一种表达MS2噬菌体衣壳蛋白和成熟酶的质粒

摘要

本发明公开了一种表达MS2噬菌体衣壳蛋白和成熟酶的质粒。本发明提供了重组载体，为将MS2噬菌体衣壳蛋白编码基因和MS2噬菌体成熟酶编码基因插入pET‑30a+中得到的载体。本发明的实验证明，本发明采用的新的MS2噬菌体衣壳蛋白基因序列和成熟酶基因序列构建到表达载体中，导入宿主菌表达，得到产量和纯度高的MS2噬菌体衣壳蛋白和成熟酶。

说明书

技术领域

本发明涉及一种表达MS2噬菌体衣壳蛋白和成熟酶的质粒，属于生物技术领域。

背景技术

MS2噬菌体为正义单链RNA噬菌体，其基因组含有3569个核苷酸，同时作为mRNA编码4中蛋白质，包括成熟酶蛋白、衣壳蛋白、复制酶蛋白和裂解蛋白。与其组装相关的蛋白为成熟酶蛋白和衣壳蛋白，因此，可以利用其成熟酶蛋白和衣壳蛋白组装不具有侵染活性的病毒颗粒，称之为假病毒。由于MS2本身为RNA病毒，因此其组装的假病毒颗粒也可包装类似的目标RNA，使其成为使得RNA具有耐RNA酶活性的一种方法。

噬菌体包装主要是由于在其复制酶编码基因的5’端存在一个19个碱基组成的茎环结构，即MS2噬菌体的包装位点，是衣壳蛋白二聚体与RNA相互作用的部位，这种相互作用形成的复合物是噬菌体自我包装的信号，在复合物的基础上，成熟酶蛋白与其他衣壳蛋白分子结合，在自由能的驱动下形成相应的空间构象，进而完成MS2噬菌体的组装。因此，假病毒的包装只需有衣壳蛋白和成熟酶蛋白的存在，包装的RNA存在其包装位点即可完成病毒颗粒的包装。因此，在构建重组假病毒时，衣壳蛋白和成熟酶蛋白的表达量影响着最终获得的假病毒的量。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种重组载体。

本发明提供的重组载体，为将含有MS2噬菌体衣壳蛋白编码基因和MS2噬菌体成熟酶编码基因的片段插入pET-30a+中得到的载体；

所述含有MS2噬菌体衣壳蛋白编码基因和MS2噬菌体成熟酶编码基因的片段为如下1)-3)中任一种：

1)编码区为序列表中序列3所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA分子；

3)与1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且具有相同功能的DNA分子。

序列3第4-396位为MS2噬菌体衣壳蛋白编码基因、第455-1636位为MS2噬菌体成熟酶编码基因。

上述重组载体为将所述片段替换位点pET-30a+载体的NdeⅠ和HindⅢ酶切位点间的DNA片段得到的载体。

上述载体中，含有MS2噬菌体衣壳蛋白编码基因和MS2噬菌体成熟酶编码基因的片段为序列表中序列3，从5’端至3’端依次包括

ATG，序列3第1-3位；

MS2噬菌体衣壳蛋白编码基因，序列3第4-396位；

58bp的核苷酸序列3第397-454位；

MS2噬菌体成熟酶蛋白编码基因，序列3第455-1636位。

58bp的核苷酸包含MS2噬菌体成熟酶蛋白编码基因表达的RBS序列，使其更有利于MS2噬菌体成熟酶蛋白的表达。

含有MS2噬菌体衣壳蛋白编码基因和MS2噬菌体成熟酶编码基因的片段5’端紧邻载体T7启动子之后的第一个起始密码ATG，并去除了原载体上的6His标签，更有利于衣壳蛋白编码基因的表达、组装，使MS2噬菌体的组装不受外源多肽表达的影响；另外，该片段上有一段包含MS2噬菌体成熟酶蛋白编码基因表达RBS序列的长58bp的核苷酸，更有利于MS2噬菌体成熟酶蛋白的表达；MS2噬菌体成熟酶蛋白编码基因的下游包含终止密码子，因此该载体表达产物中不含载体上的6His标签，使MS2噬菌体的组装不受外源多肽表达的影响。

