一种金磁纳米颗粒的制备及其结合表面增强拉曼光谱法快速检测河豚毒素

摘要

本发明提供了一种基于表面增强拉曼光谱的河豚毒素快速检测方法，采用纳米Fe3O4颗粒作为磁性基底，依次用四乙氧基硅烷(TEOS)、3‑氨丙基三乙氧基硅烷、3‑巯丙基三乙氧基硅烷修饰Fe3O4，通过‑NH2的静电吸附和Au‑S键的作用将金纳米颗粒吸附在经修饰后的磁纳米颗粒上，将组装好的金磁纳米颗粒整体用四乙氧基硅烷(TEOS)，3‑氨丙基三乙氧基硅烷修饰，以免疫活性金磁纳米颗粒作为拉曼基底，RhB‑ITC/anti‑TTX为拉曼信号分子，利用表面增强拉曼光谱仪对河豚毒素(TTX)进行快速检测，在外磁体浓缩金磁纳米颗粒的情况下检测限可达到0.01μg/ml，检测线性范围0.01μg/mL～0.5μg/mL，检测的样品回收率82.64％～92.60％，相对标准偏差2.6％～11.1％。河豚毒素的检测在食品安全及医学方面具有重要的意义。

说明书

技术领域

本发明涉及一种金磁纳米颗粒的制备方法，及其在表面增强拉曼光谱快速检测河豚毒素中的应用。

背景技术

河豚毒素(tetrodotoxin，TTX)是鲀鱼类(俗称河豚鱼)及其他生物体内含有的一种生物碱。其分子式为C₁₁H₁₇O₈N₃，分子量为319。为氨基全氢喹唑啉型化合物，是自然界中所发现的毒性最大的神经毒素之一，曾一度被认为是自然界中毒性最强的非蛋白类毒素。0.5mg>

目前河豚毒素的检测方法主要有小白鼠生物法、液相色谱法、薄层色谱法、免疫学方法等。小白鼠生物法虽然能准确、稳定的测出河豚毒素，并且是日本法定的测定TTX含量的方法，但是费时费力，且重复性差，缺乏特异性。而液相色谱法较多的被用于定量检测河豚毒素，但是检测之前需要对样品进行复杂耗时的前处理，不适合现场快速检测。薄层色谱法则操作简单，但灵敏度过低，无法进行定量检测分析。免疫学方法中抗血清制备方法叫简单，但因为单克隆抗体的特异性较差，可能会存在交叉反应所以会对河豚毒素的定量检测有较大影响。

表面增强拉曼散射(Surface-enhanced Raman Spectroscopy， SERS)是一种具有表面选择性的增强效应，在表面科学、分析科学和生物科学等领域得到广泛的应用，从而发展成一种新型的快速分析方法。Fleischmann等人于1974年对光滑银电极表面进行粗糙化处理后，第一次得到吸附在银电极表面上单分子层吡啶分子的拉曼光谱。随后Van等人通过系统实验与计算，发现此信号相比于拉曼散射信号增强约6个数量级，指出这是一种与粗糙表面相关的表面增强效应，被称为SERS效应。表面信号增强10⁶倍相当于表面单层分子放大成为100万层，因为SERS能有效地避免溶液相中相同物种的信号干扰，轻而易举地获取高质量的表面分子信号。

发明内容

本发明目的在于研究制备一种新的Fe₃O₄/SiO₂/Au/SiO₂/NH₂金磁纳米颗粒，该颗粒能在外磁场中快速分离，表面包覆具良好表面增强拉曼散射效应的金纳米颗粒。以该金磁纳米颗粒作为SERS检测的基底，将检测样品快速浓缩，提高检测灵敏度。并利用该金磁纳米颗粒与表面增强拉曼光谱技术快速检测河豚毒素。

本发明采用以下技术方案：

一种Fe₃O₄/SiO₂/Au/SiO₂/NH₂金磁纳米颗粒，其特征在于所述>3O₄/SiO₂/Au/SiO₂/NH₂金磁纳米颗粒按以下方法制备：先以Fe₃O₄纳米颗粒为起始物，加入TEOS在Fe₃O₄表面形成SiO₂外壳，再加入>2外壳表面进行功能化，得到表面带-NH₂和-SH的Fe₃O₄/SiO₂纳米颗粒；同时用柠檬酸钠还原HAuCl₄溶液得到粒径均匀分布的Au纳米颗粒；将Au纳米颗粒加入表面带-NH₂和>3O₄/SiO₂纳米颗粒，通过-NH₂的静电吸附和Au-S键的作用进一步将Au纳米颗粒致密地组装在Fe₃O₄/SiO₂表面，形成具有核壳结构的Fe₃O₄/SiO₂/Au金磁纳米颗粒，再加入TEOS和APTES，最终得到所述的Fe₃O₄/SiO₂/Au/SiO₂/NH₂金磁纳米颗粒。

