插入/缺失多态性位点在检测不明原因猝死试剂盒中的应用

摘要

本发明涉及一种雷诺定受体2基因上rs10692285号插入/缺失多态性位点在检测不明原因猝死中的应用，本发明还公开了一种用于检测不明原因猝死的试剂盒，包括用于检测雷诺定受体2基因上rs10692285号插入/缺失多态性位点的特异性引物对，所述特异性引物对为：有义引物：5’‑GCATGTTTATTATGCAAGTT‑3’；反义引物：5’‑ATACAATTAAGCCCACGA‑3’；或有义引物序列：5’‑CATTCATTGCATGTTTATTATG‑3’；反义引物序列：5’‑CATTATTTCACAGCACCCG‑3’；或有义引物序列：5’‑TAAATGAACAAAGAAAACCTTC‑3’；反义引物序列：5’‑CTCGGTCACAGTAGGTGG‑3’；本发明的试剂盒通过检测分析个体的雷诺定受体2基因上的rs10692285位点基因携带型来预测该个体对不明原因猝死的易感性。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种插入/缺失多态性位点在不明原因猝死检测试剂盒中的应用。

背景技术

猝死是由于机体潜在的疾病或重要器官急性功能障碍导致的意外的突然死亡，在所有自然死亡的人数中猝死约占10％或更多。根据我国疾病猝死资料分析，因心血管疾病引起的猝死大约占50％～60％，居猝死发生率之首，可见心源性猝死的危害之大。此外，尚有一部分猝死病例经过系统尸检及相关的实验室检验均未能发现致死性的病理改变及其他死因，这类猝死通常被归类为不明原因猝死(Sudden unexplained death，SUD)，对于具有这类猝死风险患者的筛选诊断及死因的法医学鉴定已成为一个亟待解决的难题。近年来的科学研究发现此类SUD有很大一部分与离子通道病相关，有证据表明在心脏正常电生理活动中起重要作用的离子通道功能或表达量异常均可诱发心律失常，从而导致此类猝死的发生。

目前针对SUD诊断领域的研究主要集中于对重要蛋白编码基因的编码区突变与猝死的关联性分析，然而有报道的猝死相关基因与位于这些基因上的错义突变数量毕竟有限，并且与之在普通群体中较低的基因频率相比，高之许多的猝死发生率难以完全得到解释。与此同时，全基因组关联研究之类的大数据分析也是猝死研究的热点，尽管一系列研究已经揭示了许多位于编码基因上或毗邻区域的普通多态性也可通过诱发心律失常而产生猝死风险，但这类研究所得到的结果在来自不同样本群体的研究比较中未能得到一个较为统一又具有说服力的结果，并且其结论目前尚未在功能试验中得到验证。

雷诺定受体2(Ryanodine receptor type 2，RYR2)是心肌细胞肌浆网上主要的钙释放通道，主要参与心肌的兴奋收缩耦联过程。研究表明其蛋白功能或表达量异常均可诱导一系列致死性心律失常，因此，其编码基因RYR2基因上的基因突变被认为与SUD的发生存在一定关系。

rs10692285为RYR2基因上的一个插入/缺失多态性位点。现有技术中，并没有对rs10692285插入/缺失多态与SUD相关性的研究报道，也没有通过检测RYR2基因3'UTR的插入/缺失多态位点来预测SUD的易感性的相关报道。

鉴于上述原因，本发明人积极加以研究创新，以期创建一种新型插入/缺失多态性位点在不明原因猝死检测试剂盒中的应用，使其更具有产业上的利用价值。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种插入/缺失多态性位点在不明原因猝死检测试剂盒中的应用，通过检测个体的RYR2基因上的rs10692285号插入/缺失位点的基因型，可以起到预测个体SUD的易感性的作用。

本发明的公开了一种雷诺定受体2基因上rs10692285号插入/缺失多态性位点在检测不明原因猝死中的应用。

本发明还公开了一种用于检测不明原因猝死的试剂盒，其特征在于：包括用于检测雷诺定受体2基因上rs10692285号插入/缺失多态性位点的特异性引物对，特异性引物对为能够特异性扩增出包含rs10692285号插入/缺失多态性位点的DNA片段的上下游核苷酸序列，特异性引物对包括：

