T3DNA连接酶和T4RNA连接酶2在检测N

摘要

本发明公开了一种连接酶在检测N

说明书

技术领域

本发明属于生物分析技术领域，具体涉及两种对N⁶甲基腺嘌呤(m⁶A)敏感的连接酶，以及基于该连接酶建立的连接-聚合酶链式反应定量检测RNA中m⁶A百分比含量的方法。

背景技术

随着抗体-高通量测序方法的发展，科学家揭示了m⁶A在生物体内重要的生物功能，然而m⁶A的作用机制还不是很清楚。为了更好的研究m⁶A的作用机制，建立简便、快速、灵敏、具有单碱基分辨率的特定位点m⁶A分析检测方法具有重要的意义。

由于m⁶A和腺嘌呤(A)具有相似的化学结构，精确定位m⁶A的位点具有挑战性。目前存在的m⁶A的分析方法大部分是高通量测序法，这些方法大部分只能给出m⁶A在RNA上的大概位置，而不能给出m⁶A的精确位点。特异位点裂解-同位素标记-连接辅助的薄层色谱法(SCARLET)的发现，使得特定位点的m⁶A的定位分析变为现实，然而此方法不仅过程复杂，耗时长，还用到了同位素，使得它的应用受到了限制。2007年，科学家发现相比A，m⁶A对G有一定的识别能力，如果m⁶A的识别序列对应的碱基为G时可以在一定程度上抑制T4>

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于为T3 DNA连接酶和T4 RNA连接酶2提供一种在RNA上m⁶A百分比含量的定量分析中的新应用。

解决上述技术问题所采用的技术方案由下述步骤组成：

1、根据含有待测位点的RNA序列设计合成左探针、右探针，其中左探针是DNA探针，其从5′端到3′端依次为检测识别区、PCR引物区，且其序列的5′端修饰磷酸基团，右探针是DNA探针，其从5′端到3′端依次为PCR引物区、检测识别区，所述左探针和右探针的检测识别区是与含有待测位点的RNA序列互补的8～40个碱基序列。

2、将步骤1左探针、右探针的检测识别区与含有待测位点的RNA序列杂交，然后加入连接酶进行连接反应。

3、以步骤2的连接产物为模板进行聚合酶链式反应，并加入SUPER Green I荧光染料，实时检测荧光信号，根据实时荧光曲线计算出待测位点A的含量。

4、在待测位点附近选择一个不含m⁶A的位点作为参比位点，根据含有参比位点的RNA序列按照步骤1设计合成左探针、右探针。

5、将步骤4左探针、右探针的检测识别区与含有参比位点的RNA杂交，然后通过连接酶将左探针和右探针连接起来。

6、以步骤5的连接产物为模板进行聚合酶链式反应，并加入SUPER Green I荧光染料，实时检测荧光信号，根据实时荧光曲线计算出参比位点A的含量。

7、根据步骤6计算出的参比位点A的含量减去步骤3计算出的待测位点A的含量，得到待测位点m⁶A的含量，待测位点m⁶A的含量除以待测位点A和m⁶A的总和，就得到m⁶A的百分比含量。

上述步骤1和4中，优选右探针是3′端修饰两个RNA碱基的DNA探针。

上述步骤1和4中，进一步优选左探针和右探针的检测识别区是与含有待测位点的RNA序列互补的10～20个碱基序列。

本发明首次发现T3 DNA连接酶和T4 RNA连接酶2对m⁶A敏感，与A相比，m⁶A可以抑制T3>6A的RNA)为模板，建立了基于连接-聚合酶链式反应定量测定m⁶A百分比含量的方法。该方法首先确定RNA上的待测位点(待测位点是腺嘌呤，可能含有部分N⁶甲基腺嘌呤，当待测位点是m⁶A时，连接酶T3>6A的A位点作为参比位点，用相应的标准曲线定量该参比位点A的含量，然后用参比为点A的含量减去待测位点A的含量得到待测位点m⁶A的含量，用待测位点m⁶A的含量除以待测位点A和m⁶A的总和，即可得到该待测位点m⁶A的百分比含量。