进一步，本发明所述的Fe₃O₄/SiO₂/Au/SiO₂/NH₂金磁纳米颗粒，具体制备方法包括以下步骤：

(1)表面带-NH₂和-SH的Fe₃O₄/SiO₂纳米颗粒的制备：将Fe₃O₄纳米颗粒用含乙醇、氨水的水溶液A分散，所述含乙醇、氨水的水溶液A中乙醇、氨水与水体积比例为45～55:1:10，所述Fe₃O₄纳米颗粒在所述含乙醇、氨水的水溶液A中质量浓度为0.02％-0.04％，在>2和-SH的Fe₃O₄纳米颗粒，再依次用无水乙醇、水洗涤，最后分散在水中待用；所述TEOS的体积用量以Fe₃O₄纳米颗粒的质量计为>

(2)Au纳米颗粒的制备：将水加热至95～101℃，加入质量分数为3％～6％柠檬酸钠溶液，15～25s后加入10mg/mL～12mg/mL氯金酸水溶液，保持100℃至反应结束后停止加热，搅拌下自然冷却，冷却至室温后离心分离，收集下层颗粒，分散至水中待用；所述柠檬酸钠溶液与水、氯金酸水溶液的体积比为1:500:10～12；

(3)Fe₃O₄/SiO₂/Au/SiO₂/NH₂金磁纳米颗粒的制备：取步骤(1)>2和-SH的Fe₃O₄纳米颗粒与步骤(2)中Au纳米颗粒的质量比为1:5～6，混合后反应6～8h，然后磁分离后弃去上清液，用水洗涤，重复上述反应再分离洗涤过程，最后分散于水中，得到Fe₃O₄纳米颗粒表面完全包覆Au纳米颗粒的金磁纳米颗粒，即Fe₃O₄/SiO₂/Au金磁纳米颗粒；再用水洗涤后磁分离收集，用含乙醇、氨水的水溶液B>3O₄/SiO₂/Au金磁纳米颗粒在含乙醇、氨水的水溶液B中质量浓度为0.029％-0.035％，超声震荡5-10min，缓慢加入TEOS，在超声环境下反应6～8h，反应结束后磁分离收集颗粒，即Fe₃O₄/SiO₂/Au/SiO₂金磁纳米颗粒，用水洗涤，再用所述含乙醇、氨水的水溶液B分散，所述Fe₃O₄/SiO₂/Au/SiO₂金磁纳米颗粒在含乙醇、氨水的水溶液B中质量浓度为0.029％-0.038％，超声振荡5-10>3O₄/SiO₂/Au/SiO₂/NH₂金磁纳米颗粒；所述>3O₄/SiO₂/Au纳米颗粒的质量计为>

本发明还提供所述的Fe₃O₄/SiO₂/Au/SiO₂/NH₂金磁纳米颗粒结合表面增强拉曼光谱快速检测河豚毒素的应用。

进一步，所述的Fe₃O₄/SiO₂/Au/SiO₂/NH₂金磁纳米颗粒结合表面增强拉曼光谱快速检测河豚毒素方法为：

(a)拉曼光谱基底制备

将Fe₃O₄/SiO₂/Au/SiO₂/NH₂金磁纳米颗粒与NHS-PEG-NHS在pH＝7.4磷酸盐缓冲液中反应，再与河豚毒素抗体反应得到金磁纳米颗粒修饰后河豚毒素抗体；所述NHS-PEG-NHS的体积用量以>3O₄/SiO₂/Au/SiO₂/NH₂金磁纳米颗粒的质量计为1mL/mg～1.5mL/mg；所述河豚毒素抗体的体积用量以Fe₃O₄/SiO₂/Au/SiO₂/NH₂金磁纳米颗粒的质量计为0.1mL/mg～0.2mL/mg；

将罗丹明B拉曼染料与河豚毒素抗体在pH＝8.3的NaHCO₃缓冲液反应得到RhB修饰后的河豚毒素抗体；所述罗丹明B拉曼染料的用量以河豚毒素抗体的体积用量计为0.50mg/mL～0.55mg/mL；

