一种短链氯化石蜡对细胞能量代谢通路影响的测定方法

摘要

本发明公开了一种短链氯化石蜡对细胞能量代谢影响的评估方法，首先通过短链氯化石蜡对HepG2细胞的暴露，利用LC-MS对胞内小分子代谢产物进行能有效的分析，利用生物学检测方法能对酶活性进行快速分析。研究了与能量代谢相关的小分子代谢产物的变化以及能量代谢中起关键作用的限速酶的活性变化，基于分子生物学构建了一种细胞受外界刺激或污染暴露后能量代谢毒性评估方法。该方法能直观的分析污染物对细胞能量代谢路径的影响，同时本发明具有前处理方法简单，检测快速，重复性好，获得信息量全面等优点。

说明书

技术领域

本发明属于污染物毒性评价领域，涉及一种基于分子生物学的评估方法，通过污染物对细胞能量代谢通路的改变来评估小剂量环境污染物的细胞毒性。

背景技术

短链氯化石蜡(Short-chain chlorinated paraffins,SCCPs)是链长为10-13个碳原子，氯化程度在30％-70％(以重量计)的氯化石蜡，其组成复杂,具有远距离环境迁移的能力、环境持久性、生物蓄积性等POPs特性。过去的30年，美国、欧盟和日本已对短链氯化石蜡的生态风险和人体健康风险进行了初步的评估。已有的毒性研究表明：SCCPs对水生动物的毒性较大；对无脊椎动物和鱼类具有慢性毒性效应；在致癌性研究中，人们发现增加短链氯化石蜡剂量能增加啮齿动物肝脏、甲状腺、肾的腺瘤和癌的发病率。但是已有的毒理学研究都是基于高剂量动物实验，与现实中人类低剂量的暴露环境存在剂量差异和物种差异，针对以上存在的问题，开展以人源细胞体外模型为受体的研究来评估小剂量SCCPs的毒性作用，用以探索SCCPs的毒性作用机制具有深远的意义。

环境胁迫对于机体的影响很广泛,因此评价胁迫影响的参数很多,如机体的过氧化物酶系、三磷酸腺苷酶、碱性磷酸酶和乙酰胆碱酯酶等。但由于几乎所有胁迫都会干扰生物体的能量代谢,因此许多学者把它应用到评价环境胁迫方面，认为能量代谢能够影响细胞生长、增殖和分化等多项活动，对细胞生命的调控作用显得尤为重要，可以普遍反映生物体受外界胁迫的影响情况。但到目前为止大部分研究都是基于ATP/ADP的变化来进行的，很少能通过代谢通路来研究能量代谢。在细胞能量代谢通路中，糖酵解能够为迅速增殖的细胞提供能量,以及所需要的各种物质，除了葡萄糖之外，谷氨酰胺代谢能够为细胞的增殖提供氮源并参与三羧酸循环，也是能量代谢的重要途径。还有研究表明脂类物质氧化也是细胞主要的能量来源，脂肪酸β氧化的终产物乙酰CoA可以进入三羧酸循环代谢产生能量。因此葡萄糖、脂肪酸、氨基酸转运和代谢对细胞能量代谢至关重要。除了参与细胞内能量代谢的小分子代谢产物外，调控各个能量代谢通路的酶也表现出重要作用，调控糖酵解的关键酶包括己糖激酶、磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶；目前研究已较为清楚其在细胞能量代谢和生物学行为维持中发挥的重要作用。调控脂肪酸β氧化的关键酶则包括脂酰辅酶合成酶和脂酰辅酶脱氢酶。调控谷氨酰胺代谢的关键酶包括谷氨酰胺酶和谷氨酸脱氢酶。

综合以上分析，本发明基于分子生物学构建了一种细胞受外界刺激或污染暴露后能量代谢受到影响的评估方法。该方法利用小分子代谢产物构建了细胞的能量代谢通路。并通过测定能量代谢中起关键调控作用的酶,全面直观的分析了SCCPs对细胞代谢路径的影响。是一种理想的评价手段。

