一种鉴别大白菜根肿病4号生理小种抗性的特异SNP分子标记及应用

摘要

本发明公开了一种鉴别大白菜根肿病4号生理小种抗性的特异SNP分子标记及应用。本发明提供了A0220509373G/T位点在如下A-F任一中的应用：A、在鉴别或辅助鉴别大白菜根肿病抗性中的应用；B、在选育大白菜根肿病抗病品种中的应用；C、大白菜育种中的应用；D、预测大白菜根肿病抗性中的应用；E、在制备鉴别或辅助鉴别大白菜根肿病抗性产品中的应用；F、在制备预测大白菜根肿病抗性产品中的应用。本发明的实验证明了，本发明开发的A0220509373G/T位点及其特异引物可以对大白菜根肿病抗性良好分型，具有良好的应用价值，可实现对抗根肿病遗传材料的预先选择和辅助育种。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域中鉴别大白菜根肿病抗性的SNP分子标记，尤其涉及鉴 别大白菜根肿病4号生理小种抗性的SNP分子标记及其应用。

背景技术

十字花科蔬菜根肿病是由芸薹根肿菌(PlasmodiophorabrassicaeWoron)侵染引 起的一种世界性病害。根肿菌专性寄生于十字花科植物的根部，当其侵染根部后，薄 壁细胞大量分裂并且增大，从而形成肿瘤。地上部分表现出叶片失绿，无光泽，叶缘 变黄，生长缓慢，植株矮小，萎蔫等症状，严重时可导致作物绝收。据统计，全世界 因根肿病造成十字花科作物的损失在10％以上。

根肿病最早发现于地中海沿岸(英国，1737)和欧洲南部(前苏联列宁格勒，1872)。 我国自1955年首次发现根肿病以来，现已扩散至全国各地。云南、辽宁、黑龙江、吉 林和山东等省市大白菜主产区俨然已成为最为严重的病害之一。自从1931年报道了根 肿菌存在小种分化后，各国学者利用根肿菌对不同寄主的抗感反应，划分出不同的生 理小种，目前在国际上比较公认的有Williams和欧洲鉴别系统(ECD)。2009年，沈向 群等率先采用Williams鉴别系统对采自辽宁、吉林、山东和四川等15个地区的根肿 菌进行了鉴定，认为11个地区的根肿菌主要以4号生理小种为主，同时发现2、7、 10和11号生理小种各一个。国内关于采用欧洲ECD鉴别系统的研究还未见报道，其 原因主要是国内尚无完整的ECD鉴别寄主。根肿病虽然可采用化学药剂和加强栽培管 理等防治方法，但防治效果并不理想。选育和种植具有持久抗性的品种，是防治大白 菜根肿病最经济有效的措施。

在根肿病抗病基因研究方面，国外很早就对芸薹种种质资源中的抗根肿病CR基因进行 挖掘。目前报道的大白菜抗根肿病基因有8个，分别是Crr1、Crr2、Crr3、Crr4、CRa、CRb、 CRc、CRk。Matsumoto等(1998)和Hayashida等(2008)把CRa定位在A3连锁群上，获 得了与CRa紧密连锁的SCAR标记HC352b-SCAR(距离2.9cM)。Suwabe等(2006)定 位了三个抗根肿病的QTL位点，Crr1、Crr2和Crr4，分别位于A8、A1和A6连锁群；SSR 标记BRMS-088和BRMS-096分别与Crr1和Crr2连锁，距离分别为1.75cM和0.88cM；Saito 等(2006)将Crr3精细定位在A3连锁群的0.35cM的区域内，(BrSTS-33和BrSTS-78间)； Sakanoto等(2008)利用两个F2群体和STS标记，定位得到位于A3和A2连锁群上的CRk 和CRc两个新位点。