有义引物：5’-GCATGTTTATTATGCAAGTT-3’

反义引物：5’-ATACAATTAAGCCCACGA-3’；

或

有义引物序列：5’-CATTCATTGCATGTTTATTATG-3’；

反义引物序列：5’-CATTATTTCACAGCACCCG-3’；

或

有义引物序列：5’-TAAATGAACAAAGAAAACCTTC-3’；

反义引物序列：5’-CTCGGTCACAGTAGGTGG-3’。

进一步的，特异性引物对为能够特异性扩增出包含rs10692285号插入/缺失多态性位点的DNA片段的上下游核苷酸序列。

进一步的，特异性引物对用异硫氰酸荧光素或羧基荧光素标记。

进一步的，特异性引物对的浓度为0.2～1.0μM/μl。

进一步的，试剂盒还包括1U/μL～2.5U/μL耐热DNA聚合酶。

进一步的，耐热DNA聚合酶为Taq DNA聚合酶或Pfu DNA聚合酶。

进一步的，试剂盒还包括2.5mM～10mM脱氧核糖核苷三磷酸和25mM～50mM镁盐。

进一步的，镁盐为氯化镁或硫酸镁。

进一步的，试剂盒还包括5×PCR或10×PCR反应缓冲液和水。

进一步的，有义引物序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.3和SEQ ID No.5所示。

进一步的，有义引物的Tm(解链温度)值为50-52℃。

进一步的，反义引物序列如SEQ ID No.2、SEQ ID No.4和SEQ ID No.6所示。

进一步的，反义引物的Tm值为50-52℃。

进一步的，荧光标记的特异性引物是针对RYR2基因上的rs10692285号插入/缺失位点而设计，能特异性扩增出包含该插入/缺失的片段，通过荧光标记技术将荧光染料标记在寡核苷酸引物的5’端，PCR扩增后产物的一条链均携带标记引物的荧光染料。

进一步的，试剂盒的保存温度为-20℃～-80℃。

进一步的，使用本发明的试剂盒，通过荧光标记PCR扩增及毛细管电泳分型法检测RYR2的rs10692285号插入/缺失多态性位点基因型，能够通过该检测推断当个体携带插入型等位基因时其罹患SUD的风险将显著增高。

本发明的原理为：发明人通过分子生物学研究发现RYR2基因的3'UTR中的一个插入/缺失多态rs10692285的不同等位基因型可影响RYR2基因转录活性，携带插入型等位基因的个体RYR2蛋白的表达相对较高；此外，通过一定规模人群的SUD病例对照研究发现，该插入/缺失多态的插入型等位基因与SUD发生呈正相关，即使在调整年龄、性别等因素后，这种相关性仍然存在，说明RYR2基因的3'UTR中的一个四碱基(AAAC)插入/缺失多态(rs10692285)与患SUD风险性存在显著性关联，因此RYR2基因上的rs10692285号插入/缺失位点的基因型可用于评估个体患SUD的易感性。

借由上述方案，本发明具有以下优点：

公开了RYR2基因上的rs10692285号插入/缺失位点的基因型在评估个体患SUD的易感性中的应用；公开了用于检测不明原因猝死的试剂盒：由于本发明的试剂盒中包含的特异性引物对是针对RYR2基因上的rs10692285号插入/缺失位点而设计，能特异性扩增出包含该位点的DNA片段并通过检测不同长度片段在毛细管电泳中的迁移率来识别不同基因型，结合病例对照研究发现，被检测DNA的RYR2基因上的rs10692285号插入/缺失位点携带有插入型等位基因者为SUD易感型；使用本发明的试剂盒，通过检测个体的RYR2基因上的rs10692285号插入/缺失位点的基因型，本发明的试剂盒可以用于预测个体SUD的易感性。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下为本发明的实施例，并配合附图详细说明如后。