含有上述重组载体的重组菌或转基因细胞系也是本发明保护的范围。

上述重组菌中，上述重组菌为将上述重组载体导入目的菌得到的重组菌。

本发明另一个目的是提供一种DNA片段。

本发明提供的DNA片段，为如下1)-3)中任一种：

1)编码区为序列表中序列3所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA分子；

3)与1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且具有相同功能的DNA分子。6、权利要求1或2所述的重组载体或权利要求3或4所述的重组菌或权利要求5所述的DNA片段在制备MS2噬菌体的衣壳蛋白和/或成熟酶蛋白中的应用。

上述的重组载体或上述的重组菌或上述DNA片段在制备MS2噬菌体的衣壳蛋白和/或成熟酶蛋白中的应用也是本发明保护的范围。

本发明的实验证明，本发明采用的新的MS2噬菌体衣壳蛋白基因序列和成熟酶基因序列构建到表达载体中，导入宿主菌表达，得到产量和纯度高的MS2噬菌体衣壳蛋白和成熟酶。

附图说明

图1为重组质粒pET-CP-Mat的表达图谱。

图2为重组质粒pET-CP-Mat的阳性克隆鉴定。

图3为两种表达质粒表达产物SDS-PAGE电泳图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实例中采用的菌种、质粒和试剂如下：

质粒pET-30a+购自Novagen公司

产品菌株BL21(DE3)，Top10，质粒小提试剂盒购自Tiangen公司

限制性内切酶，DNA polymerase均购自NEB公司

T4DNA ligase，购自于Promega公司

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、表达MS2噬菌体衣壳蛋白基因的pET-30a-CP载体的构建

一、MS2噬菌体衣壳蛋白基因序列的扩增

以质粒pMS27(该质粒购自Department of Biomedical MolecularBiology,GhentUniversity,货号：LMBP05349)为模板，用下面的CP上游引物和CP下游引物进行PCR扩增，PCR扩增MS2噬菌体的衣壳蛋白序列。

CP上游引物：5’-CGCCATATGATGGCTTCTAACTTTACTCAG-3’

CP下游引物：5’-CGCGGATCCTGTCTATTAGTAGATGCCGG-3’

扩增体系：50μl体系扩增4管，5*Buffer 10μl，DNA聚合酶0.5μl，dNTP1μl，上游引物1μl，下游引物1μl，模板pMS27 1μl，ddH2O 35.5μl

扩增程序：98℃5min；98℃30s，58℃30s，72℃60s；重复步骤2-440个循环，72℃10min，12℃5min。

将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，大小为399bp，与预期相符。回收目的条带。

将PCR产物送去测序，该PCR产物具有序列表中序列1第1-399位核苷酸，即为MS2噬菌体的衣壳蛋白CP基因。

二、重组载体pET-30a-CP的构建

利用限制性内切酶NdeⅠ和BamHⅠ双酶切上述一制备的PCR产物(MS2衣壳蛋白基因)和载体pET-30a+，37℃酶切2小时，反应体系：BamHⅠ2μl，NdeⅠ2μl，Buffer4μl，MS2衣壳蛋白基因序列(或载体pET-30a+)32μl.

将酶切产物进行纯化，将纯化的目的片段和载体按以下体系进行酶连反应：T4DNALigase 0.5μl，T4DNA Ligase Buffer 1μl，目的片段5.5μl，pET-30a+3μl；22℃连接2h。取5μl连接产物与50μl Top10感受态细胞在冰上轻轻混匀，冰浴30min，42℃热激90s，立即置于冰上3min，加入800μl无抗性的LB培养基，37℃，150rpm孵育60min，将孵育后产物5000rpm离心4min，弃600μl上清，将剩余上清与菌体沉淀混匀，涂布含有kan抗性的LB固体平板，37℃，倒置过夜培养。结果：平板上长出细菌的单菌落，符合预期。