本发明操作简单、灵敏度高、特异性好，能够用于信使RNA(mRNA)，长非编码RNA(lncRNA)，核糖体RNA(rRNA)，转运RNA(tRNA)和小RNA(microRNA)等RNA中的m⁶A的百分比含量测定，为m⁶A生物功能的研究和其在癌症中作用的研究提供了新的方法。

附图说明

图1是实施例1中基于连接-聚合酶链式反应定量检测MALAT1 2577位点m⁶A百分比含量的原理示意图。

图2是实施例1中不同浓度的RNA2577-A及85ng>+RNA的MALAT1>

图3是实施例1中C_T值随着RNA2577-A浓度变化的标准曲线图。

图4是实施例1中不同浓度RNA2488-A及85ng>+RNA的MALAT1>

图5是实施例1中C_T值随着RNA2488-A浓度变化的标准曲线图。

图6是实施例2中不同浓度RNA2577-A及106ng HCT116poly>+RNA的MALAT1>

图7是实施例2中C_T值随着RNA2577-A浓度变化的标准曲线图。

图8是实施例2中不同浓度RNA2488-A及106ng HCT116poly>+RNA的MALAT1>

图9是实施例2中C_T值随着RNA2488-A浓度变化的标准曲线图。

图10是用连接酶区分A和m⁶A的原理示意图。

图11是相同浓度的RNA2577-A和RNA2577-m⁶A荧光强度随着循环次数变化的实时荧光曲线图。

图12是基于相同浓度的RNA2577-A和RNA2577-m⁶A产生的PCR聚合产物的凝胶电泳图。

图13是相同浓度的RNA2577-A和RNA2577-m⁶A荧光强度随着循环次数变化的实时荧光曲线图。

图14是基于相同浓度的RNA2577-A和RNA2577-m⁶A产生的PCR聚合产物的凝胶电泳图。

图15是相同浓度的RNA2577-A和RNA2577-m⁶A荧光强度随着循环次数变化的实时荧光曲线图。

图16是基于相同浓度的RNA2577-A和RNA2577-m⁶A产生的PCR聚合产物的凝胶电泳图。

图17是相同浓度的RNA2577-A和RNA2577-m⁶A荧光强度随着循环次数变化的实时荧光曲线图。

图18是基于相同浓度的RNA2577-A和RNA2577-m⁶A产生的PCR聚合产物的凝胶电泳图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。

实施例1

T3 DNA连接酶在检测HeLa细胞中长非编码RNA(lncRNA，MALAT1)2577位点m⁶A含量的应用，检测原理如图1所示，具体检测方法如下：

1、根据含有MALAT1的2577位点的RNA序列(RNA2577-A)5'-CUUAAUGUUUUUGCAUUGGACUUUGAGUUAAGAUUAUUUUUUAAAUCCUGAGGACUAGCAUUAAUUGAC-3'(画下划线的碱基是2577位点，在HeLa细胞中MALAT1的2577位点一部分是A，一部分为m⁶A)设计合成左探针(LigaseL2)和右探针(Ligase>4CCAATGCAAAAA-3'(画下划线的部分为检测识别区、斜体部分为PCR引物区，由宝生物工程(大连)有限公司提供)，Ligase R2的碱基序列为5'-CTTAACTCAAArGrU-3'(画下划线的部分为检测识别区、斜体部分为PCR引物区，由宝生物工程(大连)有限公司提供)。

2、在200μL离心管中加入1.0μL水、1.0μL 200 nM Ligase L2水溶液和1.0μL200nM Ligase R2水溶液、1.0μL 5×的T3 DNA连接酶反应缓冲溶液(330mM Tris-HCl、50mMMgCl₂、5>+RNA水溶液(同时作空白对比实验，空白是加入1.0μL水来代替RNA2577-A)，混合均匀，作为溶液A。在200μL离心管中加入3.9μL水、1.0μL>2、5mM二硫苏糖醇、5mM腺嘌呤核苷三磷酸，pH＝7.6，25℃)、0.1μL>

3、取步骤2中2.0μL连接反应产物加入到8.0μL聚合酶链式反应(PCR)混合溶液中，其中PCR反应混合溶液由5.2μL灭菌水、0.2μL 2.5unit/μL JumpStart^TM>TM>2，0.01％(w/v)明胶)、1.0μL>T值(每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数)与RNA2577-A浓度对数值的线性关系曲线，结果如图3所示，并由此曲线公式计算出HeLa细胞中MALAT1的2577位点A的量。