(b)建立水中河豚毒素检测的工作曲线

金磁纳米颗粒修饰后河豚毒素抗体与RhB修饰后的河豚毒素抗体混合后磁分离，所述RhB修饰后的河豚毒素抗体与金磁纳米颗粒修饰后河豚毒素抗体的体积用量比为1:5～10；并转移至凹面载玻片上，通过激光拉曼光谱仪直接照射得到罗丹明RhB的拉曼光谱图；

取与上述步骤等量的金磁纳米颗粒修饰后河豚毒素抗体、RhB修饰后的河豚毒素抗体，与河豚毒素配制成具有梯度的0.01～0.5μg/mL 浓度范围的河豚毒素溶液，测量其拉曼光谱图，与罗丹明RhB的拉曼光谱图比较得河豚毒素存在时，RhB有1510cm^-1的特征峰，以1510>-1处的RhB特征峰的峰强对河豚毒素浓度进行双对数作图，获得水中快速检测河豚毒素的工作曲线；

(c)水中河豚毒素样品的检测

将样品与步骤(c)中等量的金磁纳米颗粒修饰后河豚毒素抗体、 RhB修饰后的河豚毒素抗体配置成溶液，测量其拉曼光谱图，如出现 1510cm^-1处的RhB特征峰，读取其峰强，代入步骤(b)中所得工作曲线可计算出溶液中河豚毒素的浓度，即可计算出样品中河豚毒素的浓度；如未出现1510cm^-1处的RhB特征峰，说明样品中河豚毒素的量极微少或不存在。

具体地，本发明所述的Fe₃O₄/SiO₂/Au/SiO₂/NH₂金磁纳米颗粒结合表面增强拉曼光谱快速检测河豚毒素方法为：

(a)称取1mg NHS-PEG-NHS,溶于1mL pH＝7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)中，与1mLFe₃O₄/SiO₂/Au/SiO₂/NH₂金磁纳米颗粒混合，振荡反应6h，反应结束后磁分离收集颗粒，用PBS洗涤金磁纳米颗粒，再次磁分离；用2mL>

取50μg罗丹明B拉曼染料溶于0.2mL pH＝8.3的NaHCO₃缓冲液中；再加入0.1mL1mg/mL的河豚毒素抗体；混匀后室温下振荡反应6h；反应结束后用NaHCO₃缓冲液透析混合液，除去多余的罗丹明B拉曼染料，得到RhB修饰后的河豚毒素抗体；

(b)取金磁纳米颗粒修饰后河豚毒素抗体50μL RhB修饰后的河豚毒素抗体10μL，与河豚毒素配制成浓度为0.5μg/mL、0.1 μg/mL、0.05μg/mL、0.02μg/mL、0.01μg/mL时的拉曼光谱图，以 1510cm^-1处的RhB特征峰的峰强对河豚毒素浓度进行双对数作图，获得水中快速检测河豚毒素的工作曲线；TTX浓度在0.5μg/mL至>-1处拉曼峰强的对数与河豚毒素浓度的对数线性关系良好，线性方程为InI₁₅₁₀＝9.34725InC_TTX+0.89229，其中>1510为1510cm^-1处拉曼峰强的对数，lnC_TTX为河豚毒素浓度的对数，>

(c)将样品与金磁纳米颗粒修饰后河豚毒素抗体50μL RhB修饰后的河豚毒素抗体10μL配置成溶液，测量其拉曼光谱图，如出现 1510cm^-1处的RhB特征峰，读取其峰强，代入步骤(b)中所得工作曲线可计算出溶液中河豚毒素的浓度，即可计算出样品中河豚毒素的浓度；如未出现1510cm^-1处的RhB特征峰，说明样品中河豚毒素的量极微少或不存在。

文中，TEOS为四乙氧基硅烷，APTES为3-氨丙基三乙氧基硅烷， MPTES为3-巯丙基三乙氧基硅烷，NHS-PEG-NHS为活性酯聚乙二醇活性酯，RhB为罗丹明B。

从Fe₃O₄磁纳米颗粒到Fe₃O₄/SiO₂/Au/SiO₂/NH₂金磁纳米颗粒，其质量变化很微小，因此本发明计算时认为所有磁纳米颗粒质量不变。

本发明的有益效果为：

1.Fe₃O₄/SiO₂/Au/SiO₂/NH₂磁纳米颗粒能在外磁场中快速分离，在其表面包覆具有良好表面增强拉曼散射效应的金纳米颗粒并使用这种金磁纳米颗粒作为SERS检测的基底，且改善制备方法，使得制备的金纳米颗粒可以更好地与无定形二氧化硅包覆层表面结合，不但使样品易于分离，省去传统离心沉淀或过柱分离的复杂过程，还能将样品快速浓缩，从而提高检测灵敏度。

