一种利用植物乳杆菌胞外多糖合成贵金属纳米颗粒的方法

摘要

本发明公开了一种利用植物乳杆菌发酵获得的胞外多糖合成贵金属纳米颗粒的方法。以植物乳杆菌胞外多糖和贵金属溶液为原料，反应获得贵金属纳米颗粒。所合成贵金属纳米颗粒粒径均一，分散性好。此外，该方法反应时间短，能耗低，无需添加任何化学试剂，实现了贵金属纳米颗粒的绿色合成。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术和纳米材料领域，具体涉及一种植物乳杆菌胞外多糖在合成贵金属纳米颗粒中的应用。

背景技术

传统的贵金属纳米颗粒合成方法多采用化学试剂还原法，这其中涉及到乙二胺、硼氢化钠等化学还原剂，它们的使用带来了潜在的环境污染以及生物毒性等问题。因此，人们开始寻找合成贵金属纳米颗粒的替代方法，以实现绿色、可持续化发展。多糖以其衍生物被证明可以用来合成贵金属纳米颗粒，包括香菇多糖、羧甲基壳聚糖、普鲁兰多糖、葡聚糖、羧甲基纤维素、瓜尔豆胶等。但是，利用这些多糖及其衍生物合成贵金属纳米颗粒时存在一定的缺陷。例如，纤维素和几丁质在合成贵金属纳米颗粒之前先要经化学修饰为羧甲基化合物；香菇多糖首先需要加热到140℃以达到最佳状态，且合成的金属纳米颗粒的形貌和香菇多糖的结构相关；葡聚糖作为还原剂时，需要将pH调为11，并且需要12-16h的合成时间而普鲁兰多糖和瓜尔豆胶则需要高温和较长的反应时间。为了克服以上多糖作为还原剂合成贵金属纳米颗粒存在的缺陷以实现真正的绿色合成，寻找和开发新的能够合成纳米颗粒的多糖是非常有意义的。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种利用胞外多糖作为还原剂，合成贵金属纳米颗粒的方法，以解决现有贵金属纳米颗粒合成耗能、耗时以及污染环境等问题。

为解决以上技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种贵金属纳米颗粒的合成方法：在贵金属溶液中加入胞外多糖溶液进行反应获得贵金属纳米颗粒，所述胞外多糖为还原剂。

优选地，所述胞外多糖为植物乳杆菌发酵得到的胞外多糖，其中，所述植物乳杆菌从云南泡菜分离得到，分类命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，菌株号为LCC-605，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，邮编430072。保藏编号为CCTCC NO:M 2016491，在NCBI上的登录号为：KX443590，保藏日期为2016年9月18日，该菌株已申请中国专利201710025113.0。

植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CCTCC NO:M 2016491发酵得到胞外多糖的方法已记载于中国专利201710025113.0中，具体制备方法如下：

(1)植物乳杆菌LCC-605按体积比3％接种于MRS培养基中,在31℃发酵24h，得到发酵液；

(2)将发酵液14000rpm，4℃离心30min，去除菌体，上清液加入80％的三氯乙酸，直至三氯乙酸终浓度为4％，置于4℃冰箱过夜，沉淀蛋白；

(3)隔天，将步骤(2)得到的体系14000rpm，4℃离心30min，去除沉淀蛋白，上清液加入3倍体积的无水乙醇，置于4℃冰箱过夜，以沉淀胞外多糖。隔天，14000rpm，4℃离心30min，收集沉淀即为胞外多糖。

(4)该胞外多糖用少量水溶解，用7000Da的透析袋透析三天，每4h换一次水，以去除其中的单糖，冻干即得植物乳杆菌LCC-605的胞外多糖，备用。

优选地，所述贵金属溶液为10～100mg/L AgNO₃溶液或10～100mg/L>4溶液。

更优选地，所述贵金属溶液为100mg/mL。

优选地，所述胞外多糖溶液的浓度为0.2～5mg/mL。

更优选地，所述胞外多糖的浓度为2mg/mL。

优选地，所述胞外多糖溶液与贵金属溶液的体积比为1:5～1:15。

更优选地，所述胞外多糖溶液与贵金属溶液的体积比为1:10。

优选地，所述反应温度为25～100℃。

更优选地，所述反应温度为100℃。

优选地，所述反应时间为1～40min。

更优选地，所述反应时间为15min。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优势：

1、利用本发明合成贵金属纳米颗粒不需调节pH，只需加热到100℃，反应15min，反应时间短，大大降低了能耗。

2、本发明合成贵金属纳米颗粒时无需添加任何化学还原剂，消除了化学试剂污染，实现了绿色合成。

3、本发明以植物乳杆菌胞外多糖为还原剂，以氯金酸或硝酸银溶液为原料，短时间加热煮沸，制得了分布均匀的贵金属纳米颗粒，其中制得的金纳米颗粒长期稳定。透射电镜显示所合成的贵金属纳米颗粒尺寸分布均匀，金纳米颗粒的平均尺寸在12.2nm左右，银纳米颗粒的平均尺寸在25.0nm左右，具有良好的分散性。由于该方法的原料来源安全无害，反应时间短，反应温度仅需100℃，因此，该方法有望在绿色合成贵金属纳米颗粒方面得到广泛应用。

