胞的形态更相似(图3)。当重复进行2-4次悬浮培养和贴壁培养时，在补充有6种或8种不同小分子化合物的培养基中细胞的形态更明显地变化。然而，在补充有4种不同小分子化合物的培养基中，尽管重复地培养，但是细胞的形态没有变化。即使当这些细胞使用连续传代培养培养很长一段时间时，由补充有上述6种或8种不同小分子化合物的培养基得到的神经干细胞仍保持神经干细胞的形态。

实施例3：由小分子化合物得到的神经干细胞的特征

检查由补充有6种不同小分子化合物的DMEM/F12+N2B27得到的人神经干细胞是否显示神经干细胞的一般特征。简言之，进行PCR和免疫细胞化学(ICC)染色，以便检查神经干细胞是否将表达神经干细胞标志物。在成纤维细胞源性神经干细胞中，表明表达巢蛋白的神经干细胞的免疫细胞化学(ICC)染色的结果，和表明神经干细胞标志物(巢蛋白、sox1和musashi1)的表达水平的PCR结果与源于人胚胎干细胞的神经干细胞的那些结果相似(图4)。

为了检查在长期培养期间是否将保持成纤维细胞源性神经干细胞的性质，观察每个初期阶段和晚期阶段的细胞形态。此外，巢蛋白的表达通过免疫细胞化学(ICC)染色来分析，并且神经干细胞标志物(巢蛋白、sox1和musashi1)的表达通过PCR来分析(图5)。此外，通过染色体分析来分析在初期阶段和晚期阶段中成纤维细胞源性神经干细胞的染色体是否是异常的(图6)，并且将在生长和培养期间成纤维细胞源性神经干细胞的生长速率与源自人胚胎干细胞的神经干细胞的生长速率比较(图7)。结果是，显示出即使在长期培养期间，成纤维细胞源性神经干细胞仍保持神经干细胞的形态和性质，并且同时在无染色体异常的情况下可连续培养。

随后，为了检查成纤维细胞源性神经干细胞的表观遗传变化通过亚硫酸氢盐PCR来分析神经干细胞标志物巢蛋白的启动子区是否将被甲基化/乙酰化。结果是，可见成纤维细胞的特征完全变成神经干细胞的特征(图8)。

实施例4：检查成纤维细胞源性人神经干细胞的体外分化潜力

实施例1至3的结果表明，通过使用小分子化合物成功实现从成纤维细胞源得到神经干细胞。更具体地，为了检查成纤维细胞源性神经干细胞的特征和用途，检查细胞的体外分化潜力。简言之，将成纤维细胞源性神经干细胞分化为三种主要类型的神经细胞(星形胶质细胞、少突胶质细胞和神经元)。

结果是，显示通过小分子化合物得到的神经干细胞成功分化为三种主要类型的神经细胞(图9)。

随后，检查成纤维细胞源性神经干细胞是否将分化为各种类型的神经细胞。结果是，显示神经干细胞分化为多巴胺能神经元、GABA神经元、运动神经元、胆碱能神经元和谷氨酸神经元(图10)。这表明根据本发明得到的人神经干细胞能够分化为各种类型的神经细胞。

从人成纤维细胞中得到人神经干细胞，神经干细胞的生长和神经干细胞分化为各种功能性神经细胞的潜力，表明人神经干细胞具有被用作治疗人脑疾病的细胞治疗剂的极高潜力。

实施例5：检查成纤维细胞源性人神经干细胞的体内分化潜力

实施例3和4中的体外结果表明，使用小分子化合物从人成纤维细胞中得到的神经干细胞可成功分化为三种主要类型的神经细胞。

因此，为了观察使用小分子化合物从人成纤维细胞中得到的神经干细胞的体内分化潜力和神经干细胞是否将致瘤，将成纤维细胞源性人神经干细胞移植到小鼠(Balb/c,Orient Bio)的大脑中。随后，连续观察使用人神经干细胞移植的小鼠3至7个月。

结果是，3至7个月没有明显观察到使用人神经干细胞移植的小鼠脑中的肿瘤形成(图11A)，并且脑组织的H&E(苏木素和伊红)染色显示未观察到肿瘤形成(图11B)。此外，显示成纤维细胞源性神经干细胞表达神经干细胞标志物，其表明这些细胞被成功移植(图11C)。此外，移植后3至7个月后，观察到成纤维细胞源性神经干细胞表达人细胞特异性标志物和神经细胞特异性标志物，其表明移植的细胞分化为神经细胞(图11D)。这表明在移植后通过小分子化合物得到的人神经干细胞可分化为神经细胞而无肿瘤形成。

因为所述成纤维细胞源性神经干细胞是不致瘤的，因此它们可用作最佳细胞模型以研究神经细胞发展和脑疾病机理，并且具有被用作治疗人脑疾病的细胞治疗剂的极高潜力。

工业实用性

如上所述，使用小分子化合物而不引入外源基因将人成纤维细胞直接转化为神经干细胞的方法使其可获得用于细胞治疗足够量的遗传稳定的神经干细胞。根据本发明的方法获得的神经干细胞可分化为功能性神经细胞并且是不致瘤的。因此，这些神经干细胞可用作治疗脑疾病的细胞治疗剂。

尽管已经参考具体特征详细描述了本发明，对本领域技术人员显而易见的是，这样的描述仅用于优选的实施方案，并且不限制本发明的范围。因此，本发明的实际范围将通过所附权利要求及其等同物来限定。