一种抗HSV的糖蛋白gD的单克隆抗体以及产生该抗体的杂交瘤细胞

摘要

本发明公开了一种杂交瘤细胞，于2016年1月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO:C201620。本发明还公开了一种抗HSV的糖蛋白gD的单克隆抗体，其包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的重链可变区互补决定区CDR1和CDR2序列，以及SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的轻链可变区互补决定区CDR1和CDR2序列。所述单克隆抗体可用于诊断和治疗HSV感染或与HSV感染相关的疾病。本发明还公开了一种检测HSV或其感染的细胞的方法，包括：使所述HSV或其感染的细胞与上述单克隆抗体接触，洗去未与所述HSV或其感染的细胞结合的单克隆抗体，然后显示与所述HSV或其感染的细胞结合的单克隆抗体。本发明还公开了一种中和HSV的方法，包括：使所述HSV与权利要求2至4中任一项所述的单克隆抗体接触。

说明书

技术领域

本发明涉及抗体领域，更特别地涉及一种抗HSV的糖蛋白gD的单克隆抗体，以及用于产生该抗体的杂交瘤细胞。

背景技术

疱疹病毒包括一大类的双链脱氧核糖核酸病毒。通常已知的两种病毒是单纯性疱疹病毒1型和2型，称为HSV1和HSV2及水痘-带状疱疹病毒(VZV)。HSV1引起口面病痕，通常被称为发热性疱疹或感冒疮。另外，有约30％的病例生殖器疱疹由HSV1引起。HSV2比HSV1不常见，其引起生殖器损害。

目前HSV检测方法很多，有病毒培养分离法、HSV病毒抗原检测法、抗体法、PCR法。病毒培养分离法，是HSV检测方法的金标准，将病毒接种于细胞进行增殖，进而分离鉴定毒株型别。但此法周期长，要求严格，成本昂贵，操作繁琐，适用于科学研究，不适于临床常规检测。HSV病毒抗原检测法，临床大多采用酶联免疫吸附法(ELISA)用于皮肤破损处HSV抗原检测。HSV病毒感染典型者，临床会出现溃疡、水疱脓疱等，用棉签蘸取破溃处作标本，用双抗体夹心法检测抗原。此方法敏感性、特异性较强，适合检测临床表现典型者。此外孵育温度，标本质量和人为操作因素会导致假阳性的出现。抗体法，使用多肽或重组表达病毒蛋白组分作为抗原有较好的特异性和抗原性，利用酶联免疫吸附实验能够对HSV的IgG进行分型检测，是临床上常用的检测手段。PCR法，其中FQ-PCR法应用了荧光探针技术，具有高灵敏度和高特异性的优点，也可作为临床常用的检测手段。

尽管临床上有抗病毒化学药物治疗法，但是HSV病毒感染仍然是严重威胁人类健康的全球性难题。随着免疫缺陷病人耐药性的日益增长，使得探索新的有效的治疗方法显得极为迫切。

本发明筛选的一株能够分泌针对HSV gD的单克隆抗体的融合细胞株，其分泌的单克隆抗体能够特异的识别HSV-1和HSV-2病毒的gD蛋白，并且能够有效的中和HSV-2病毒感染细胞。本发明筛选的单克隆抗体能够用于HSV病毒的诊断及其感染的治疗。

发明内容

本发明公开了一种杂交瘤细胞株27E1，其于2016年1月27日保藏于中国典型培养物保藏中心(详细地址为：湖北省武汉市八一路229号，武汉大学保藏中心)，保藏号为：CCTCC NO:C201620。

本发明还公开了一种由上述杂交瘤细胞产生的抗HSV的糖蛋白gD的单克隆抗体，其包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的重链可变区互补决定区CDR1和CDR2序列，以及SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的轻链可变区互补决定区CDR1和CDR2序列。

进一步地，所述的单克隆抗体的重链可变区由SEQ ID NO:5所示的核酸序列编码，并且所述单克隆抗体的轻链可变区有SEQ ID NO:6所示的核酸序列编码。

本发明公开的单克隆抗体可用于制备诊断HSV感染或与HSV感染相关的疾病的试剂。

本发明公开的单克隆抗体还可用于制备治疗HSV感染或与HSV感染相关的疾病的药物。

本发明还公开了一种检测样品中的HSV或其感染的细胞的方法，包括：使所述样品与如权利要求2或3所述的单克隆抗体接触，洗去未结合的单克 隆抗体，然后显示与所述HSV或其感染的细胞结合的单克隆抗体，与所述单克隆抗体结合的物质或细胞即为HSV或其感染的细胞。该检测方法可用于实验室用途，或者可用于医学用途。

