检测小麦中顶芒山羊草2M、3M、6M和7M染色体的特异分子标记、试剂盒及方法

摘要

本发明涉及分子生物学领域，特别涉及检测小麦中顶芒山羊草2M、3M、6M和7M染色体的特异分子标记，分别如序列表中SEQ ID No.1和‑18所示的DNA碱基序列。将待检染色体样品与特异分子标记组合物或者放入试剂盒中进行扩增。在检测或辅助检测小麦是否含有顶芒山羊草2M、3M、6M和7M染色体。本发明对涉及顶芒山羊草2M、3M、6M和7M染色体的小麦‑顶芒山羊草远缘杂交新种质的筛选与鉴定提供了有效的检测手段；对以染色体片段的方式向小麦转移顶芒山羊草2M、3M、6M和7M染色体上的优异基因提供了检测方法，具有积极的产业化价值。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别涉及检测小麦中顶芒山羊草2M、3M、6M和7M染色体的特异分子标记，还涉及含有此特异分子标记的试剂盒，及检测小麦中顶芒山羊草2M、3M、6M和7M染色体的方法。

背景技术

顶芒山羊草(Aegilops comosa，2n＝2x＝14，基因组MM)，高抗小麦条锈病、叶锈病、秆锈病和白粉病等多种病害(Friebe B,Jiang JM,Raupp WJ,et al.Characterization of wheat-alientranslocations conferring resistance to diseases and pests:current status.Euphytica,1996,91:59-87；Gill BS,Sharma HC,Raupp WJ,et al.Evaluation of Aegilops species for resistance towheat powdery mildew,wheat leaf rust,Hessian fly and greenbug.Plant Dis,1985,69:314-316)，是小麦育种的优异基因源。自上个世纪60年代开始，英国的Riley课题组、Miller课题组和中国的董玉琛课题组分别开展了顶芒山羊草与小麦的远缘杂交工作，除此之外，未见其他的系统开展小麦-顶芒山羊草远缘杂交工作的研究。上述三个课题组均将顶芒山羊草种质转移给了小麦，分别获得了一批小麦-顶芒山羊草远缘杂交种质资源。

获得小麦远缘杂交种质资源之后，从分子、细胞和生物化学等水平上对其精确鉴定是染色体工程育种非常重要的前期工作。在小麦中顶芒山羊草染色体鉴定方面，Friebe等建立了顶芒山羊草染色体标准C分带，然而不同来源的顶芒山羊草染色体带纹还有差异{Friebe等，Standard karyotypes of Aegilops uniaristata,Ae.mutica,Ae.comosa subspecies comosa andheldreichii(Poaceae).Plant Systematics and Evolution,1996,202:199-210}。Nasuda等和翁跃进等分别建立顶芒山羊草2M染色体、1M-7M染色体限制性长度多态性(RFLP)标记{Nasuda等，Structural rearrangement in chromosome 2M of Aegilops comosa has prevented the utilization ofthe Compair and related wheat-Ae.comosa translocations in wheat improvement.Theor ApplGenet,1998,96:780-785。翁跃进等，利用RFLP分子标记鉴定小麦-顶芒山羊草异代换系，遗传学报,1997,24(3):248-254。翁跃进等，小麦M染色体组的RFLP标记，农业生物技术学报,1997,5(3):211-215)}。Molna′r等建立了顶芒山羊草染色体的流式细胞仪分拣方法{Molna′r等.Chromosome Isolation by flow sorting in Aegilops umbellulata and Ae.comosa and theirallotetraploid hybrids Ae.biuncialis and Ae.geniculata.PLoS ONE,2011,6(11):e27708}。

上述鉴定顶芒山羊草染色体的方法中，染色体C分带操作程序费时费力，所用吉姆萨染液质量、处理温度与时间等不同容易造成结果重复性差；RFLP涉及放射性元素使用且耗时较长；流式细胞仪昂贵且操作步骤繁琐；因而，建立检测小麦中顶芒山羊草染色体的广谱和简易实验方法非常有必要。

鉴于前述研究的不足，我们建立了顶芒山羊草染色体细胞遗传学标记(国家发明专利申请号：201610301879.2，实审中)，该方法可以从细胞遗传学水平上对小麦中顶芒山羊草染色体进行有效鉴定。然而，分子生物学水平的鉴定方法还非常缺乏。