2.金纳米颗粒能包覆在Fe₃O₄/SiO₂纳米颗粒的表面，并且结合地非常紧密。从不同分辨率下Fe₃O₄/SiO₂/Au/SiO₂金磁纳米颗粒的>3O₄/SiO₂磁性纳米颗粒的粒径较大，在颗粒的边界可以看到一层明显的无定形SiO₂的包覆层，且在磁性粒子的表面吸附了大量Au纳米颗粒，吸附的Au纳米颗粒十分均匀，粒径在40nm左右，呈球形。金纳米颗粒紧密的包覆在>3O₄/SiO₂纳米颗粒的表面，克服了传统方法中金纳米颗粒包覆不上且包覆不紧密的缺点，在检测过程中可以大大提高检测灵敏度，如图>

3.确定了氨基修饰的最佳方案，使得金纳米颗粒能够紧密地吸附在SiO₂包覆的Fe₃O₄纳米颗粒表面，即能防止金纳米颗粒的聚集，又能使金纳米颗粒均匀的吸附在Fe₃O₄表面，表现出良好的磁分离效果，如图3所示。

4.确定了Fe₃O₄/SiO₂/Au金磁纳米颗粒的最佳组装方式，使得实验制备的金磁纳米颗粒整体包覆均匀，磁纳米颗粒表面吸附的金纳米颗粒分散的较好。在相同检测情况下，能够收集到较强的SERS信号，如图4所示。

5.确定TEOS的最佳用量，使得无定形SiO₂层的厚度适中，既能提供较大的比表面积以及保护Fe₃O₄纳米颗粒不被氧化和相互聚集，又不会使二氧化硅层包覆过厚，导致Fe₃O₄/SiO₂纳米颗粒磁性降低；并且既能达到较好的包覆率增加检测时的增强效果又能达到较为高的金纳米粒子利用率，如图5所示。

6.Fe₃O₄/SiO₂纳米颗粒溶液以及Fe₃O₄/SiO₂/Au/SiO₂/NH₂金磁纳米颗粒溶液在室温下十分稳定，长时间放置(3个月)分散性依然良好，可以利用磁浓缩效应提高其SERS检测灵敏度，如图6、图7所示。

7.在检测体系中存在河豚毒素时，Fe₃O₄/Au/antiTTX基底与>3O₄/Au/antiTTX基底与RhB/antiTTX间的距离拉近，从而使基底上的Au纳米颗粒与RhB染料分子的距离拉近，产生较强的SERS增强效应，从而提高了检测的灵敏度和选择性，降低了检测背景的干扰，相比于其它检测手段(如高效液相色谱、质谱、薄层色谱等)，拉曼光谱技术更加简单便捷、易应用于现场快速检测，如图8、图9所示。

8.以Fe₃O₄/Au/antiTTX金磁纳米颗粒为拉曼基底快速检测河豚毒素。将合成的金磁纳米颗粒溶液与河豚毒素的标准溶液配制一系列不同金磁纳米颗粒浓度与河豚毒素浓度的溶液，将这些溶液用移液枪转移到凹面载玻片上，并于凹面载玻片下用一圆形钕铁硼磁铁将金磁纳米颗粒聚集成点，在激光拉曼光谱仪的照射下，读取河豚毒素的相关特征峰及谱图，并绘制快速检测河豚毒素的工作曲线，单个样品的测试时间小于10分钟，如图10所示。

附图说明

图1：不同分辨率下实施例2的Fe₃O₄/SiO₂/Au/SiO₂金磁纳米颗粒的TEM图像。

图2：实施例2的Fe₃O₄/SiO₂/Au/SiO₂金磁纳米颗粒的EDX谱图。

图3：实施例3不同基团修饰后得到的Fe₃O₄/SiO₂/Au纳米颗粒的图片(a、c、e)与TEM图像(b、d、f)。图3(a)、(e)对应实施例2的步骤(1)所得(1)表面带-NH₂和-SH的Fe₃O₄/SiO₂纳米颗粒，图3(c)、(d)对应实施例3(A)所得只修饰-NH₂的Fe₃O₄/SiO₂磁性纳米颗粒，图3(e)、(f)对应实施例3(B)只修饰-SH的Fe₃O₄/SiO₂磁性纳米颗粒。