发明内容

本发明的目的是提供一种评估污染物对细胞能量代谢干扰的方法。首先利用LC-MS对胞内小分子代谢产物进行能有效的分析，利用生物学检测方法能对酶活性进行快速分析，基于分子生物学构建了细胞能量代谢通路，用于评估污染物暴露对细胞能量代谢的影响。该方法具有前处理方法简单，检测快速，重复性好，获得信息量全面等优点。能直观的分析污染物对细胞能量代谢路径的影响。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

基于构建的污染物对细胞能量代谢干扰的评估方法，以HepG2为模式细胞，以短链氯化石蜡为例对HepG2细胞进行暴露，并分析了胞内氨基酸，脂肪酸，葡萄糖等小分子代谢产物，以及能量代谢路径中其关键调控作用的酶活性，研究了短链氯化石蜡暴漏后对细胞能量代谢带来的影响。

具体包括以下步骤：

(d)细胞于孔板中培养24～48h，待细胞铺满孔板被培养液覆盖面积的60～80％，用短链氯化石蜡对细胞进行暴露24～48小时后收取细胞样品，

(e)步骤a所得细胞样品提取细胞内小分子代谢产物；利用基于LC-MS的质谱方法对小分子代谢产物进行定量分析；

(f)步骤a所得细胞样品，经超声破碎制得悬液，测定与能量代谢相关酶的活性。

上述步骤a中，所述孔板为六孔板，接种细胞密度为1～3×10⁵个/mL,六孔板内每孔培养液体积为2～3mL；培养液为GIBCO的高糖DMEM,含4500mg/l葡萄糖，含体积分数为10％的胎牛血清和体积分数为0.5～1％的青霉素-链霉素；在培养箱内培养的条件为37℃，空气中含体积分数为5％的CO₂；暴露用短链氯化石蜡为C₁₀～C₁₃，氯含量为质量分数40～70％；所述暴露操作即移弃原培养液，每孔加入含DMSO体积百分比为0.05～0.5％、含短链氯化石蜡浓度为1μg/L～10mg/L的培养液2～3mL，在培养箱内培养的条件为37℃，空气中含体积分数为5％的CO₂。

上述步骤b中提取细胞内小分子代谢产物的过程分为两步提取：第一步为脂肪酸提取，移弃培养液，每孔加入1～2mL水快速清洗并吸弃，然后加入液氮淬灭，液氮用量为填满六孔板的每一个孔；液氮挥发完后每孔加入0.5～1mL水超声破碎，超声破碎时间为3～5min,得到破碎悬液，移出每孔内的破碎悬液分别置于单独的离心管中，于-10～-40℃冷冻干燥,冻干后每个离心管加入10～20μL内标混合液(正亮氨酸浓度为200～400 nmol/L，十一酸浓度为10～20mg/L，十九酸浓度为10～20mg/L，溶剂为乙腈)，涡旋混匀；每个离心管加入400～800μL MTBE涡旋提取15～20min，每个离心管加入200～400μL水涡旋2～5min混匀，高速离心，即4～8℃下离心20～30min，转速为12000～15000rpm，取上清氮气吹干，然后每个离心管乙腈定容到200～400μL，LC-MS分析游离脂肪酸；第二步为氨基酸，葡萄糖，乳酸的提取，脂肪酸提取后剩余部分每个离心管再依次加入100～200μL MTBE和200～400μL甲醇，涡旋震荡15～20min，高速离心，即4～8℃下离心20～30min，转速为12000～15000rpm，取下层直接用于LC-MS分析。

上述步骤b小分子代谢产物的定量分析中,非极性组分游离脂肪酸分离色谱柱为Ufavour C₈柱(150mm×2.1mm,3.0μm)，流动相A为H₂O，流动相B为含1～5mM乙酸铵的乙腈，流动相C为乙腈；流动相梯度为(时间，流动相的体积百分数，流动相总流速)：0-5min,流动相A>

极性组分包括氨基酸，葡萄糖和乳酸，其分离色谱柱为Atlantis C₁₈高效液相色谱柱(waters,150mm×2.1mm,3.0μm)；流动相A为含0.1～0.5％(体积百分比)甲酸的H₂O，流动相B为甲醇；流动相梯度为(按体积百分比计)：0-2min，流动相A>