发明内容

为了解决目前现有技术中没有顶芒山羊草染色体PCR标记的问题，本发明提供了一种能够快捷、有效、简便地鉴定待测样本中是否含有顶芒山羊草2M、3M、6M和7M染色体的特异分子标记。

本申请还提供了含有上述特异分子标记的试剂盒。

本发明的另一个目的是提供一种小麦中顶芒山羊草2M、3M、6M和7M染色体的分子检测方法，将建立的分子标记应用于小麦-顶芒山羊草杂交后代的筛选与鉴定工作。

本发明是通过以下步骤得到的：

我们的前期实验发现，顶芒山羊草2M和7M染色体上分别含有抗小麦条锈病和白粉病新基因，3M和6M染色体导入小麦后在特定生态环境下可分别显著提高小麦分蘖力和千粒重，因此，本发明从分子水平上建立了可以有效识别小麦中顶芒山羊草(2M、3M、6M和7M)染色体的鉴定方法，对涉及顶芒山羊草2M、3M、6M和7M染色体的小麦-顶芒山羊草杂交后代的鉴定结果显示，本研究建立的分子检测方法可以广泛应用于涉及顶芒山羊草2M、3M、6M和7M染色体的小麦-顶芒山羊草育种新种质的筛选与鉴定工作。

(1)以顶芒山羊草、中国春-顶芒山羊草双二倍体、中国春、小麦品种济麦22和济南17为材料，设计并筛选染色体第二、三、六和七同源群PLUG引物。从中筛选能在顶芒山羊草和中国春-顶芒山羊草双二倍体中扩增出额外多态性条带的引物(相比中国春、小麦品种济麦22和济南17)。

(2)用上述筛选出的引物，扩增中国春-顶芒山羊草双二倍体、中国春、中国春-卵穗山羊草1M^g附加系、中国春-顶芒山羊草2M附加系、中国春-顶芒山羊草3M附加系、中国春-顶芒山羊草4M附加系、中国春-顶芒山羊草5M附加系、中国春-顶芒山羊草6M附加系、中国春-顶芒山羊草6M(6A)代换系和中国春-顶芒山羊草7M附加系，将上述所获来自顶芒山羊草的额外多态性条带(相比中国春、小麦品种济麦22和济南17)定位在1M-7M某条或某几条染色体上。

(3)用上述筛选出的引物，对相应附加系/小麦杂交后代进行扩增，验证多态性标记的应用可行性。

检测小麦中顶芒山羊草2M、3M、6M和7M染色体的特异分子标记，为顶芒山羊草2M、3M、6M和7M染色体的特异分子标记组成的特异分子标记组合物，其中顶芒山羊草2M染色体的特异分子标记为CD913720-PLUG或CK171581-PLUG；顶芒山羊草3M染色体的特异分子标记为CD491237-PLUG或CK207576-PLUG；顶芒山羊草6M染色体的特异分子标记为CK168221-PLUG或CK206466-PLUG；顶芒山羊草7M染色体的特异分子标记为CK214770-PLUG或CK203272-PLUG；

所述标记CD913720-PLUG对应引物由序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的两条单链DNA组成；

所述标记CK171581-PLUG对应引物由序列表中SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的两条单链DNA组成；

所述标记CD491237-PLUG对应引物由序列表中SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的两条单链DNA组成；

所述标记CK207576-PLUG对应引物由序列表中SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的两条单链DNA组成；

所述标记CK168221-PLUG对应引物由序列表中SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示的两条单链DNA组成；

所述标记CK206466-PLUG对应引物由序列表中SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示的两条单链DNA组成；

所述标记CK214770-PLUG对应引物由序列表中SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示的两条单链DNA组成；

所述标记CK203272-PLUG对应引物由序列表中SEQ ID No.15和SEQ ID No.16所示的两条单链DNA组成。

检测小麦中顶芒山羊草2M、3M、6M和7M染色体的试剂盒，含有上述顶芒山羊草2M、3M、6M和7M染色体的特异分子标记组成的特异分子标记组合物。

检测小麦中顶芒山羊草2M、3M、6M和7M染色体的方法，将待检染色体样品与特异分子标记组合物或者放入试剂盒中进行扩增，扩增产物使用电泳检测。

若扩增产物中含有900bp或660bp多态性条带，则待检染色体样品中含有顶芒山羊草2M染色体；

若扩增产物中含有780bp或1700bp多态性条带，则待检染色体样品中含有顶芒山羊草3M染色体；

若扩增产物中含有710bp或650bp多态性条带，则待检染色体样品中含有顶芒山羊草6M染色体；

若扩增产物中含有1200bp或770bp多态性条带，则待检染色体样品中含有顶芒山羊草7M染色体。

优选扩增反应体系为15μL，包括25ng/μL的样品DNA 1μL，5U/μL Taq DNApolymerase 0.15μL，200μM的dNTPs，含Mg²⁺的10×PCR>