图4分别为实施例4(A)搅拌方式、(B)振荡方式、(C)超声方式得到的Fe₃O₄/SiO₂/Au纳米颗粒TEM图像(a、c、e)与相应拉曼图谱(b、d、f)。

图5：实施例5不同量(3μL、4.5μL、6μL)的TEOS条件下得到产物Fe₃O₄/SiO₂/Au/SiO₂金磁纳米颗粒的TEM图像(a、c、e)与相应拉曼图谱(b、d、f)。μL图6：实施例2制备的Fe₃O₄/SiO₂纳米颗粒溶液以及Fe₃O₄/SiO₂/Au/SiO₂/NH₂金磁纳米颗粒溶液:未分离时图示。在室温下十分稳定，长时间放置(3个月)后分散性依然良好。

图7：用一钕铁硼外磁体(直径25mm×厚度20mm)对实施例 2制备的Fe₃O₄/SiO₂、Fe₃O₄/SiO₂/Au纳米颗粒溶液进行浓缩实验，在>3O₄/SiO₂/Au>

图8：为应用实施例1中未添加河豚毒素时的空白对照组的拉曼光谱图。

图9：为Fe₃O₄/Au/antiTTX金磁纳米颗粒为拉曼基底测得TTX>

图10：应用实施例1中以Fe₃O₄/Au/antiTTX金磁纳米颗粒为拉曼基底检测河豚毒素的标准曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例1

i)表面带-NH₂和-SH的Fe₃O₄/SiO₂纳米颗粒的制备

取4.00mg>3O₄纳米颗粒，用蒸馏水洗涤2次，洗完之后磁分离收集，用2mL蒸馏水分散，装入15mL玻璃瓶中，同时加入11mL>2和-SH的Fe₃O₄纳米颗粒，先后用无水乙醇、蒸馏水洗涤两次，最后分散在12mL蒸馏水中待用。

ⅱ)金纳米颗粒的制备

称取12.00mg氯金酸，溶于1.00mL蒸馏水中，备用。在装有温度探头的250mL圆底烧瓶中加入50mL蒸馏水，500rpm磁力搅拌下加热至101℃，然后一次性加入100μL(质量分数为6％)柠檬酸钠溶液，25s后加入1.0mL溶有10.00mg的氯金酸水溶液，保持101℃至反应结束后停止加热，搅拌下自然冷却。冷却至室温后12000r/min 下离心10min，收集下层颗粒，分散在6mL蒸馏水中待用。

ⅲ)表面带-NH₂的Fe₃O₄/SiO₂/Au/SiO₂金磁纳米颗粒的制备

取4mL步骤(1)修饰后的Fe₃O₄纳米颗粒，磁分离后弃去上清液，加入4mL金纳米颗粒，混合后反应8h。然后磁分离后弃去上清液，用蒸馏水洗涤2次，重复实施例(ⅲ)上述过程5次，最后分散在4mL蒸馏水中。得到Fe₃O₄纳米颗粒表面完全包覆Au纳米颗粒的Fe₃O₄/SiO₂/Au金磁纳米颗粒。

取上述制备的金磁纳米颗粒4mL，用蒸馏水洗涤两次，洗完后磁分离收集，用0.5mL水分散，移至10mL玻璃瓶中，同时加入3.5 mL乙醇以及50μL氨水，超声震荡10min，缓慢加入3.2μL TEOS，在超声环境下反应8h，反应结束后磁分离收集颗粒，即>3O₄/SiO₂/Au/SiO₂金磁纳米颗粒，用蒸馏水洗涤两次，再用0.5mL>2的>3O₄/SiO₂/Au/SiO₂金磁纳米颗粒。

实施例2

(1)表面带-NH₂和-SH的Fe₃O₄/SiO₂纳米颗粒的制备

取4.00mg>3O₄纳米颗粒，用蒸馏水洗涤2次，洗完之后磁分离收集，用2mL蒸馏水分散，装入15mL玻璃瓶中，同时加入9mL>2和-SH的Fe₃O₄纳米颗粒，先后用无水乙醇、蒸馏水洗涤两次，最后分散在12mL蒸馏水中待用。

(2)金纳米颗粒的制备

称取10.00mg氯金酸，溶于1.00mL蒸馏水中，备用。在装有温度探头的250mL圆底烧瓶中加入50mL蒸馏水，500rpm磁力搅拌下加热至100℃，然后一次性加入100μL(质量分数为3％)柠檬酸钠溶液，20s后加入1.00mL溶有10.00mg的氯金酸水溶液，保持 95℃至反应结束后停止加热，搅拌下自然冷却。冷却至室温后12000 r/min下离心10min，收集下层颗粒，分散在6mL蒸馏水中待用。