挑取平板上的单菌落，重悬于20μl的生理盐水中，进行菌落PCR验证阳性克隆；

扩增体系：20μl体系扩增8管，10*Buffer 1μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，MgCl2 1.2μl，dNTP 1μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，单菌落重悬液1μl，ddH2O 13.3μl

扩增程序：95℃5min；95℃30s，58℃30s，72℃60s；重复步骤2-440个循环，72℃10min，12℃5min。

将扩增产物进行0.8％的琼脂糖凝胶电泳，扩增出目的条带的送擎科公司进行测序，测序正确的为构建成功的阳性克隆，将该单菌落接种于10ml的Kan抗性的LB液体培养基，37℃，220rpm过夜培养。将培养的菌液收集至1.5ml离心管中，12000rpm离心2min，弃上清，收集菌体沉淀，按天根公司的质粒小提试剂盒进行质粒提取，即得重组的pET-30a-CP载体。将重组质粒保存于-20℃，菌种保存于-80℃。

将重组载体pET-30a-CP送去测序，其为将序列表中序列1第1-399核苷酸所示的MS2噬菌体衣壳蛋白CP编码基因替换表达载体pET-30a+的NdeⅠ和BamHⅠ酶切位点间的DNA片段得到的载体。

实施例2、表达MS2噬菌体衣壳蛋白基因和成熟酶蛋白基因的pET-CP-Mat载体的构建

一、MS2噬菌体成熟酶蛋白基因序列的扩增

以质粒pMS27为模板，用下面的Mat上游引物和Mat下游引物进行PCR扩增，PCR扩增MS2噬菌体成熟酶Mat蛋白基因序列，片段大小为1670bp。

Mat上游引物：5’-CGGGATCCTGGCTATCGCTGTAGGTAG-3’

Mat下游引物：5’-CCCAAGCTTCTATCTAGAGAGCCGTTGCC-3’

扩增体系：50μl体系扩增4管，5*Buffer 10μl，DNA聚合酶0.5μl，dNTP1μl，上游引物1μl，下游引物1μl，模板pMS27 1μl，ddH2O 35.5μl

扩增程序：98℃5min；98℃30s，58℃30s，72℃60s；重复步骤2-440个循环，72℃10min，12℃5min。

将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，大小为1230bp，与预期相符。回收目的条带。

将PCR产物送去测序，该PCR产物具有序列表中序列2第1-1231位核苷酸，即为MS2噬菌体的成熟酶Mat基因。

二、重组载体pET-CP-Mat的构建

利用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ双酶切扩增的上述一制备的PCR产物(MS2噬菌体成熟酶Mat基因)和实施例1制备的载体pET-30a-CP，37℃酶切2小时，反应体系：BamHⅠ2μl，HindⅢ2μl，Buffer 4μl，PCR扩增的成熟酶基因序列(或载体pET-30a-CP)32μl.

将酶切产物进行纯化，将纯化的目的片段和载体按以下体系进行酶连反应：T4DNALigase 0.5μl，T4DNA Ligase Buffer 1μl，目的片段5.5μl，pET-30a+3μl；22℃连接2h。取5μl连接产物与50μl Top10感受态细胞在冰上轻轻混匀，冰浴30min，42℃热激90s，立即置于冰上3min，加入800μl无抗性的LB培养基，37℃，150rpm孵育60min，将孵育后产物5000rpm离心4min，弃600μl上清，将剩余上清与菌体沉淀混匀，涂布含有kan抗性的LB固体平板，37℃，倒置过夜培养。结果：平板上长出细菌的单菌落，符合预期。

挑取平板上的单菌落，重悬于20μl的生理盐水中，进行菌落PCR验证阳性克隆；

扩增体系：20μl体系扩增8管，10*Buffer 1μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，MgCl2 1.2μl，dNTP 1μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，单菌落重悬液1μl，ddH2O 13.3μl