优选2M、3M、6M和7M染色体的特异分子标记的比例为1:1:1:1。

优选扩增程序为：94℃预变性3min，随后35个循环：94℃变性45S，57℃退火45S，72℃延伸2min，最后72℃延伸10min，4℃保存。

所述的特异分子标记或者所述的试剂盒在小麦育种中的应用。

所述的特异分子标记或者所述的试剂盒在检测或辅助检测小麦是否含有顶芒山羊草2M、3M、6M和7M染色体中的应用。

本发明的有益效果：

(1)本发明建立了顶芒山羊草2M、3M、6M和7M染色体标记，提供了检测小麦背景中顶芒山羊草2M、3M、6M和7M染色体的新方法；

(2)本发明建立的染色体特异分子标记，对涉及顶芒山羊草2M、3M、6M和7M染色体的小麦-顶芒山羊草远缘杂交新种质的筛选与鉴定提供了有效的检测手段；

(3)本发明建立的染色体特异分子标记，对以染色体片段的方式向小麦转移顶芒山羊草2M、3M、6M和7M染色体上的优异基因(如小麦条锈病和白粉病抗病基因等)提供了检测方法，具有积极的产业化价值。

附图说明

图1.引物CD913720(A)、CK171581(B)、CD491237(C)、CK207576(D)、CK168221(E)、CK206466(F)、CK214770(G)和CK203272(H)的扩增结果；

注：M为Marker，分子量大小依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp，A-H中泳道1-5分别代表顶芒山羊草、中国春-顶芒山羊草双二倍体、中国春、小麦品种济麦22和济南17；

图2.引物CD913720(A)、CK171581(B)、CD491237(C)、CK207576(D)、CK168221(E)、CK206466(F)、CK214770(G)和CK203272(H)的扩增结果；

注：M为Marker，分子量大小依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp，A-H中泳道1-10分别代表中国春-顶芒山羊草双二倍体、中国春、中国春-卵穗山羊草1M^g附加系、中国春-顶芒山羊草2M附加系、中国春-顶芒山羊草3M附加系、中国春-顶芒山羊草4M附加系、中国春-顶芒山羊草5M附加系、中国春-顶芒山羊草6M附加系、中国春-顶芒山羊草6M(6A)代换系和中国春-顶芒山羊草7M附加系；

图3.引物CD913720(A)、CK171581(B)、CD491237(C)、CK207576(D)、CK168221(E)、CK206466(F)、CK214770(G)和CK203272(H)的扩增结果；

注：M为Marker，分子量大小依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp，A中泳道1-24分别代表顶芒山羊草、中国春-顶芒山羊草2M附加系、中国春、中国春-顶芒山羊草2M附加系/中国春杂交后代P1-P21；B中泳道1-24分别代表顶芒山羊草、中国春-顶芒山羊草2M附加系、中国春、中国春-顶芒山羊草3M附加系/中国春杂交后代P22-P42；C中泳道1-24分别代表顶芒山羊草、中国春-顶芒山羊草3M附加系、中国春、中国春-顶芒山羊草3M附加系/中国春杂交后代Q1-Q21；D中泳道1-24分别代表顶芒山羊草、中国春-顶芒山羊草3M附加系、中国春、中国春-顶芒山羊草2M附加系/中国春杂交后代Q22-Q42；E中泳道1-24分别代表顶芒山羊草、中国春-顶芒山羊草6M附加系、中国春、中国春-顶芒山羊草6M附加系/中国春杂交后代R1-R21；F中泳道1-24分别代表顶芒山羊草、中国春-顶芒山羊草6M附加系、中国春、中国春-顶芒山羊草6M附加系/中国春杂交后代R22-R42；G中泳道1-24分别代表顶芒山羊草、中国春-顶芒山羊草7M附加系、中国春、中国春-顶芒山羊草7M附加系/中国春杂交后代S1-S21；H中泳道1-24分别代表顶芒山羊草、中国春-顶芒山羊草7M附加系、中国春、中国春-顶芒山羊草7M附加系/中国春杂交后代S22-S42。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明：