附图说明

图1为实施例2中植物乳杆菌胞外多糖合成金纳米颗粒时不同反应时间的颜色变化示意图(从左到右依次为0、3、10、15和30min)。

图2为实施例5中金(A)、银(B)纳米颗粒的紫外光谱示意图。

图3为实施例6中金纳米颗粒的X射线光电子能谱检测结果示意图。

图4为实施例7中金(A)、银(B)纳米颗粒的扫描电镜示意图。

图5为实施例8中金(A)、银(B)纳米颗粒的透射电镜示意图。

图6为实施例8中金(A)、银(B)纳米颗粒的超高分辨示意图，显示合成的金，银纳米颗粒为面心立方结构。

图7为实施例8中金(A)、银(B)纳米颗粒的粒径分布图，所合成的金纳米颗粒粒径为12.2nm左右(A)，所合成的银纳米颗粒粒径为25nm左右。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1胞外多糖的制备方法

取植物乳杆菌LCC-605的菌体样本，用MRS培养基活化三次。4℃，14000g离心30min，以去除菌体。离心后将上层清夜倒入烧杯，剩下的菌体再次离心一次，上层清夜再次倒入烧杯，然后在烧杯里倒入80％的三氯乙酸，直至三氯乙酸终浓度为4％，放入4℃冰箱过夜，沉淀蛋白。隔天，将烧杯里的溶液再次离心，以分离沉淀的蛋白质。去除沉淀，倒出上层清液，再加入三倍体积的无水乙醇，放入4℃冰箱过夜，以沉淀胞外多糖。隔天，将烧杯里的溶液离心，沉淀即为多糖。将多糖取出加入少量超纯水溶解，装入透析袋中，放入大烧杯使其透析三天，每4h换一次水，以去除其中的单糖。三天后，置于真空冷冻干燥机中冻干，即得植物乳杆菌LCC-605的胞外多糖。

实施例2胞外多糖合成贵金属纳米颗粒

将胞外多糖配成2mg/mL的溶液，取5mL加入到50mL 100mg/L的氯金酸溶液或硝酸银溶液中，煮沸。分别在0、3、10、15和30min时取样分析。结果见图1，在15min时氯金酸多糖溶液中出现酒红色，该颜色为金纳米颗粒的特征颜色，说明反应15min后合成了金纳米颗粒。

实施例3胞外多糖合成贵金属纳米颗粒

将胞外多糖配成0.2mg/mL的溶液，取5mL加入到25mL 10mg/L的氯金酸溶液或硝酸银溶液中，25℃反应40min取样分析。

实施例4胞外多糖合成贵金属纳米颗粒

将胞外多糖配成5mg/mL的溶液，取5mL加入到75mL 50mg/L的氯金酸溶液或硝酸银溶液中，煮沸。分别在0、3、10、15和30min时取样分析。

实施例5金、银纳米颗粒的紫外吸收

选择400～900nm的扫描范围对实施例2合成的贵金属纳米颗粒样品进行紫外吸收光谱检测，结果见图2，该胞外多糖合成的金、银纳米颗粒分别在550nm(A)、405nm(B)处有最大吸收峰。

实施例6金纳米颗粒X射线光电子能谱(XPS)检测

将实施例2合成的金纳米颗粒冻干后进行XPS检测，结果如图3所示，该胞外多糖合成的金纳米颗粒在83.6和87.5eV结合能处有吸收峰，这两个峰位置为金元素的典型XPS能谱峰。

实施例7利用扫描电镜对金、银纳米颗粒的形貌观察

取上述实施例2获得的金、银纳米颗粒溶液10uL滴到硅片上自然风干后进行扫描电镜观察。结果见图4，合成的金纳米颗粒为近似球形结构(A)，合成的银纳米颗粒为不规则结构(B)。

实施例8利用透射电镜对对金、银纳米颗粒的形貌观察

取上述实施例2获得的金、银纳米颗粒溶液10uL滴到400目的铜网上进行透射电镜观察，结果见图5，形成的金纳米颗粒为球形结构，银纳米颗粒为椭球型结构。同时采用超高分辨对其晶格结构进行观察，结果见图6，表明该金纳米颗粒和银纳米颗粒具有晶格结构。同时进行粒径分布统计，结果见图7，结果表明该金纳米颗粒粒径在12nm左右，该银纳米颗粒粒径在25nm左右。