上述步骤c超声破碎制得悬液的具体操作步骤为：细胞样品移弃培养液，用PBS缓冲液清洗细胞，每孔加入0.2～0.5mL胰酶消解，待细胞从壁上脱落，每孔加0.2～0.5mL胎牛血清终止消解；分别转移每孔中的样品至单独的离心管，清洗细胞，即每个离心管加入0.5～1mL PBS缓冲液，4～8℃下，1500～2000rpm离心5～10min，弃上清,重复上述操作；清洗细胞后，每个离心管加入0.5～1mL PBS缓冲液，在冰水浴条件下进行超声破碎,超声破碎方式为：超声5～10s,间歇5～10s，循环时间为2～4min，得到破碎悬液；

上述与能量代谢相关酶包括糖酵解过程中的三种限速酶，己糖激酶、 磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶；脂肪酸β氧化过程中的脂酰辅酶合成酶和脂酰辅酶脱氢酶；谷氨酰胺代谢过程中的谷氨酰胺酶和谷氨酸脱氢酶；其中己糖激酶，磷酸果糖激酶，脂酰辅酶合成酶，脂酰辅酶脱氢酶，谷氨酰胺酶和谷氨酸脱氢酶的测定采用酶联免疫吸附测定，其余使用试剂盒测定。

经步骤b、步骤c得到了细胞内与能量代谢相关的小分子代谢产物的变化以及与能量代谢相关的酶的活性变化，通过对这些生物学指标的研究发现经短链氯化石蜡暴露后，细胞内谷氨酰胺的代谢加强，细胞内脂肪酸β氧化加强，细胞的糖代谢发生紊乱，细胞的能量代谢由糖酵解逐渐转为脂肪酸代谢，细胞能量代谢发生紊乱，由此判断短链氯化石蜡具有细胞毒性。

本发明的有益效果如下：

(1)本发明以能量代谢通路做为评价指标，比其它毒性评价指标更加灵敏，用于小剂量污染物或亚慢性毒性污染物暴露能够更加真实反映环境真实情况。采用能量代谢通路的整体方案来研究污染物毒性作用，还具有获得信息直观，全面的优点。

(2)本发明以人源细胞体外模型来研究污染物的毒性作用，能够减小常规毒性评估外推到人时由于物种不同带来的差异。用以探索污染物的毒性作用机制具有深远的意义。

(3)本发明所需样本量小，基于质谱的数据获得方式具有简单快速、灵敏度高、特异性好、重复性好等优点。

附图说明

图1为本发明基于小分子代谢产物构建的HepG2细胞能量代谢通路。

图2为糖酵解过程中起主要调控作用的酶的作用通路。

具体实施方式

实施例:短链氯化石蜡(C₁₃-CPs)暴露对细胞能量代谢的影响

以HepG2为模式细胞，首先对HepG2细胞进行培养与暴露，步骤如下：

将HepG2细胞接种于六孔板上，接种密度为1.2×10⁵个/mL,六孔板内每孔培养液体积为2.5mL。在培养箱培养24h(37℃，5％CO₂),待细胞铺满六孔板被培养液覆盖面积的80％左右，分为四个剂量组进行短链氯化石蜡暴露(C₁₃-CPs，55％Cl)。即移弃原培养液，每孔加入含DMSO体积百分数为0.05％，含短链氯化石蜡浓度分别为0，1，10，100μg/L的培养液2.5mL，培养24小时(37℃，5％CO₂)后收取细胞样品，每个浓度平行样个数为6个。

细胞内小分子代谢产物的提取与分析

(1)24h暴露后，吸弃细胞培养液，每孔用1mL超纯水快速水洗，在六孔 板中加入液氮淬灭(液氮用量为填满六孔板的每一个孔)，液氮挥发完后每孔加入0.5mL超纯水超声破碎5min，经破碎后的悬液移出，每孔悬液分别置于一个离心管中，-20℃冷冻干燥。每个离心管加入10μL内标混合液(正亮氨酸浓度为200nmol/L，十一酸浓度为10mg/L，十九酸浓度为10mg/L，溶剂为乙腈)，涡旋混匀。

