在乳腺癌细胞中利用siRNA文库筛选调控Notch3泛素化降解的E3连接酶的研究：Cdh1是潜在的E3连接酶

摘要

背景
　　Notch信号通路作为一条非常保守的调控通路，与细胞的生长发育息息相关。当Notch信号通路被激活时，可启动一系列的级联反应，影响并调控Notch下游基因转录。该信号通路的下调和缺失将导致一系列疾病，其中包括乳腺癌。目前已知乳腺癌的发生发展与癌症相关蛋白的异常泛素化修饰密切相关，该过程可能参与Notch信号通路中受体和配体的相互作用。基于此，本研究选用一个基于siRNA文库的筛选流程，应用具有Notch信号通路活性的报告基因，尝试研究MCF-7乳腺癌细胞中Notch蛋白的泛素化降解体系。
　　材料和方法
　　首先利用蛋白合成抑制剂放线菌酮（CHX）处理 MCF-7乳腺癌细胞，观察细胞内Notch3蛋白的半衰期。Notch3蛋白的聚集实验通过两种蛋白降解体系的特异抑制剂（包括蛋白酶体抑制剂MG132、溶酶体抑制剂NH4Cl）来实现。进一步，我们在细胞水平上建立含4×CSL-luc报告基因的稳定筛选体系，利用荧光素酶的活性来反映Notch信号通路，以此反应Notch蛋白（以Notch3为例）水平的改变。当逐一靶向干扰E3泛素连接酶的siRNA文库时，降解相关E3就会因阻断而使Notch3蛋白聚集。在初筛结果中我们选取Cdh1基因，通过使用蛋白印迹、实时荧光定量及细胞免疫荧光技术，检测在乳腺癌MCF-7细胞株中高表达Cdh1后 Notch3的变化水平及两者共定位情况。最后，我们通过免疫共沉淀法，验证这两种分子是否存在结构上的相互作用。
　　结果
　　本研究发现泛素化修饰途径参与MCF-7乳腺癌细胞中Notch3蛋白的降解。应用具有Notch信号通路活性的报告基因（4×CSL-luciferase），对33个人类泛素连接酶进行siRNA筛查，获得10个可能影响Notch降解的备选基因。其中Cdh1与Notch3的蛋白含量在翻译后水平呈负相关关系，证实Notch3可能是APC/C泛素连接酶Cdh1的新的降解底物。同时，蛋白酶体抑制剂MG132可有效抑制Cdh1引起的Notch3减少。此外，免疫共沉淀结果提示在MCF-7细胞株中内源性的Cdh1与Notch3存在相互作用关系。
　　总结
　　本研究利用siRNA文库和4×CSL-luciferase报告基因筛选出E3泛素连接酶Cdh1，证实 Cdh1能介导 MCF-7乳腺癌细胞中 Notch3蛋白的降解。进一步试验发现 Cdh1和Notch3在细胞内存在相互作用。

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第一章 前言

1.1 国内外研究现状

1.2 本课题的来源及研究目的

1.3 本研究的技术路线

第二章 材料与方法

2.1所用细胞株及培养条件

2.2 质粒 DNA 的转化、小提、大提

2.3 Western Blot（蛋白质免疫印迹实验）

2.4 实时荧光定量 PCR

2.5 细胞免疫荧光实验

2.6 细胞瞬时转染质粒、干扰基因，构建稳定转染细胞株

2.7 siRNA文库筛选实验

2.8 荧光素酶活性检测

2.9 蛋白半衰期测定实验

2.10 蛋白聚集实验

2.11 免疫共沉淀（Co-IP）

2.12 统计学处理

2.13 主要试剂

2.14 主要仪器及耗材

第三章 结果与分析

3.1 泛素-蛋白酶体系统参与乳腺癌MCF-7细胞中Notch3蛋白的降解

3.2 建立灵敏反应Notch含量的荧光素酶报告基因系统

3.3 利用 RNAi 文库筛选 MCF-7 中影响 Notch3 降解的 E3 泛素连接酶

3.4 E3泛素连接酶Cdh1参与MCF-7细胞中Notch3泛素化降解

第四章 讨论

第五章 结论与展望

本研究主要结论

本研究的问题与不足

展望

参考文献

综述: RNA干扰高通量筛选技术在乳腺癌研究领域的应用

致谢

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