禽流感病毒、新城疫病毒和传染性支气管炎病毒的三重荧光RT-PCR检测试剂盒及引物、探针

摘要

本发明涉及生物病毒检测领域，尤其涉及一种针对禽流感病毒、新城疫病毒和传染性支气管炎病毒的三重荧光RT‑PCR检测试剂盒及引物、探针。本发明涉及禽流感病毒、鸡新城疫病毒和鸡传染性支气管炎病毒特异性引物和探针。基于具有高度特异性的禽流感病毒M基因序列、新城疫病毒基因M基因、传染性支气管炎病毒M基因分别设计各自的引物和探针，并在3个探针上标记了不同的荧光信号，在优化了PCR反应体系的条件下，实现三重荧光定量PCR同步检测禽流感病毒、鸡新城疫病毒和鸡传染性支气管炎病毒。可提高早期检出率，有效防止疾病的传播，减少经济损失。

说明书

技术领域

本发明涉及生物病毒检测领域，尤其涉及一种针对禽流感病毒、新城疫病毒和传染性支气管炎病毒的三重荧光RT-PCR检测试剂盒及引物、探针。

背景技术

禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)为正黏病毒科甲型流感病毒，病毒粒子多形性，有囊膜，基因组为分节段单股负链RNA。鸡新城疫病毒(Newcastle diseasevirus，NDV)属于副粘病毒科(Paramyxoviridae)副粘病毒属(Paramyxovirus)，病毒颗粒具多形性，有圆形、椭圆形和长杆状等，有包膜，是ssRNA病毒。鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus，IBV)属冠状病毒科冠状病毒属，病毒粒子多数呈圆形或椭圆形，有囊膜，基因组核酸为不分段的正链单股RNA。以上三种病原均为RNA病毒，均会造成养禽业巨大经济损失，引起的临床症状有类似之处，甚至有可能同时混合感染，但不同病原感染引起的危害性、流行性及其防控措施截然不同。因此，建立一种区分三种病原的检测方法非常重要，准确灵敏的检测方法能有效防止疾病的传播，减少经济损失。

ELISA、RT-PCR、TaqMan探针荧光PCR等免疫学和分子生物学检测方法已经应用在上述疫病的诊断中，但目前主要用于单一病原的检测，其灵敏性、特异性和简便性等方面均有待进一步提高,普通RT-PCR检测结果的判断需要对产物进行凝胶电泳分析，操作繁琐。本发明采用Allglo^TM探针标记的三重荧光RT-PCR检测方法能够同时检测区分这三种病毒，不但可提高灵敏性、特异性和简便性等，还可节约大量时间和成本。

上述3种病原都可以通过在保守区域设计特异性引物和探针，进行荧光RT-PCR检测。荧光实时定量PCR(Real-time PCR)是在PCR反应体系中加入荧光基团标记的探针，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过扩增曲线对结果进行分析。

Allglo^TM探针是美国AlleLogic>TM探针染料上面含有特殊的能提高Tm值的化学基团(BGB)，可以大大提高探针特异性。多重荧光定量PCR技术是指在同一个荧光定量PCR扩增试验中同时扩增多个目的基因。在多重定量应用领域，Allglo^TM探针避免了TaqMan探针相互抑制的问题，探针染料采用比较容易酶切的化学基团，多条Allglo^TM探针在一个反应体系中相互干扰非常小，使一个荧光反应检测多种病原微生物的效果非常好。根据该原理设计特异性多重荧光探针，常用的荧光基团有MAR、JUP、URA等，可通过不同的荧光检测通道，同时检测多种荧光信号。由于该方法引入了特异性扩增引物和荧光探针，使得检测的灵敏度和特异性得到很大程度的增强，从而避免了其他检测方法特异性不高且容易漏检的问题。

发明内容

为了实现同步检测禽流感病毒、鸡新城疫病毒和鸡传染性支气管炎病毒，本发明的第一个目的是提供禽流感病毒、鸡新城疫病毒和鸡传染性支气管炎病毒的三重荧光定量RT-PCR检测试剂盒；本发明的第二个目的是提供禽流感病毒、鸡新城疫病毒和鸡传染性支气管炎病毒的检测引物和探针；本发明的第三个目的是提供禽流感病毒、鸡新城疫病毒和鸡传染性支气管炎病毒的三重荧光定量RT-PCR检测方法。本发明实现对上述3种鸡病原的快速早期鉴别诊断，由于引物和探针具有很高的特异性和灵敏度，提高了早期鉴别检测效率，并简化了检测方法。