(3)表面带-NH₂的Fe₃O₄/SiO₂/Au/SiO₂金磁纳米颗粒的制备

取4mL步骤(1)修饰后的Fe₃O₄纳米颗粒，磁分离后弃去上清液，加入4mL金纳米颗粒，混合后反应6h。然后磁分离后弃去上清液，用蒸馏水洗涤2次，重复实施例(3)上述过程5次，最后分散在4mL蒸馏水中。得到Fe₃O₄纳米颗粒表面完全包覆Au纳米颗粒的Fe₃O₄/SiO₂/Au金磁纳米颗粒。

取上述制备的金磁纳米颗粒4mL，用蒸馏水洗涤两次，洗完后磁分离收集，用0.5mL水分散，移至10mL玻璃瓶中，同时加入3.5 mL乙醇以及50μL氨水，超声震荡5min，缓慢加入2.8μL TEOS，在超声环境下反应6h，反应结束后磁分离收集颗粒，即>3O₄/SiO₂/Au/SiO₂金磁纳米颗粒，用蒸馏水洗涤两次，再用0.5mL>2的>3O₄/SiO₂/Au/SiO₂金磁纳米颗粒。

所得Fe₃O₄/SiO₂/Au/SiO₂金磁纳米颗粒TEM图和EDX图如图1、>3O₄/SiO₂磁性纳米颗粒的粒径较大(图2a、b)，在颗粒的边界可以看到一层无定形的SiO₂包覆层，且在磁性粒子的表面吸附了大量Au纳米颗粒，吸附的Au纳米颗粒粒径均匀，大约为40nm，呈球形，且Au纳米颗粒外层还分布着一层SiO₂(图2c)。从图中可以看出Au纳米颗粒紧密地接合在了Fe₃O₄/SiO₂纳米颗粒的表面。从图3能谱分析中可以看出，Au元素的信号峰和Fe元素信号峰都十分明显，而图中C元素峰来源于铜网的超薄碳支膜，Cu元素峰来源于电镜铜网，说明Fe₃O₄纳米颗粒的表面覆盖有Au元素和Si元素。

实施例3

(A)只修饰-NH₂的Fe₃O₄/SiO₂磁性纳米颗粒

取4.00mg>3O₄纳米颗粒，用蒸馏水洗涤2次，洗完后磁分离收集，用2mL蒸馏水分散，装入15mL玻璃瓶中，同时加入10mL>2的Fe₃O₄纳米颗粒，先后用无水乙醇、蒸馏水洗涤两次，最后分散在12ml蒸馏水中待用。

称取10.00mg氯金酸，溶于1.00mL蒸馏水中，备用。在装有温度探头的250mL圆底烧瓶中加入50mL蒸馏水，500rpm磁力搅拌下加热至100℃，然后一次性加入100μL(质量分数为5％)柠檬酸钠溶液，20s后加入1.00mL溶有10.00mg的氯金酸水溶液，保持 100℃至反应结束后停止加热，搅拌下自然冷却。冷却至室温后12000 r/min下离心10min，收集下层颗粒，分散在6mL蒸馏水中待用。

取4mL修饰后的Fe₃O₄纳米颗粒溶液，磁分离后弃去上清液，加入4mL金纳米颗粒，混合后反应7h。然后磁分离后弃去上清液，用蒸馏水洗涤2次，磁分离后弃去上清液。重复上述添加金纳米颗粒修饰操作5次，最后分散在4mL蒸馏水中。得到Fe₃O₄纳米颗粒表面包覆金纳米颗粒的Fe₃O₄/SiO₂/Au金磁纳米颗粒。

(B)只修饰-SH的Fe₃O₄/SiO₂磁性纳米颗粒

取4.00mg>3O₄纳米颗粒，用蒸馏水洗涤2次，洗完后磁分离收集，用2mL蒸馏水分散，装入15mL玻璃瓶中，同时加入10mL>2的Fe₃O₄纳米颗粒，先后用无水乙醇、蒸馏水洗涤两次，最后分散在12ml蒸馏水中待用。