进一步地，显示与所述HSV或其感染的细胞结合的单克隆抗体可采取免疫化学染色法或免疫荧光染色法来进行。例如，可提取样品中的总蛋白，在对总蛋白进行SDS聚丙烯酰氨凝胶电泳后，然后进行转膜，用本发明的单克隆抗体孵育膜，然后针对本发明的单克隆抗体的缀合了辣根过氧化物酶的二抗孵育，再加入辣根过氧化物酶的底物进行显色来显示。或者在该免疫印迹方法中，可使用除辣根过氧化物酶以外的其他分子标记或荧光标记。也可直接将分子标记或荧光标记缀合于本发明的单克隆抗体上。除了使用免疫印迹外，也可使用免疫组织化学、免疫细胞化学(二者统称免疫化学)以及免疫荧光的方法来实现本发明。这些方法在本领域中是公知的。

本发明还公开了一种中和HSV的方法，包括：使所述HSV本发明所述的单克隆抗体接触。该中和方法可用于实验室用途，或者可用于医学用途。

附图说明

图1为PCR扩增gD1编码片段的电泳图，其中泳道中所示的是编码gD截短的胞外区(1-343aa)gD1蛋白的核酸片段；

图2为原核表达产物跑SDS-PAGE胶后的考马斯亮蓝染色图，其中，泳道1为诱导后的包涵体，泳道2为诱导后的上清，泳道3为诱导后的全菌液，泳道4为未诱导的菌液，泳道M为ladder marker；

图3为原核表达产物跑SDS-PAGE胶后通过western blot得到的电泳图，其中，泳道1为诱导后的包涵体，泳道4为未诱导的菌液图，泳道M为ladder marker；

图4为两只免疫小鼠血清中抗体的检测原核表达的gD蛋白和真核表达 的gD蛋白的Western blot图，其中，图的上半部分为将1#小鼠的眼眶血为一抗分别进行1:1000、1:10000以及1:100000的比例稀释后对原核表达的gD(泳道1、3、5)以及对真核表达的gD蛋白(泳道2、4、6)进行检测。NC为未免疫小鼠血清对照(泳道7为原核表达的gD，泳道8为真核表达的gD)；

图的下半部分为将2#小鼠的眼眶血为一抗分别进行1:1000、1:10000以及1:100000的比例稀释后对原核表达的gD(泳道9、11、13)以及对真核表达的gD蛋白(泳道10、12、14)进行检测。NC为未免疫小鼠血清对照(泳道15为原核表达的gD，泳道16为真核表达的gD)；

图5为两只免疫小鼠血清中的抗体检测表达有gD蛋白的sf9细胞的荧光图，其中，固定用杆状病毒表达系统表达gD的sf9细胞，将1#、2#免疫小鼠的血清分别进行1:300(第2行)、1:900(第3行)、1:2700(第4行)的梯度稀释作为一抗，阴性对照(第1行)为1#、2#免疫小鼠的免疫前血清，二抗为FITC标记的羊抗鼠IgG；

图6为纯化的抗体溶液跑SDS-PAGE胶后的考马斯亮蓝染色图，其中，泳道1、2、3、4、5、6分别为纯化后抗体的洗脱液，图中的条带分别为纯化单抗的重轻链；(抗体结合在纯化柱上后用2mL的洗脱液进行洗脱，洗脱液每200μL一管，大约10管，1-6为10管中去掉前2管和后2管后的6管，然后分别取一定量进行电泳)；

图7为标准蛋白浓度-A595值的相关性曲线图；

图8为本发明的单克隆抗体检测gD蛋白的Western blot图，其中，a、b和c分别是以sf9细胞表达的gD蛋白(泳道1)、HSV-1感染的Vero细胞中的gD蛋白(泳道2)以及HSV-2感染的Vero细胞中的gD蛋白(泳道3)为抗原的Western blot图，泳道为M为蛋白marker；