实验材料

所用PLUG引物根据小麦EST定位工程网(http://wheat.pw.usda.gov/NSF/data.html)提交的EST序列设计，引物合成由成都瑞信生物公司完成。

顶芒山羊草(TA1967)和中国春-卵穗山羊草1M^g附加系(TA7655)由美国堪萨斯州立大学小麦基因组学与遗传资源中心Raupp>1经加倍获得，公众可从山东省农业科学院作物研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。中国春-顶芒山羊草2M附加系、中国春-顶芒山羊草3M附加系、中国春-顶芒山羊草4M附加系、中国春-顶芒山羊草5M附加系、中国春-顶芒山羊草6M附加系、中国春-顶芒山羊草6M(6A)代换系和中国春-顶芒山羊草7M附加系由英国约翰英纳斯中心的Reader>2后代材料；Q1-Q41是中国春-顶芒山羊草3M附加系/中国春杂交F₂后代材料；R1-R41是中国春-顶芒山羊草6M附加系/中国春杂交F₂后代材料；S1-S41是中国春-顶芒山羊草7M附加系/中国春杂交F₂后代材料。

实验方法

PLUG引物扩增反应体系为15μL，包括25ng/μL的模板DNA 1μL，5U/μL Taq DNApolymerase(申能博彩公司)0.15μL，200μM的dNTPs(博奥公司)，含Mg²⁺的10×PCR>

PCR反应在BIO-RAD PCR扩增仪上进行，扩增程序为：94℃预变性3min，随后35个循环：94℃变性45S，57℃退火45S，72℃延伸2min，最后72℃延伸10min，4℃保存。扩增产物进行2％的琼脂凝胶上电泳，电泳缓冲液为1×TAE。扩增产物10ul在150V恒压下电泳约25min，然后用1ug/mL的溴化乙锭溶液进行染色30min，最后在GDS-Gel Dol 2000紫外凝胶成像系统下扫描照像。

实施例1

以顶芒山羊草、中国春-顶芒山羊草双二倍体、中国春、小麦品种济麦22和济南17为材料，设计和筛选染色体第二、三、六和七同源群PLUG引物41对、84对、53对和73对，扩增产物分别用限制性内切酶HaeIII和TaqI进行酶切，将来自同一引物的PCR扩增产物(未酶切、HaeIII酶切和TaqI酶切三种情况)进行琼脂糖凝胶电泳，结果发现染色体第二同源群的CD913720(图1A)和CK171581(图1B)、染色体第三同源群的CD491237(图1C)和CK207576(图1D)、染色体第六同源群的CK168221(图1E)和CK206466(图1F)、染色体第七同源群的CK214770(图1G)和CK203272(图1H)能在顶芒山羊草和中国春-顶芒山羊草双二倍体中扩增出额外多态性条带，这些多态性条带大小分别为900bp、660bp、780bp、1700bp、710bp、650bp、1200bp和770bp(图1A-H中箭头所示)，但是，小麦对照中国春、济麦22和济南17均扩增不出这些条带，说明这些多态性条带来自顶芒山羊草。上述8对引物的序列、所在小麦染色体位置和多态性标记长度等信息见表1。

表1.顶芒山羊草染色体特异分子标记信息

实施例2

截至目前，由于未见有中国春-顶芒山羊草1M附加系被创制的报道，而顶芒山羊草M染色体是卵穗山羊草的M^g染色体的供体，在物种多倍体化和进化过程中可能发生了染色体部分重组或变异，导致卵穗山羊草中来自于顶芒山羊草的染色体与顶芒山羊草M染色体稍有不同，因此，用M^g表示以示区别。因此，在没有中国春-顶芒山羊草1M附加系的情况下，可以用中国春-卵穗山羊草1M^g附加系做标记定位。

为了将上述来自顶芒山羊草的多态性条带定位在顶芒山羊草1M-7M中的某条或某几条染色体上，用上述筛选出的8对PLUG引物对中国春-顶芒山羊草双二倍体、中国春、中国春-卵穗山羊草1M^g附加系、中国春-顶芒山羊草2M附加系、中国春-顶芒山羊草3M附加系、中国春-顶芒山羊草4M附加系、中国春-顶芒山羊草5M附加系、中国春-顶芒山羊草6M附加系、中国春-顶芒山羊草6M(6A)代换系和中国春-顶芒山羊草7M附加系进行扩增，分别获得如下结果：