从图2可以看出，随着RNA2577-A浓度的增加PCR反应速度逐渐加快，也就是说随着RNA2577-A浓度的增加，基于连接反应产生的PCR聚合产物越多，且不同浓度梯度之间可以相互区分，同时，从图3可以看出，C_T值与RNA2577-A浓度的对数值呈现良好的线性关系，线性相关方程式为C_T＝-8.65-3.07lgC_RNA2577-A，相关系数R²＝0.998。据此线性相关方程可以计算出85ng>+RNA中MALAT1的2577位点A的量为0.721amol。

4、在MALAT1的2577位点附近选择一个不含m⁶A的2488A位点作为参比位点，根据含有MALAT1的2488位点的RNA序列(RNA2488-A)5'-UAGAAGAAUUUGGAAGGCCUUAAAUAUAGUAGCUUAGUUUGAAAAAUGUGAAGG-3'(画下划线的碱基是2488位点，此碱基只能为A)设计合成左探针(Ligase>4ATATTTAAGG-3'(画下划线的部分为检测识别区、斜体部分为PCR引物区，由宝生物工程(大连)有限公司提供)；Ligase R1的碱基序列为5'-AACTAAGCTArCrU-3'(画下划线的部分为检测识别区、斜体部分为PCR引物区，由宝生物工程(大连)有限公司提供)。

5、在200μL离心管中加入1.0μL水、1.0μL 200nM Ligase L1水溶液和1.0μL 200nMLigase R1水溶液、1μL5×的T3 DNA连接酶反应缓冲溶液(330mM Tris-HCl、50mM MgCl₂、5mM二硫苏糖醇、5mM腺嘌呤核苷三磷酸、37.5％聚乙二醇PEG6000，pH＝7.6，25℃)、1.0μL不同浓度RNA2488-A水溶液或1.0μL>+RNA水溶液(同时作空白对比实验，空白是加入1.0μL水来代替RNA2488-A)，混合均匀，作为溶液A′。在200μL离心管中加入3.9μL水、1μL>2、5mM二硫苏糖醇、5mM腺嘌呤核苷三磷酸，pH＝7.6，25℃)、0.1μL>

6、取步骤5中2.0μL连接反应产物加入到8.0μL PCR反应混合溶液中进行PCR反应，其中PCR反应混合溶液与步骤3中相同，混合均匀后立刻放到Step One实时定量PCR系统中(Applied Biosystems，美国)，在94℃下加热2min，然后进行45个热循环，每个热循环94℃20s、60℃30s；同步监测荧光信号，间隔1个循环采集一次实时荧光强度信号，结果如图4所示。根据RNA2488-A的实时荧光曲线，绘制检测RNA2488-A的C_T值(每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数)与RNA2488-A浓度对数值的线性关系曲线，结果如图5所示，并由此曲线公式计算出HeLa细胞中MALAT1的2488位点A的量。

从图4中可以看出，随着RNA2488-A浓度的增加PCR反应速度逐渐加快，也就是说随着RNA2488-A浓度的增加，基于连接反应产生的PCR聚合产物越多，且不同浓度梯度之间可以相互区分，同时，从图5中可以看出，C_T值与RNA2488-A的浓度的对数值呈现良好的线性关系，线性相关方程式为C_T＝-6.95-3.22lgC_RNA2488-A，相关系数R²＝0.997。据此线性相关方程可以计算出85ng>+RNA中MALAT1的2488位点含A的量为3.79amol。

7、根据步骤6计算出的HeLa>+RNA中MALAT1的2488位点A的含量(3.79amol)减去步骤3计算出的HeLa>+RNA中MALAT1的2577位点A的含量(0.721amol)，得到2577位点m⁶A的含量为3.07amol，2577位点m⁶A的含量除以2577位点A和m⁶A的总和，得到HeLapoly>+RNA中MALAT1的m⁶A的百分比含量为80.9％。