称取10.00mg氯金酸，溶于1.00mL蒸馏水中，备用。在装有温度探头的250mL圆底烧瓶中加入50mL蒸馏水，500rpm磁力搅拌下加热至100℃，然后一次性加入100μL(质量分数为5％)柠檬酸钠溶液，20s后加入1.00mL溶有10.00mg的氯金酸水溶液，保持 100℃至反应结束后停止加热，搅拌下自然冷却。冷却至室温后12000 r/min下离心10min，收集下层颗粒，分散在6mL蒸馏水中待用。

取4mL修饰后的Fe₃O₄纳米颗粒溶液，磁分离后弃去上清液，加入4mL金纳米颗粒，混合后反应7h。然后磁分离后弃去上清液，用蒸馏水洗涤2次，磁分离后弃去上清液。重复上述添加金纳米颗粒修饰操作5次，最后分散在4mL蒸馏水中。得到Fe₃O₄纳米颗粒表面包覆金纳米颗粒的Fe₃O₄/SiO₂/Au金磁纳米颗粒。

图3即为不同基团修饰后得到的Fe₃O₄/SiO₂/Au纳米颗粒的图片>2和-SH的Fe₃O₄/SiO₂纳米颗粒，图3(c)、(d)对应实施例3(A)所得只修饰-NH₂的Fe₃O₄/SiO₂磁性纳米颗粒，图3(e)、(f)对应实施例3(B)只修饰-SH的Fe₃O₄/SiO₂磁性纳米颗粒。由图可知，两种基团-NH₂和-SH修饰的Fe₃O₄，经磁分离后上清液已澄清，表明金纳米颗粒可被完全吸附(图3a)，且磁纳米颗粒表面吸附的金也比较均匀(图3b)。只修饰上-NH₂的Fe₃O₄经磁分离后上层溶液还是比较浑浊(图3c)，TEM下看到磁颗粒表面也只吸附了非常少的金纳米颗粒(图3d)。而只修饰上-SH的Fe₃O₄经磁分离后上层溶液也较浑浊(图3e)，而且磁纳米颗粒表面吸附的金纳米颗粒也不均匀，存在金纳米颗粒的聚集情况(图3f)。因此选取同时修饰了-NH₂和-SH的Fe₃O₄来组装金磁纳米颗粒。

实施例4

(A)搅拌反应法组装Fe₃O₄/SiO₂/Au金磁纳米颗粒

取4mL实施例2步骤(1)修饰后的Fe₃O₄纳米颗粒，磁分离后弃去上清液，加入4mL金纳米颗粒，搅拌反应6h。然后磁分离后弃去上清液，用蒸馏水洗涤2次。

重复上述过程5次，最后分散在4mL蒸馏水中。得到>3O₄/SiO₂/Au金磁纳米颗粒。

(B)振荡反应法组装Fe₃O₄/SiO₂/Au金磁纳米颗粒

取4mL实施例2步骤(1)修饰后的Fe₃O₄纳米颗粒，磁分离后弃去上清液，加入4mL金纳米颗粒，振荡反应6h。然后磁分离后弃去上清液，用蒸馏水洗涤2次。

重复上述过程5次，最后分散在4mL蒸馏水中。得到>3O₄/SiO₂/Au金磁纳米颗粒。

(C)超声反应法组装Fe₃O₄/SiO₂/Au金磁纳米颗粒

取4mL实施例2步骤(1)修饰后的Fe₃O₄纳米颗粒，磁分离后弃去上清液，加入4mL金纳米颗粒，超声反应6h。然后磁分离后弃去上清液，用蒸馏水洗涤2次。

重复上述过程5次，最后分散在4mL蒸馏水中。得到>3O₄/SiO₂/Au金磁纳米颗粒。

由图4可知，搅拌方式得到的金磁纳米颗粒整体包覆比较均匀，磁纳米颗粒表面吸附的金纳米颗粒分散的较好(图4a)，对应的拉曼峰也较为理想，1510cm^-1处的峰可达到8000以上(图4b)。修饰过程采用振荡修饰时，Fe₃O₄纳米颗粒表面的金纳米颗粒的密集度则不如搅拌修饰(图4c)。同时所测得的拉曼峰值也比前者略低，1510cm^-1处的峰只有6000左右(图4d)。而采用超声方式组装得到的金磁纳米颗粒TEM下看到Fe₃O₄纳米颗粒表面只吸附了少量的金纳米颗粒，大部分表面无吸附(图4e)，同时对应所测得的拉曼峰也降低了很多，1510cm^-1处的峰也有3000左右(图4f)。这是因为超声频率过大，会使已经吸附在Fe₃O₄纳米颗粒表面的金纳米颗粒脱落，而振荡频率较低，金磁组装过程不会致金纳米颗粒脱落，但却不能Fe₃O₄表面完全包覆金纳米颗粒。搅拌过程相比于振荡较剧烈，但又不同于超声，使Fe₃O₄表面充分吸附金纳米颗粒的同时又不致二次脱落。因此选用搅拌方式组装最为理想。