为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案：

禽流感病毒、新城疫病毒和传染性支气管炎病毒的三重荧光RT-PCR检测试剂盒，该试剂盒包括脱氧三磷酸核苷混合物、逆转录酶M-MLV、MgCl₂、DNA聚合酶、特异性引物和Allglo荧光探针、阳性参考品和阴性参考品；所述特异性引物和Allglo荧光探针序列如下：

禽流感病毒上游引物-F:TTCTAACCGAGGTCGAAACGT

禽流感病毒下游引物-R:CCARTCCATGAGAGCCTCAAG

禽流感病毒特异性探针-P:MAR-TCAGGCCCCCTCAAAGCCG-MAR

鸡新城疫病毒上游引物-F:TGTGCTCGGACCTTCCGT

鸡新城疫病毒下游引物-R:GCCACCTGAGGAGAGGCA

鸡新城疫病毒特异性探针-P:JUP-TGGCACCTTTCTTCTCTAGCAGT-JUP

鸡传染性支气管炎病毒上游引物-F:CTATAGAGAGTGTGCCGATGGT

鸡传染性支气管炎病毒下游引物-R:GCATACAAATATGTCTTTAGGCAA

鸡传染性支气管炎病毒特异性探针-P:URA–CAGTGGCTTGCTAARTGTGAACC-URA。

作为优选，所述的禽流感病毒阳性参考品的序列如下：

TGAGTCTTCTAACCGAGGTCGAAACGTACGTTCTCTCTATCGTCCCATCAGGCCCCCTCAAAGCCGAGATCGCGCAGAGACTTGAAGATGTATTTGCAGGGAAAAATGCAGATCTTGAGGCTCTCATGGAAT。

作为优选，所述的鸡新城疫病毒阳性参考品的序列如下：

GTGATGTGCTCGGACCTTCCGTACTTGTGAAGGCGAGAGGTGCACGGACTAAACTGTTGGCACCTTTCTTCTCTAGCAGTGGGACAGCCTGCTACCCTATAGCAAATGCCTCTCCTCAGGTGGCTAA。

作为优选，所述的鸡传染性支气管炎病毒阳性参考品的序列：

TGCTATAGAGAGTGTGCCGATGGTGCTTTCTCCTATTATAAAGAATGGTGTTCTTTATTGTGAGGGTCAGTGGCTTGCTAAATGTGAACCAGACCACTTGCCTAAAGACATATTTGTATGCACACCAG。