实施例2

T3 DNA连接酶在检测HCT116细胞中长非编码RNA(lncRNA，MALAT1)2577位点m⁶A含量的应用，具体检测方法如下：

利用实施例1中针对RNA2577-A设计的探针Ligase L2和Ligase R2检测HCT116细胞中长非编码RNA(lncRNA，MALAT1)2577位点A含量，检测方法是用106ng/μL HCT116的polyA⁺RNA替代HeLa的poly>+RNA，其他实验步骤与实施例1相同，并分别测量其实时荧光曲线，检测结果如图6所示。根据RNA2577-A的实时荧光曲线，绘制检测RNA2577-A的C_T值(每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数)与RNA2577-A浓度对数值的线性关系曲线，结果如图7所示，并由此曲线公式计算出HCT116细胞中MALAT1的2577位点腺嘌呤(A)的量。

从图6中可以看出，随着RNA2577-A浓度的增加PCR反应速度逐渐加快，也就是说随着RNA2577-A浓度的增加，基于连接反应产生的PCR聚合产物越多，且不同浓度梯度之间可以相互区分，同时，从图7中可以看出，C_T值与RNA2577-A的浓度的对数值呈现良好的线性关系，线性相关方程式为C_T＝-9.22-3.07lgC_RNA2577-A，相关系数R²＝0.998。据此线性相关方程可以计算出106ng/μL HCT116poly>+RNA中MALAT1的2577位点含A的量为0.605amol。

利用实施例1中针对RNA2488-A设计的探针Ligase L1和Ligase R1检测HCT116细胞中长非编码RNA(lncRNA，MALAT1)2488位点A含量，检测方法是用106ng/μL HCT116的polyA⁺RNA替代HeLa的poly>+RNA，其他实验步骤与实施例1相同，并分别测量其实时荧光曲线，结果如图8所示。根据RNA2488-A的实时荧光曲线，绘制检测RNA2488-A的C_T值(每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数)与RNA2488-A浓度对数值的线性关系曲线，结果如图9所示，并由此曲线公式计算出HCT116细胞中MALAT1的2488位点A的量。

从图8中可以看出，随着RNA2488-A浓度的增加PCR反应速度逐渐加快，也就是说随着RNA2488-A浓度的增加，基于连接反应产生的PCR聚合产物越多，且不同浓度梯度之间可以相互区分，同时，从图9中可以看出，C_T值与RNA2488-A的浓度的对数值呈现良好的线性关系，线性相关方程式为C_T＝-7.42-3.13lgC_RNA2488-A，相关系数R²＝0.997。据此线性相关方程可以计算出106ng HCT116poly>+RNA中MALAT1的2488位点含A的量为1.59amol。

根据计算出的2488位点A的含量(1.59 amol)减去计算出的2577位点A的含量(0.605amol)，得到2577位点m⁶A的含量为0.985amol，2577位点m⁶A的含量除以2577位点A和m⁶A的总和，得到HCT116细胞中MALAT1的2577位点m⁶A的百分比含量为61.9％。

为了证明T3 DNA连接酶和T4 RNA连接酶2能用于检测特定位点m⁶A的含量，发明人进行了大量的实验室研究试验，试验原理如图10所示，具体试验情况如下：

1、3'端修饰两个RNA碱基的DNA探针作为右探针时，用T3 DNA连接酶区分m⁶A和A

(1)根据含有MALAT1的2577位点的RNA序列5'-CUUAAUGUUUUUGCAUUGGACUUUGAGUUAAGAUUAUUUUUUAAAUCCUGAGGACUAGCAUUAAUUGAC-3'(RNA2577-A，画下划线的碱基是2577位点)和5'-CUUAAUGUUUUUGCAUUGGm⁶ACUUUGAGUUAAGAUUAUUUUUUAAAUCCUGAGGACUAGCAUUAAUUGAC-3'(RNA2577-m⁶A，画下划线的碱基是2577位点)设计合成左探针(Ligase>4CCAATGCAAAAA-3'(画下划线的部分为检测识别区、斜体部分为PCR引物区，由宝生物工程(大连)有限公司提供)；Ligase R2的序列为5'-CCTTAACTCAAArGrU-3'(画下划线的部分为检测识别区、斜体部分为PCR引物区，由宝生物工程(大连)有限公司提供)。