引物CD913720和CK171581可以在中国春-顶芒山羊草双二倍体和中国春-顶芒山羊草2M附加系中分别扩增出分子量约为900bp(图2A)和660bp(图2B)的特异多态性条带，但是，中国春和另外6个附加系(1M^g、3M-7M)未扩增出相应条带，说明这两条多态性条带是顶芒山羊草2M染色体特异分子标记，记为CD913720-PLUG和CK171581-PLUG(表1)。

引物CD491237和CK207576可以在中国春-顶芒山羊草双二倍体和中国春-顶芒山羊草3M附加系中分别扩增出分子量约为780bp(图2C)和1700bp(图2D)的特异多态性条带，但是，中国春和另外6个附加系(1M^g、2M、4M-7M)未扩增出相应条带，说明这两条多态性条带是顶芒山羊草3M染色体特异分子标记，记为CD491237-PLUG和CK207576-PLUG(表1)。

引物CK168221和CK206466可以在中国春-顶芒山羊草双二倍体和中国春-顶芒山羊草6M附加系中分别扩增出分子量约为710bp(图2E)和650bp(图2F)的特异多态性条带，但是，中国春和另外6个附加系(1M^g、3M-5M和7M)未扩增出相应条带，说明这两条多态性条带是顶芒山羊草6M染色体特异分子标记，记为CK168221-PLUG和CK206466-PLUG(表1)。

引物CK214770和CK203272可以在中国春-顶芒山羊草双二倍体和中国春-顶芒山羊草7M附加系中分别扩增出分子量约为1200bp(图2G)和770bp(图2H)的特异多态性条带，但是，中国春和另外6个附加系(1M^g、3M-6M)未扩增出相应条带，说明这两条多态性条带是顶芒山羊草7M染色体特异分子标记，记为CK214770-PLUG和CK203272-PLUG(表1)。

实施例3

为了验证上述8个标记的实用性，用上述筛选出的8对引物分别对4个群体进行了扩增，验证标记的实用性。

其中，用染色体第二同源群的CD913720和CK171581对中国春-顶芒山羊草2M附加系/中国春杂交F2后代材料P1-P42进行了扩增，结果显示，CD913720和CK171581均能在小麦-顶芒山羊草双二倍体、小麦-顶芒山羊草2M附加系、P2-P6、P16-P20、P25、P26、P28、P31、P32、P36、P39、P40和P42扩增出多态性标记CD913720-PLUG和CK171581-PLUG，而在中国春和P1、P7-P15、P21-P24、P27、P29、P30、P33-P35、P37、P38和P41中没有扩增出相应多态性条带(表2)。其中，CD913720对P1-P21的扩增结果如图3A所示，CK171581对P22-P42的扩增结果如图3B所示。

用染色体第三同源群的CD491237和CK207576对中国春-顶芒山羊草3M附加系/中国春杂交F2后代材料Q1-Q41进行了扩增，结果显示，CD491237和CK207576均能在小麦-顶芒山羊草双二倍体、小麦-顶芒山羊草3M附加系、Q1、Q4-Q6、Q11、Q12、Q14、Q15、Q20、Q21、Q23-Q27、Q31、Q33、Q34和Q38-40扩增出多态性标记CD491237-PLUG和CK207576-PLUG，而在中国春和Q2、Q3、Q7-Q10、Q13、Q16-Q19、Q22、Q28-30、Q32、Q35-37、Q41和Q42中没有扩增出相应多态性条带(表3)。其中，CD491237对Q1-Q21的扩增结果如图3C所示，CK207576对Q22-Q42的扩增结果如图3D所示。

用染色体第六同源群的CK168221和CK206466对中国春-顶芒山羊草6M附加系/中国春杂交F2后代材料R1-R41进行了扩增，结果显示，CK168221和CK206466均能在小麦-顶芒山羊草双二倍体、小麦-顶芒山羊草6M附加系、R1、R2、R5、R6、R8、R13、R14、R19、R20、R27-R29、R31、R35-R37和R41扩增出多态性标记CK168221-PLUG和CK206466-PLUG，而在中国春和R3、R4、R7、R9-R12、R15-R18、R21-R26、R30、R32-R34、R38-R40和R42中没有扩增出相应多态性条带(表4)。其中，CK168221对R1-R21的扩增结果如图3E所示，CK206466对R22-R42的扩增结果如图3F所示。