附图说明

图1是本发明对照组与SUD病例组在rs10692285位点的基因频率差异与患病风险OR值；

图2是基因测序图示和SDS-PAGE凝胶电泳分型图示。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

试剂盒包括：荧光标记的用于检测RYR2的rs10692285位点的特异性引物对及普通PCR扩增和毛细管电泳的常规组件。其中，特异性引物对包括有义引物序列和反义引物序列，具体如下所示：

有义引物序列：5’-GCATGTTTATTATGCAAGTT-3’，Tm值为50℃；

反义引物序列：5’-ATACAATTAAGCCCACGA-3’，Tm值为51℃。

普通PCR扩增和毛细管电泳的常规组件包括：2.5U/μL的Taq DNA聚合酶、2.5mM的dNTP、25mM的MgCl₂溶液、10×PCR反应缓冲液和去离子水。

本发明的试剂盒的使用步骤如下：

步骤1：DNA模板的抽取

使用血液基因组DNA提取系统提取外周血的基因组DNA，本实施例以QIAamp DNAMini Kit提取血液样本DNA试剂盒，其操作步骤如下：

1、于1.5mL离心管底部加入20μL QIAGEN Protease，然后加入200μL血浆，再加入200μL Buffer AL，振荡15s，56℃下水浴反应10min，DNA产量在此过程中达到最大值，离心，以去除离心管盖内沿液体。

2、向离心管中加入200μL乙醇(96％-100％)，振荡15s，离心，以去除离心管盖内沿液体，得到混合液。

3、将以上所得混合液加入QIAamp Mini spin column中，将离心柱放入2mL收集管中，盖紧离心管盖，以6000×g(8000rpm)离心1min。然后将离心管取出，放入一支洁净的2mL收集管中。

4、向QIAamp Mini spin column中加入500μL Buffer AW1。盖紧离心管盖，以6000×g(8000rpm)离心1min。将离心管取出，放入一支洁净的2mL收集管中。

5、向QIAamp Mini spin column中加入500μL Buffer AW2，盖紧离心管盖，以20000×g(14000rpm)离心3min。

6、将QIAamp Mini spin column置入一支洁净1.5mL收集管中，在QIAamp Minispin column中加入200μL Buffer AE或蒸馏水，室温下(15-25℃)静置1min，6000×g(8000rpm)离心1min，将收集管盖好，保存于-20℃。

步骤2：PCR反应-目的片段的复制

使用本发明的试剂盒进行PCR反应，其中试剂盒中的引物对可特异性地扩增RYR2基因中包含rs10692285号插入/缺失位点多态性的片段。

PCR反应体系总体积为10uL，其中包括：1uL DNA模板；50μM特异性引物对两条，各0.04μl，特异性引物对用异硫氰酸荧光素标记；2.5U/uL的Taq DNA聚合酶0.08μl；2.5mMdNTP 0.2uL；25mM MgCl₂溶液0.6uL；10×PCR反应缓冲液1uL；余量为去离子水。在Eppendorf>

步骤3：RYR2基因插入/缺失基因型分析

采用ABI 3500基因测序仪对PCR扩增的产物进行毛细管电泳分离，分析检测个体的RYR2的rs10692285位点的基因型。

图1为对照组与SUD病例组在该位点的基因频率差异与患病风险OR值，从图中可以看出rs10692285与患SUD风险性存在显著性关联，携带插入型等位基因的个体患SUD的风险显著升高(OR值＝2.03；95％置信区间＝1.08-3.77；P值＝0.0161)，说明对于该位点的基因型分析有助于为SUD的诊断和防治提供分子遗传学方面的支持和帮助，具体来说，即本发明的雷诺定受体2基因上rs10692285号插入/缺失多态性位点能够用于检测不明原因猝死。

图2为基因测序和SDS-PAGE凝胶电泳分型图示。其中图2A为模板链测序结果，下划线处对应编码链在rs10692285处的四碱基插入/缺失；图2B为对14个来自不同个体的DNA样本使用本发明的PCR扩增体系得到的产物电泳示意图，其中，1、3、7、11、14为缺失型纯合子，8为插入型纯合子，其余为杂合子。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。