(2)在200μL离心管中加入1.0μL水、1.0μL 200nM Ligase L2水溶液和1.0μL200nM Ligase R2水溶液、1.0μL 5×的T3 DNA连接酶反应缓冲溶液(330mM Tris-HCl、50mMMgCl₂、5mM二硫苏糖醇、5mM腺嘌呤核苷三磷酸，37.5％聚乙二醇PEG6000，pH＝7.6，25℃)、1.0μL>6A水溶液(同时作空白对比实验，空白是加入水来代替RNA2577-A水溶液或RNA2577-m⁶A水溶液)，混合均匀，作为溶液A。在200μL离心管中加入3.9μL水、1.0μL>2、5mM二硫苏糖醇、5mM腺嘌呤核苷三磷酸，pH＝7.6，25℃)、0.1μL>6A与Ligase>6A充分杂交，再向溶液A中加入溶液B，35℃孵育15min进行连接反应，反应结束后立即放在冰上。

(3)取步骤(2)中2.0μL连接反应产物加入到8.0μL聚合酶链式反应(PCR)混合溶液中进行PCR反应，其中PCR反应混合溶液由5.2μL灭菌水、0.2μL 2.5unit/μL JumpStart^TMTaq>TM>2，0.01％(w/v)明胶)、1.0μL>

从图11中可以看出，RNA2577-A和RNA2577-m⁶A的浓度相同时，RNA2577-A和RNA2577-m⁶A的C_T相差5.0个循环数，也就说明了基于RNA2577-m⁶A产生的PCR聚合产物要比基于RNA2577-A产生的PCR聚合产物少。从图12中可以看出，基于RNA2577-m⁶A产生的PCR聚合产物比基于RNA2577-A产生的PCR聚合产物少，假设基于RNA2577-A产生的PCR聚合产物的量为100％，基于RNA2577-m⁶A产生的PCR聚合产物的量大约为2.56％。这证明T3>6A敏感，m⁶A可以基本完全抑制T3>

2、DNA探针作为右探针时，用T3 DNA连接酶区分m⁶A和A

将上述试验1中的Ligase R2替换为Ligase R2-D(碱基序列为5'-CTTAACTCAAAGT-3')，200pM>6A水溶液替换为20nM>6A水溶液。用T3>6A，实时荧光强度信号结果如图13所示，把PCR聚合产物进行凝胶电泳分析，结果如图14所示。

从图13中可以看出，RNA2577-A和RNA2577-m⁶A的浓度相同时，RNA2577-A和RNA2577-m⁶A的C_T相差3.6个循环数，也就说明了基于RNA2577-m⁶A产生的PCR聚合产物要比基于RNA2577-A产生的PCR聚合产物少。从图14中可以看出，基于RNA2577-m⁶A产生的PCR聚合产物比基于RNA2577-A产生的PCR聚合产物少，假设基于RNA2577-A产生的PCR聚合产物的量为100％，基于RNA2577-m⁶A产生的PCR聚合产物的量大约为24.5％。这证明当右探针完全为DNA时，T3>6A具有一定的敏感，m⁶A可以大部分抑制T3>

3、3'端修饰两个RNA碱基的DNA探针作为右探针时，用T4 RNA连接酶2区分m⁶A和A

将上述试验1中的T3 DNA连接酶替换为T4 RNA连接酶2，5×的T3 DNA连接酶缓冲溶液替换为5×的T4 RNA连接酶2缓冲溶液(250mM Tris-HCl、10mM MgCl₂、5mM二硫苏糖醇、2mM腺嘌呤核苷三磷酸，pH＝75，25℃)，连接反应条件为37℃孵育30min，200pM RNA2577-A水溶液替换为20nM RNA2577-A水溶液；200pM>6A水溶液替换为20nM>6A水溶液。其他步骤与试验1相同，实时荧光强度信号结果如图15所示，把PCR聚合产物进行凝胶电泳分析，结果如图16所示。