用染色体第七同源群的CK214770和CK203272对中国春-顶芒山羊草7M附加系/中国春杂交F2后代材料S1-S41进行了扩增，结果显示，CK214770和CK203272均能在小麦-顶芒山羊草双二倍体、小麦-顶芒山羊草7M附加系、S1-S3、S8、S10-S15、S18、S19、S22、S23、S25、S28、S30和S37-S40扩增出多态性标记CK214770-PLUG和CK203272-PLUG，而在中国春和S4-S7、S9、S16、S17、S20、S21、S24、S26、S27、S29、S31-S36、S41和S42中没有扩增出相应多态性条带(表5)。其中，CK214770对S1-S21的扩增结果如图3G所示，CK203272对S22-S42的扩增结果如图3H所示。

以上引物均可以在相应杂交后代材料中扩增出相应分子标记，说明本发明建立的染色体特异分子标记可以对小麦-顶芒山羊草涉及2M、3M、6M和7M染色体的杂交后代进行有效筛选与初步鉴定，因此，在种质资源筛选与小麦育种中具有实用价值。

表2.顶芒山羊草2M染色体特异分子标记CD913720-PLUG、CK171581-PLUG对杂交后代群体的分子检测情况

表3.顶芒山羊草3M染色体特异分子标记CD491237-PLUG、CK207576-PLUG对杂交后代群体的分子检测情况

表4.顶芒山羊草6M染色体特异分子标记CK168221-PLUG、CK206466-PLUG对杂交后代群体的分子检测情况

表5.顶芒山羊草7M染色体特异分子标记CK214770-PLUG、CK203272-PLUG对杂交后代群体的分子检测情况

上述实施例1、2、3中针对顶芒山羊草2M、3M、6M和7M染色体的特异分子标记分别进行了试验，证实特异分子标记可以用于对顶芒山羊草2M、3M、6M和7M染色体进行鉴别。而本发明的目的，是提供一种顶芒山羊草2M、3M、6M和7M染色体的特异分子标记的组合物，这种组合物可以对待检样品中的顶芒山羊草2M、3M、6M和7M染色体同时进行检测，并且从上述实施例1、2、3记载的内容可以看出，检测结果之间不会相互干扰，检测快速、方便、准确，对育种工作具有非常实用的推广价值。为了使扩增过程、结果更加容易判断，顶芒山羊草2M、3M、6M和7M染色体的特异分子标记的摩尔比为1:1:1:1。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

<110>山东省农业科学院作物研究所

<120>检测小麦中顶芒山羊草2M、3M、6M和7M染色体的特异分子标记、试剂盒及方法

<160> 16

<210> 1

<211>20

<212> DNA

<213>人工合成

<400> 1

ACTCGCGTGT ATTTGCTTCC20

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213>人工合成

<400> 2

AATGATGAAA CCCTTCTTCC TG 22

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213>人工合成

<400> 3

GACCGGTGCA TCTTAAGGAA20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213>人工合成

<400> 4

AGCCTGAAGG AATGGTTGAG 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213>人工合成

<400> 5

CCAACCTCTT GGAGCACATT 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213>人工合成

<400> 6

CAGCAGTCAC AGCACAACCT 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213>人工合成

<400> 7

AACAAATTCC GCATCTGGTC 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213>人工合成

<400> 8

TTCGTGATGA ACGCGTATGT 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213>人工合成

<400> 9

TCTTGCCATA TCCTCCCATC 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213>人工合成

<400> 10

AGCTAAAGCC ACTCCGACAA 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213>人工合成

<400> 11

GTGAGTTAAA AGCCCGACCA 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213>人工合成

<400>12

AGACTCGCTG GATGCAGATT 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213>人工合成

<400>13

CGGTGAACCC CACTGTAAAT 20

<210>14

<211> 20

<212> DNA

<213>人工合成

<400> 14

ACGTACTTCG GGCTCTTCCT 20

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213>人工合成

<400> 15

TGTGGAGCAG TGCTGTTTAT G 21

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213>人工合成

<400> 16

GGTACGGGGA CAACTCACAG 20