为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案：

禽流感病毒、新城疫病毒和传染性支气管炎病毒的三重荧光RT-PCR检测特异性引物，所述特异性引物序列如下：

禽流感病毒上游引物-F:TTCTAACCGAGGTCGAAACGT

禽流感病毒下游引物-R:CCARTCCATGAGAGCCTCAAG；

鸡新城疫病毒上游引物-F:TGTGCTCGGACCTTCCGT

鸡新城疫病毒下游引物-R:GCCACCTGAGGAGAGGCA；

鸡传染性支气管炎病毒上游引物-F:CTATAGAGAGTGTGCCGATGGT

鸡传染性支气管炎病毒下游引物-R:GCATACAAATATGTCTTTAGGCAA。

禽流感病毒、新城疫病毒和传染性支气管炎病毒的三重荧光RT-PCR检测Allglo荧光探针，所述Allglo荧光探针序列如下：

禽流感病毒特异性探针-P:MAR-TCAGGCCCCCTCAAAGCCG-MAR

鸡新城疫病毒特异性探针-P:JUP-TGGCACCTTTCTTCTCTAGCAGT-JUP

鸡传染性支气管炎病毒特异性探针-P:URA–CAGTGGCTTGCTAARTGTGAACC-URA。

为了实现上述的第三个目的，本发明采用了以下的技术方案：

禽流感病毒、鸡新城疫病毒和鸡传染性支气管炎病毒的三重荧光定量RT-PCR检测方法，该方法包括以下的步骤：

1)提取待测样品RNA，该步骤所述样品RNA提取可按常规方法进行，如采用上海辉睿生物科技有限公司的柱法核酸抽提试剂盒或其它试剂盒说明书进行提取；

2)以待测样品RNA为模板进行RT-PCR，RT-PCR缓冲液为HR One-step qPCR MasterMix缓冲液；

特异性引物和Allglo荧光探针序列如下：

禽流感病毒上游引物-F:TTCTAACCGAGGTCGAAACGT

禽流感病毒下游引物-R:CCARTCCATGAGAGCCTCAAG

禽流感病毒特异性探针-P:MAR-TCAGGCCCCCTCAAAGCCG-MAR

鸡新城疫病毒上游引物-F:TGTGCTCGGACCTTCCGT

鸡新城疫病毒下游引物-R:GCCACCTGAGGAGAGGCA

鸡新城疫病毒特异性探针-P:JUP-TGGCACCTTTCTTCTCTAGCAGT-JUP

鸡传染性支气管炎病毒上游引物-F:CTATAGAGAGTGTGCCGATGGT

鸡传染性支气管炎病毒下游引物-R:GCATACAAATATGTCTTTAGGCAA

鸡传染性支气管炎病毒特异性探针-P:URA–CAGTGGCTTGCTAARTGTGAACC-URA

3)对RT-PCR反应产物进行荧光检测，根据荧光检测的最低Ct值和最高荧光强度判断结果；

4)所述荧光定量RT-PCR反应条件为：50℃30min，95℃5min，然后95℃10s，55℃40s，在55℃进行三重荧光检测，共进行40个循环。

本发明涉及禽流感病毒、鸡新城疫病毒和鸡传染性支气管炎病毒特异性引物和探针。基于具有高度特异性的禽流感病毒M基因序列(基因序列号：AY300973)、新城疫病毒基因M基因(基因序列号：KR338979)、传染性支气管炎病毒M基因(基因序列号：KF188434)分别设计各自的引物和探针，并在3个探针上标记了不同的荧光信号，在优化了PCR反应体系的条件下，实现三重荧光定量PCR同步检测禽流感病毒、鸡新城疫病毒和鸡传染性支气管炎病毒。由于该3种病原体的核酸均为RNA，因此，不仅可实现RNA同步提取，也可以进行荧光RT-PCR同步检测，大大简化了检测方法。由于该方法引入了高特异性扩增引物和不同荧光标记的探针，确保了本方法能快速、特异和灵敏的一次性鉴别检测禽流感病毒、鸡新城疫病毒和鸡传染性支气管炎病毒，可提高早期检出率，有效防止疾病的传播，减少经济损失。

附图说明

图1、图2为本发明试剂盒测定禽流感病毒的灵敏度图。

图3、图4为本发明试剂盒测定新城疫病毒的灵敏度图。

图5、图6为本发明试剂盒测定传染性支气管炎病毒的灵敏度图。

图7同时检测禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒的测定图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例1：样本准备和病毒RNA的提取：

无菌采集鸡咽喉拭子以及内脏器官(如：气管、肺、淋巴结、肾脏、脾脏等)置于含抗菌素的PBS液中，密闭运输，低温保存，备用。病毒RNA的提取采用上海辉睿生物科技有限公司的柱式核酸抽提试剂盒，按试剂盒说明书提取。

实施例2：引物与探针

从NCBI基因库上下载世界各地的禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒基因序列，对其进行了同源性比较。基于具有高度特异性的禽流感病毒M基因序列(基因序列号：AY300973)、新城疫病毒基因M基因(基因序列号：KR338979)、传染性支气管炎病毒M基因(基因序列号：KF188434)，用生物信息学方法根据引物设计原则，并利用Primer Express设计软件，设计出扩增上述基因片段的特异性引物和荧光探针若干组。将设计得到的引物和探针一一进行BLAST验证(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)，以保证引物的高特异性。并进一步利用DNAStar软件，验证各引物探针间是否会产生引物二聚体等。经过上述验证，最后选择了如表1所示的引物和探针，并在探针上分别标记不同的荧光信号，以实现3通道同步检测。

表1禽流感病毒、新城疫病毒和传染性支气管炎病毒检测的引物和探针

F：正向引物；R：反向引物；P：探针。

实施例3：质粒的制备

禽流感病毒阳性参考品的序列：

TGAGTCTTCTAACCGAGGTCGAAACGTACGTTCTCTCTATCGTCCCATCAGGCCCCCTCAAAGCCGAGATCGCGCAGAGACTTGAAGATGTATTTGCAGGGAAAAATGCAGATCTTGAGGCTCTCATGGAAT。

新城疫病毒阳性参考品的序列：

GTGATGTGCTCGGACCTTCCGTACTTGTGAAGGCGAGAGGTGCACGGACTAAACTGTTGGCACCTTTCTTCTCTAGCAGTGGGACAGCCTGCTACCCTATAGCAAATGCCTCTCCTCAGGTGGCTAA。

传染性支气管炎病毒阳性参考品的序列：

TGCTATAGAGAGTGTGCCGATGGTGCTTTCTCCTATTATAAAGAATGGTGTTCTTTATTGTGAGGGTCAGTGGCTTGCTAAATGTGAACCAGACCACTTGCCTAAAGACATATTTGTATGCACACCAG。