从图15中可以看出，RNA2577-A和RNA2577-m⁶A的浓度相同时，RNA2577-A和RNA2577-m⁶A的C_T相差2.4个循环数，也就说明了基于RNA2577-m⁶A产生的PCR聚合产物要比基于RNA2577-A产生的PCR聚合产物少。从图16中可以看出，基于RNA2577-m⁶A产生的PCR聚合产物比基于RNA2577-A产生的PCR聚合产物少，假设基于RNA2577-A产生的PCR聚合产物的量为100％，基于RNA2577-m⁶A产生的PCR聚合产物的量大约为30.5％。这证明当右探针为Ligase>6A具有一定的敏感，m⁶A可以大部分抑制T4>

4、DNA探针作为右探针时，用T4 RNA连接酶2区分m⁶A和A

将上述试验3中的Ligase R2替换为Ligase R2-D(碱基序列为5'-CTTAACTCAAAGT-3')，用T4>6A，实时荧光强度信号结果如图17所示，把PCR聚合产物进行凝胶电泳分析，结果如图18所示。

从图17中可以看出，RNA2577-A和RNA2577-m⁶A的浓度相同时，RNA2577-A和RNA2577-m⁶A的C_T相差2.3个循环数，也就说明了基于RNA2577-m⁶A产生的PCR聚合产物要比基于RNA2577-A产生的PCR聚合产物少。从图18中可以看出，基于RNA2577-m⁶A产生的PCR聚合产物比基于RNA2577-A产生的PCR聚合产物少，假设基于RNA2577-A产生的PCR聚合产物的量为100％，基于RNA2577-m⁶A产生的PCR聚合产物的量大约为32.1％。这证明当右探针为Ligase>6A具有一定的敏感，m⁶A可以大部分抑制T4>

核 苷 酸 或 氨 基 酸 序 列 表

[0001]

序 列 表

<110> 陕西师范大学

<120> T3 DNA连接酶和T4 RNA连接酶2在检测N6甲基腺嘌呤中的应用

<160> 12

<210> 1

<211> 69

<212> RNA

<213> 人工序列

<221> misc_feature

<223> RNA 2577-A序列

<400> 1

CUUAAUGUUUUUGCAUUGGACUUUGAGUUAAGAUUAUUUUUUAAAUCCUGAGGACUAGCAUUAAUUGAC 69

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> misc_feature

<223> 根据待测RNA 2577-A序列设计的探针Ligase L2，以用作连接反应构建DNA模板

<400> 2

CCAATGCAAAAACTCTATGGGCAGTCGGTGAT 32

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> misc_feature

<223> 根据待测RNA 2577-A序列设计的探针Ligase R2，以用作连接反应构建DNA模板

<400> 3

CCATCTCATCCCTGCGTGTCCTTAACTCAAArGrU 33

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> misc_feature

<223> FP，作为聚合酶链式反应（PCR）扩增反应正向引物

<400> 4

CCATCTCATCCCTGCGTGTC 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> misc_feature

<223> RP，作为聚合酶链式反应（PCR）扩增反应反向引物

<400> 5

ATCACCGACTGCCCATAGAG 20

<210> 6

<211> 54

<212> RNA

<213> 人工序列

<221> misc_feature

<223>RNA 2488-A序列

<400> 6

UAGAAGAAUUUGGAAGGCCUUAAAUAUAGUAGCUUAGUUUGAAAAAUGUGAAGG 54

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> misc_feature

<223> 根据待测RNA 2488-A序列设计的探针Ligase L1，以用作连接反应构建DNA模板

<400> 7

ATATTTAAGGCTCTATGGGCAGTCGGTGAT 30

<210> 8

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> misc_feature

<223> 根据待测RNA 2488-A序列设计的探针Ligase R1，以用作连接反应构建DNA模板

<400> 8

CCATCTCATCCCTGCGTGTCAACTAAGCTArCrU 32

<210> 9

<211> 69

<212> RNA

<213> 人工序列

<221> misc_feature

<223> RNA 2577-m6A序列

<400> 9

CUUAAUGUUUUUGCAUUGGm6ACUUUGAGUUAAGAUUAUUUUUUAAAUCCUGAGGACUAGCAUUAAUUGAC 69

<210> 10

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> misc_feature

<223> 根据待测RNA 2577-A序列设计的探针Ligase R2-D，以用作连接反应构建DNA模板

<400> 10

CCATCTCATCCCTGCGTGTCCTTAACTCAAAGT 33