扩增程序：95℃5min；95℃30s，58℃30s，72℃60s；重复步骤2-440个循环，72℃10min，12℃5min。

将扩增产物进行0.8％的琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示，扩增出目的条带的扩增出目的条带的送擎科公司进行测序，测序正确的为构建成功的阳性克隆，将该单菌落接种于10ml的Kan抗性的LB液体培养基，37℃，220rpm过夜培养。将培养的菌液收集至1.5ml离心管中，12000rpm离心2min，弃上清，收集菌体沉淀，按天根公司的质粒小提试剂盒进行质粒提取，提取步骤同实施例1中质粒提取的步骤。即得重组的pET-CP-Mat载体。将重组质粒保存于-20℃，菌种保存于-80℃。

将重组载体pET-CP-Mat送去测序，其为将由序列表中序列3所示的DNA分子替换载体pET-30a+的NdeⅠ和HindⅢ酶切位点间的DNA片段(6His标签)，得到的载体(图1显示部分结果图)。

序列表中序列3所示的DNA分子从5’端至3’端依次包括

ATG，序列3第1-3位；

MS2噬菌体衣壳蛋白编码基因，序列3第4-396位；

58bp的核苷酸序列3第397-454位；

MS2噬菌体成熟酶蛋白编码基因，序列3第455-1636位。

58bp的核苷酸包含MS2噬菌体成熟酶蛋白编码基因表达的RBS序列，使其更有利于MS2噬菌体成熟酶蛋白的表达。

实施例3、重组载体pET-CP-Mat表达目的蛋白

1、重组菌的构建

将实施例2制备的重组载体pET-CP-Mat和空载体pET-30a+分别转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)，得到BL21/pET-CP-Mat和BL21/pET-30a。

对BL21/pET-CP-Mat进行菌落PCR鉴定，CP上游引物/Mat下游引物扩增得到1629bp片段,表明为阳性克隆。

BL21/pET-30a进行菌落PCR鉴定，Mat上游引物/Mat下游引物和CP上游引物/CP下游引物均未扩增得到目的片段。

pET-MC质粒记载在如下文献中：李金明等，一种可产生包装大片段RNA病毒样颗粒的双质粒表达系统，且表达MS2噬菌体的成熟酶蛋白和衣壳蛋白。

BL21/pET-MC为将pET-MC质粒转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)得到。

2、诱导表达

分别挑取BL21/pET-CP-Mat和BL21/pET-MC菌株单菌落，接种于含有Kan抗性的LB液体培养基37℃，220rpm进行过夜培养，将过夜培养的菌液按1％(v/v)的量接种于新鲜的含有kan抗性的LB液体培养基，37℃，220rpm恒温震荡培养箱，培养至OD600＝0.4-0.6，加入终浓度为1M的IPTG进行诱导，诱导条件25℃，200rpm培养6h，取诱导后菌液1ml，离心收集菌体，在收集的菌体中加入1*上样缓冲液，混匀，煮沸10min，使菌体破碎，离心取上清做SDS-PAGE电泳。

pET-CP-Mat与pET-MC质粒相比插入的核苷酸序列不同，衣壳蛋白和成熟酶蛋白的相对位置不同，pET-MC成熟酶蛋白基因在前，衣壳蛋白基因在后，本发明中衣壳蛋白基因在前，成熟酶蛋白基因在后；选用的载体也不同，pET-MC采用的为pET-28b+，本发明采用的的pET-30a+。

电泳结果如图3所示，A为表达的成熟酶蛋白、B为表达的衣壳蛋白；可以看出，BL21/pET-CP-Mat和BL21/pET-MC均可表达得到44KD的成熟酶蛋白和13.8KD的衣壳蛋白，与预期的MS2噬菌体的成熟酶蛋白和衣壳蛋白大小一致。且从电泳图上可以看出本发明所构建的质粒pET-CP-Mat蛋白表达量明显高于李金明等构建的质粒pET-MC的蛋白表达量。

采用同样的方法对BL21/pET-30a进行表达，没有目的蛋白。