分子标记在目标资源筛选，定位调控特定农艺性状的基因，基因聚合，品种鉴定 等方面的应用越来越广泛。SNP属于新一代分子标记，具有丰度高、检测易实现自动 化等特点。SNP在基因组上的分布极其丰富，其突变率低，尤其处于编码区的SNP是 高度稳定的，其遗传稳定性要比SSR等遗传标记高得多，遗传分析或基因诊断时的重 现性、准确性都优于SSR。基于KASP(竞争性等位基因特异性PCR)的SNPline基因 分型检测是英国LGC(LaboratoryoftheGovernmentChemist)有限公司开发的高通 量SNP分型技术，其具有准确、灵活、低成本、高通量的特点。该方案的核心是KASP 技术，即CompetitiveAllele-SpecificPCR。这项技术是基于引物末端碱基的特异 匹配来对SNP分型以及检测InDels(InsertionsandDeletions，插入和缺失)，目 前已经成为国际上SNP分析的主流方法之一。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何鉴别待测大白菜是否为抗根肿病的大白菜。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种与大白菜根肿病抗性相关的SNP位点 -A0220509373G/T位点，该位点位于A2染色体上第20509373位，其脱氧核苷酸为T 或G。在本申请中，该位点具体为序列表中序列4中的第301位核苷酸。

本发明根据上述SNP位点开发了A0220509373G/T位点在如下A-F任一中的应用：

A、在鉴别或辅助鉴别大白菜根肿病抗性中的应用；

B、在选育大白菜根肿病抗病品种中的应用；

C、大白菜育种中的应用；

D、预测大白菜根肿病抗性中的应用；

E、在制备鉴别或辅助鉴别大白菜根肿病抗性产品中的应用；

F、在制备预测大白菜根肿病抗性产品中的应用。

本发明根据上述SNP位点还开发了检测大白菜基因组中A0220509373G/T位点的多 态性或基因型的物质在如下A-F任一中的应用：

A、在鉴别或辅助鉴别大白菜根肿病抗性中的应用；

B、在选育大白菜根肿病抗病品种中的应用；

C、大白菜育种中的应用；

D、预测大白菜根肿病抗性中的应用；

E、在制备鉴别或辅助鉴别大白菜根肿病抗性产品中的应用；

F、在制备预测大白菜根肿病抗性产品中的应用。

上述应用中，所述检测大白菜基因组中A0220509373G/T位点的多态性或基因型的 物质包括由引物1、引物2和引物3所组成的引物组。

所述引物1为如下a1)或a2)：

a1)序列1所示的单链DNA分子。

a2)将a1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得 到的、与a1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子。

所述引物2为如下b1)或b2)：

b1)序列2所示的单链DNA分子。

b2)将b1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得 到的、与b1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子。

所述引物3为如下c1)或c2)：

c1)序列3所示的单链DNA分子。

c2)将c1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得 到的、与c1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子。

上述一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变为所述单链DNA分子3’末端碱基之 外一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变。

上述物质可以是引物组或含有引物组的试剂或试剂盒。

本发明根据上述SNP位点还开发一种鉴别或辅助鉴别待测大白菜是否为抗根肿病 大白菜的方法，包括如下步骤：检测待测大白菜基因组A0220509373G/T位点的多态性 或基因型，若所述待测大白菜基因组A0220509373G/T位点的多态性或基因型为TT或 TG，则所述待测大白菜为抗根肿病大白菜或候选抗根肿病大白菜；若所述待鉴别大白 菜基因组A0220509373G/T位点的多态性或基因型为GG则所述待鉴别大白菜为非抗根 肿病大白菜或非候选抗根肿病大白菜。

上述方法中，所述检测待鉴别大白菜基因组A0220509373G/T位点的多态性或基因 型的方法为如下(1)或(2)：

(1)测序；

(2)用引物对待测大白菜进行等位基因特异性PCR；

所述引物由引物1、引物2和引物3组成。

所述引物1为如下a1)或a2)：

a1)序列1所示的单链DNA分子。

a2)将a1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得 到的、与a1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子。

所述引物2为如下b1)或b2)：

b1)序列2所示的单链DNA分子。

b2)将b1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得 到的、与b1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子。