(2)第一步为脂肪酸提取，每个离心管加入MTBE量为400μL，涡旋振荡20min，每个离心管加入超纯水260μL，8℃下离心12000rpm×20min，取上清氮气吹干后每个离心管用乙腈定容至400μL，用LC-MS对细胞内20种脂肪酸组分进行分析。分离色谱柱为Ufavour C₈柱(150mm×2.1mm,3.0μm)，流动相A为H₂O，流动相B为含5mM乙酸铵的乙腈，流动相C为乙腈；流动相梯度为(时间，流动相的体积百分数，流动相总流速)：0-5min,流动相A>

(3)第二步为氨基酸，葡萄糖，乳酸的提取，脂肪酸提取后剩余部分每个离心管再依次加入100μL MTBE，130μL甲醇，涡旋震荡20min，8℃高速离心(12000rpm×20min)，取下层直接用于LC-MS分析，其分离色谱柱为Atlantis C₁₈高效液相色谱柱(waters,150mm×2.1mm,3.0μm)；流动相A为含0.1～0.5％(体积百分比)甲酸的H₂O，流动相B为甲醇；流动相梯度为(按体积百分比计)：0-2min，流动相A>

细胞内能量代谢相关酶的提取与分析：

(1)经24h暴露后，吸弃细胞培养液，用PBS缓冲液清洗细胞3次，每孔加入0.2mL胰酶消解，待细胞从壁上脱落，每孔加0.2mL胎牛血清终止消解，每孔分别转移至一个离心管，清洗细胞，即每个离心管加入1mlPBS，8℃下2000rpm×5min离心弃上清，清洗三遍获得细胞沉淀，每个离心管加入0.5mL PBS在冰水浴条件超声破碎,超声破碎方式为：超声10s,间歇10s，循环时间为2min，得到破碎细胞悬液。

(2)酶活性测定方法中，己糖激酶，磷酸果糖激酶，长链脂酰辅酶合成酶，脂酰辅酶脱氢酶，谷氨酰胺酶和谷氨酸脱氢酶的测定采用酶联免疫吸附测定(王亚东，NK细胞介导的抗HBV感染免疫作用及其机制研究，博士论文)。取细胞破碎悬液100μL，8℃下12000rpm×20min离心，取上清10μL，按照Elisa测定说明依次进行加样，温育，洗涤，加酶，温育，洗涤，显色，终止等操作，利用酶标仪在450nm波长下测定吸光度值。

(3)丙酮酸激酶采用南京建成丙酮酸激酶(PK)测试盒测定，按试剂盒说明书步骤操作，测定原理为：在二磷酸腺苷存在的条件下丙酮酸激酶催化磷酸烯醇丙酮酸转化成丙酮酸，在荧光标记还原型辅酶Ⅰ(NADH)存在情况下，丙酮酸被乳酸脱氢酶转化为乳酸，有荧光的NADH变为无荧光的NAD。细胞破碎悬液可直接作为样品使用，试剂盒反应结束后利用荧光酶标仪在340nm波长下测定吸光度值.

经测定发现，经短链氯化石蜡暴露后，细胞内谷氨酰胺的代谢加强，细胞内脂肪酸β氧化加强，细胞的糖代谢发生紊乱，细胞的能量代谢由糖酵解逐渐转为脂肪酸代谢，细胞能量代谢发生紊乱，由此判断短链氯化石蜡具有细胞毒性。

本发明以细胞能量代谢通路中小分子代谢产物和起关键调控作用的酶做为评价指标，用于小剂量污染物或亚慢性毒性污染物体外毒性评价，不仅比其它毒性评价指标更加灵敏，还具有获得信息直观，全面的优点，能够真实反映环境真实情况。本发明以人源细胞体外模型来研究污染物的毒性作用，能够减小常规毒性评估外推到人时由于物种不同带来的差异。用以探索污染物的毒性作用机制具有深远的意义。