按上面序列采用人工合成的方式构建相应病毒的阳性质粒，构建好后测序验证序列的准确性，如此获得各含有一种目的片段的质粒3种。

实施例4：荧光RT-PCR反应体系和条件的优化

试剂盒：RT reaction buffer和酶mix选用上海辉睿生物科技有限公司的HR One-step qPCR Master Mix，Code：SJ-2106A，按说明书操作，反应体系为25μl，其中RTreaction buffer 7.5ul，酶mix 5ul，上游与下游引物(10μmol/L)各1μl，探针(10μmol/L)0.5μl,模板RNA 2-3μl，DEPC水补足25μl。用ABI7500荧光检测系统进行检测，反应条件为：50℃30min，95℃5min，然后95℃10s，55℃40s，在55℃进行三重荧光检测，共进行40个循环。结果判断：选择荧光检测模式MAR、JUP、URA，荧光基线调整取3-15个循环的荧光信号平均值，阈值设定以阈值线刚好超过正常阴性对照品的最高点，样本呈典型的扩增曲线，判断为阳性。无典型的扩增曲线，判断为阴性。体系的优化试验，在以相同浓度阳性核酸为模板的反应体系中，引物浓度从0.10～1.00μM，探针浓度从0.10～0.50μM，采用矩阵法优选引物和探针的最佳浓度，根据最低Ct值和最高荧光强度增加值(ΔRn)选择最佳引物和探针浓度。

实施例5：单重荧光PCR灵敏度验证

分别对上述3种病原进行荧光PCR的灵敏度验证。单重荧光PCR反应体系如下：其中RT reaction buffer 7.5ul，酶mix 5ul，上游与下游引物(10μmol/L)各1μl，探针(10μmol/L)0.5μl,上述实例3中的质粒取1ul(各个浓度梯度的质粒含量如表2所示)，不足的体积用水补足至25ul。用ABI7500荧光检测系统进行检测，反应条件为：50℃30min，95℃5min，然后95℃10s，55℃40s，在55℃进行三重荧光检测，共进行40个循环。各个单重PCR的结果如表2所示。一般认为Ct值小于等于35时，得到的阳性结果比较可靠。由此判断，AIV、NDV、IBV引物和探针的检测灵敏度均为0.00025ng/μl。

表2单重荧光PCR灵敏度验证的检测结果

所有实验取重复3次的平均值；Undet.:Ct值低于检测限。

实施例6：多重荧光PCR灵敏度验证

比较了三重荧光反应时，各引物探针的检测灵敏度。反应体系和反应程序如实例5所示，即各引物浓度相同，各探针浓度也相同。在三种质粒(实施例3中获得)浓度为1：1：1时，三重荧光PCR反应对三种物质检测灵敏度如表3所示，即对AIV、NDV和IBV的灵敏度均达到0.0025ng/μl。

表3三重荧光PCR灵敏度验证的检测结果

所有实验取重复3次的平均值；Undet:Ct值低于检测。

序列表

<110>浙江省检验检疫科学技术研究院

<120>禽流感病毒、新城疫病毒和传染性支气管炎病毒的三重荧光RT-PCR检测试剂盒及引物、探针

<160>17

<210>1

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

TTCTAACCGA GGTCGAAACG T 21

<210>2

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

CCARTCCATG AGAGCCTCAA G 21

<210>3

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

TCAGGCCCCCT CAAAGCCG 18

<210>4

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

TGTGCTCGGA CCTTCCGT18

<210>5

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

GCCACCTGAG GAGAGGCA18

<210>6

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

TGGCACCTTT CTTCTCTAGC AGT23

<210>7

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

CTATAGAGAG TGTGCCGATG GT 22

<210>8

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

GCATACAAAT ATGTCTTTAG GCAA 24

<210>9

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

CAGTGGCTTG CTAARTGTGA ACC 23

<210>10

<211>132

<212>RNA

<213>禽流感病毒

<400>10

TGAGTCTTCT AACCGAGGTC GAAACGTACG TTCTCTCTAT CGTCCCATCA GGCCCCCTCAAAGCCGAGAT CGCGCAGAGA CTTGAAGATG TATTTGCAGG GAAAAATGCA GATCTTGAGG CTCTCATGGAAT 132

<210>11

<211>127

<212>RNA

<213>鸡新城疫病毒

<400>11

GTGATGTGCT CGGACCTTCC GTACTTGTGA AGGCGAGAGG TGCACGGACT AAACTGTTGGCACCTTTCTT CTCTAGCAGT GGGACAGCCT GCTACCCTAT AGCAAATGCC TCTCCTCAGG TGGCTAA 127

<210>12

<211>128

<212>RNA

<213>鸡传染性支气管炎病毒

<400>12

TGCTATAGAG AGTGTGCCGA TGGTGCTTTC TCCTATTATA AAGAATGGTG TTCTTTATTGTGAGGGTCAG TGGCTTGCTA AATGTGAACC AGACCACTTG CCTAAAGACA TATTTGTATG CACACCAG128