图9为本发明的单克隆抗体检测感染了HSV的细胞的荧光图，其中， 第1列为重组病毒vAcBac-gD2感染的sf9细胞，第2列为HSV-2感染的Vero细胞；

图10为被本发明的单克隆抗体中和后的HSV-2感染的细胞的活力柱状图，其中1为单克隆抗体27E1、2为小鼠免疫前血清(阴性对照)、3为免疫小鼠多克隆血清(阳性对照)。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1.杂交瘤细胞的制备

1.免疫原的制备从HSV-2感染的Vero细胞裂解液中提取病毒的核酸为模板，通过PCR(所用引物序列：gD1-F：5’-CCGGAATTCGCCACCATGGGGCGTTTGACCTCCG-3’gD1-R：5’-CCCAAGCTTCTAGCGCGGCACCAGGCCGCTGCTGATGATCAGGCCC GGGTTG-3')扩增得到编码gD截短的胞外区gD1蛋白的核酸片段(图1),用EcoRI/HindIII双酶切，然后将其克隆至原核表达载体pET-32a上，并命名为pET-32a-gD1。通过酶切和测序鉴定正确后，以电穿孔的方式将pET-32a-gD1转入大肠杆菌BL21中，IPTG(终浓度为1mM)37℃诱导4小时。通过考马斯亮蓝染色(图2)和western blot(图3)检测到gD1蛋白表达于包涵体中。

2.小鼠免疫从包涵体中纯化gD1蛋白，用弗式完全佐剂(Sigma公司)乳化，分别免疫2只6-8周龄的BALB/c小鼠(购自中国科学院武汉病毒研究所)。腹部皮下注射每只小鼠6点，剂量为60μg/只。每14天加强免疫一次，抗原使用弗氏完全佐剂(Sigma公司)乳化，剂量为30μg/只。4次免疫后，眼眶取血，通过western blot和免疫荧光对2只免疫小鼠血清中抗体 的特异性及效价进行初步评估。如图4和5所示所示，所得到的抗体对在稀释10⁵倍后仍然可用于western>

3.制备杂交瘤细胞取上述2#免疫小鼠的脾脏细胞，制成无菌细胞悬液(Hanks液，配方：NaCl 8.01；KCl 0.4；CaCl₂>3>2PO40.06；Glucose>TM(Sigma公司)，并搅动细胞。在温水中静置1min后，加入10mL无血清的DMEM(新纵科)，混匀，1000rpm离心5min。弃上清后加入10mL血清(GIBCO公司)小心的将细胞吹打起来，并加入5mL混合10×HAT(Sigma公司)的胸腺细胞，混匀。再加入25mL含有2.1％硝基纤维素(Sigma公司)的半固体培养基充分混匀，然后均匀的倒入20个细胞培养皿中。将细胞放入湿盒中，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养。融合7天后，在解剖镜下挑选圆、实、大的克隆团转入事先准备好培养基的96孔板中，放入37℃，5％CO₂培养箱中培养。3天后用ELISA的方法对融合细胞进行多轮筛选，并结合Western>

实施例2.用杂交瘤细胞产生单克隆抗体

腹水诱生法制备单克隆抗体将对数生长期细胞用无血清培养基洗涤并悬起，取1×10⁵，1mL的悬浮细胞腹腔注射事先用石蜡油致敏的小鼠。7天后开始收集腹水，取出的腹水于4℃离心4000rpm>

表1：标准品蛋白浓度以及样品蛋白浓度与对应的A595值

样品 A595值 标准品(0mg/mL) 0.735 标准品(0.025mg/mL) 0.736 标准品(0.05mg/mL) 0.794 标准品(0.1mg/mL) 0.847 标准品(0.2mg/mL) 1.019 标准品(0.3mg/mL) 1.088 标准品(0.5mg/mL) 1.222 标准品(0.5mg/mL) 1.316 蛋白样品稀释液 1.402

单克隆抗体亚类鉴定用100mL PBS(NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na₂HPO₄>2PO₄>2O₂的柠檬酸缓冲液进行显色反应，10-20min内测定405nm波长下的OD值。结果显示(表2)：本发明单克隆抗体为IgG2a型鼠源单克隆抗体。表2纯化的单克隆抗体的亚型鉴定