实施例5不同量TEOS对Fe₃O₄/SiO₂/Au/SiO₂金磁纳米颗粒SERS效果的影响

取实施例2步骤(3)Fe₃O₄/SiO₂/Au金磁纳米颗粒4mL，用蒸馏水洗涤两次，洗完后磁分离收集，用0.5mL水分散，移至10mL玻璃瓶中，同时加入3.5mL乙醇以及50μL氨水，超声震荡5min，缓慢加入TEOS，在超声环境下反应6h，反应结束后磁分离收集颗粒，用蒸馏水洗涤两次，再用0.5mL水和3.5mL无水乙醇分散。重复以上操作，做三组平行实验，其中TEOS的用量分别为3μL、4.5μL、>2与-SH的金磁纳米颗粒。将上述金磁纳米颗粒与60μL>

由图5可知，TEOS添加量为3μL的金磁纳米颗粒的金外层已经有较薄的一层SiO₂包覆(图5a)，对应的拉曼图中1510cm^-1与>-1处的峰值均可达到7000以上(图5b)。硅烷外层随着TEOS>-1处的峰值降低到了6000左右>

应用实施例1

(a)拉曼基底的制备

i)Fe₃O₄/SiO₂/Au/SiO₂金磁纳米颗粒修饰后的抗体

称取1mg NHS-PEG-NHS,溶于1mL pH＝7.4的磷酸盐缓冲液 (PBS)中。量取1mL实施例1制备得到的表面带-NH₂的Fe₃O₄/SiO₂/Au/SiO₂金磁纳米颗粒溶液，将1mL>2将-NHS基团固定在金磁纳米颗粒的表面。反应结束后磁分离收集颗粒，用PBS洗涤金磁纳米颗粒，再次磁分离。用2mL>

ii)RhB修饰后的抗体

称取50μg罗丹明B拉曼染料至棕色玻璃瓶中，溶于0.2mL pH＝8.3的NaHCO₃缓冲液中。量取0.1mL>3缓冲液透析混合液，除去多余的罗丹明B拉曼染料。

(b)建立水中河豚毒素检测的工作曲线

取Fe₃O₄/SiO₂/Au/SiO₂/NH₂金磁纳米颗粒修饰后的抗体50μL， RhB修饰后的抗体10μL，混合振荡反应30min，磁分离后置于凹面载玻片上，使用拉曼光谱仪(型号Advantage785，激光波长785nm，功率为120mW，积分时间1s)测量其拉曼图谱作为空白对照组。1376>-1处的尖峰为玻璃板的峰，由图8可知，1510cm^-1与1648cm^-1处均无明显峰值。说明缺少河豚毒素，未能连接金磁-抗体复合物与RhB->

取Fe₃O₄/SiO₂/Au/SiO₂/NH₂金磁纳米颗粒修饰后的抗体50μL，>-1处的峰强对>1510＝9.34725InC_TTX+0.89229(lnI₁₅₁₀为1510cm^-1处拉曼峰强的对数，lnC_TTX为河豚毒素浓度的对数)，R＝0.9959。

图9为TTX浓度为0.2μg/mL、0.1μg/mL、0.05μg/mL、0.02 μg/mL、0.01μg/mL、0.005μg/mL的拉曼光谱图。由图可知，随着 TTX浓度的降低，拉曼信号也在随之降低，当浓度达到0.01μg/mL 时，拉曼信号还有一定的强度，而当浓度再降低到0.005μg/mL时，信号接近消失，说明此方法检测TTX时，可达到0.01μg/mL的检测限，灵敏度非常高，已超越TTX国家检测限的20μg/kg。

(c)水中河豚毒素样品的检测

配制浓度为0.5、0.05、0.01μg/mL的河豚毒素水溶液样品作为待测溶液，每个浓度在同等条件下测试三次。检测结果中河豚毒素的回收率为82.64％～92.60％，相对标准偏差(RSD)在2.6％～11.1％之间。由于磁分离显著提高了检测灵敏度，显著缩短了激光拉曼光谱仪对样品的照射时间，使整个测试过程能在10分钟内完成，从而可实现对河豚毒素的快速检测。