单克隆抗体可变区序列测定采用TRIzol试剂提取细胞株27E1的总RNA。按照5’Full RACE Kit使用说明书中描述的步骤，经过adaptor连接、反转录合成cDNA和outer PCR反应，获得抗体的轻重链可变区基因片段，将其克隆到T Easy载体上，进行测序。outer PCR反应所用的上游引物为5’Full RACE Kit中携带的5’-RACE Outer Primer，下游引物为：重链CH-R：CCAGGGGCCAGTGGATAGACAAGCTTGGGTGTCGTTTT；轻链CL-R：GGATACAGTTGGTGCAGCATC。测序得到编码该单克隆抗体的重链可变区序列SEQ ID NO:5和编码该单克隆抗体的轻链可变区序列SEQ ID NO:6。将编码序列转化成氨基酸序列后，通过分析，其中重链可变区CDR1和CDR2序列分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的序列，轻链可变区CDR1和CDR2序列分别为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的序列。

实施例3.检测HSV

单克隆抗体反应特异性鉴定分别以vAcBac-gD2感染的sf9细胞表达的gD2、以及用HSV-1或HSV-2(中科院武汉病毒所菌毒种保藏中心)感染的Vero细胞作为抗原，用免疫印迹法检测本发明的单克隆抗体识别gD蛋白的特异性。免疫印迹实验过程如下：分别将sf9细胞表达的gD2蛋白、以及 HSV-1和HSV-2感染的Vero细胞样品用5×Sample Buffer(250mM TrisHCl pH6.8，10％SDS，30％Glycerol，5％β-mercapitalethanol，0.02％bromophenol blue)裂解并充分煮沸后跑胶，将蛋白转移至PVDF膜，5％脱脂牛奶4℃封闭过夜，用TBST缓冲液洗膜3次，每次5min。将膜浸入单克隆杂交瘤细胞培养基上清(其中含有杂交瘤细胞分泌的单抗27E1)中，37℃孵育2.5h，TBST洗膜3次，每次5min。用含有0.5％脱脂牛奶的TBS 1:5000稀释HRP标记的羊抗鼠二抗，加入到洗好的膜上，37℃孵育2h。TBST洗涤3次后，用过氧化物底物(SuperSignal West Pico Chemiluminescent Subtrate，Fementas)以及显影系统(MicroChemi Bio-imaging system，DNR)观察目标蛋白。如图8所示，单克隆细胞株27E1能特异并灵敏的识别sf9细胞表达或HSV-1、HSV-2感染的Vero细胞中的gD蛋白。

分别以vAcBac-gD2感染的sf9细胞表达的gD2、以及用HSV-2(中科院武汉病毒所菌毒种保藏中心)感染的Vero细胞作为抗原，用免疫荧光法检测本发明的单克隆抗体识别天然构象gD蛋白的特异性。免疫荧光实验过程如下：将Sf9细胞和Vero细胞分别平铺到96孔板上，每孔约1×10⁴个细胞。贴壁后，用重组病毒vAcBac-gD2感染Sf9细胞(将处于对数生长期的Sf9细胞接种到小皿中，28℃贴壁培养过夜。次日用脂质体转染法转染5μgAcBac-gD2。转染后第5-7天，细胞出现明显CPE(细胞变圆、膨大)收集上清即获得重组杆状病毒vAcBac-gD2。用5个MOI重组杆状病毒vAcBac-gD2感染Sf9单层细胞，4天后用4％多聚甲醛固定细胞样品。)，用HSV-2感染Vero细胞，感染后换2％胎牛血清(GIBCO公司)的DMEM培养基(GIBCO公司)，36h后，用4％多聚甲醛固定10min，1×PBS洗涤3次。用新配制的0.15％Triton-X>

实施例4.体外中和HSV

用Cell Counting Kit(CCK-8/WST-8)试剂盒(碧云天)检测单克隆融合细胞分泌的抗体对HSV-2的中和活性。具体方法为：在96孔板中接种Vero细胞，每孔约5×10³个细胞，将96孔板放在37℃，5％CO₂的培养箱中贴壁培养。将0.1个MOI的HSV-2分别与单克隆杂交瘤细胞培养基上清原液、免疫后鼠多克隆血清(阳性对照)或免疫前血清(阴性对照)于37℃孵育1h，之后用孵育液感染Vero细胞(100μl/孔)。感染后48h向每孔中加入10μl>

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。