所述引物3为如下c1)或c2)：

c1)序列3所示的单链DNA分子。

c2)将c1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得 到的、与c1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子。

上述一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变为所述单链DNA分子3’末端碱基之 外一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了上述方法在下述1)-4)任一中的应用：

1)在鉴别或辅助鉴别大白菜根肿病抗性中的应用；

2)在选育大白菜根肿病抗病品种中的应用；

3)大白菜育种中的应用；

4)预测大白菜根肿病抗性中的应用。

上述方法中，所述等位基因特异性PCR的模板为待测大白菜的基因组DNA。

本发明根据上述SNP位点还开发了一种大白菜的育种方法，包括检测待测大白菜 基因组A0220509373G/T位点的多态性或基因型，选择基因组A0220509373G/T位点的 多态性或基因型为TT的待测大白菜作为亲本进行育种。

上述方法中，所述TT是A0220509373G/T位点为T的纯合型，所述GG是 A0220509373G/T位点为C的纯合型，所述TG是A0220509373G/T位点为T和G的杂合 型。

本发明根据上述SNP位点还开发了一组鉴别或辅助鉴别大白菜根肿病抗性的引物 组，所述引物由引物1、引物2和引物3组成。

所述引物1为如下a1)或a2)：

a1)序列1所示的单链DNA分子。

a2)将a1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得 到的、与a1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子。

所述引物2为如下b1)或b2)：

b1)序列2所示的单链DNA分子。

b2)将b1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得 到的、与b1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子。

所述引物3为如下c1)或c2)：

c1)序列3所示的单链DNA分子。

c2)将c1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得 到的、与c1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子。

上述一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变为所述单链DNA分子3’末端碱基之 外一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变。

上述引物组中，所述序列1所示的单链DNA分子、所述序列2所示的单链DNA分 子与所述序列3所示的单链DNA分子的摩尔比为12∶12∶30。

本发明根据上述SNP位点还开发了含有上述引物组的鉴别或辅助鉴别大白菜根肿 病抗性的试剂或试剂盒。

本发明中所涉及的大白菜根肿病是由芸薹根肿菌(Plasmodiophorabrassicae Woron)所引起的；所述芸薹根肿菌具体为芸薹根肿菌4号生理小种。

实验证明，利用本发明所提供的SNP位点与其对应的引物对大白菜根肿病抗性的 鉴定结果与利用常规检测方法的鉴定结果相比较，其准确率可以达到92.6％。表明， 可利用本发明所提供的SNP位点与其对应的引物对大白菜根肿病抗性进行鉴定，也可 用于选育大白菜根肿病抗病品种。本发明的优点是分子标记(SNP位点)为共显性， 鉴定结果准确可靠、省时省力、降低了劳动成本，本发明的应用将对加快大白菜抗根 肿病育种进程起到重要作用。

附图说明

图1为A0220509373G/T位点在68份DH群体中的基因分型鉴定图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了 阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊 说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从 商业途径得到。

实施例1、分子标记的获得

为了更好更快地筛选获得抗根肿病资源，促进分子标记辅助选择育种实践的进行, 通过对由68个株系构成的DH群体结合根肿病表型进行QTL定位，在A02染色体上获 得了1个与根肿病抗性紧密连锁的主效QTL。在该区间进一步设计并筛选SNP标记， 最终发现在在A2染色体第20509373位的碱基有一个G/T突变的SNP位点(序列表序 列4中第301位核苷酸)，该SNP位点命名为A0220509373G/T位点。根据 A0220509373G/TSNP位点，设计如下可用于KASP技术的特异的引物作为分子标记： 上游引物A0220509373-FF、上游引物A0220509373-FV和下游引物A0220509373-R。

上述A0220509373-FF、A0220509373-FV和A0220509373-R引物委托英国LGC (LaboratoryoftheGovernmentChemist政府化学家实验室)有限公司获得。

A0220509373-FF、A0220509373-FV和A0220509373-R引物序列特征如下：

上游引物A0220509373-FF：

GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTTTGTCTGGAATAAGTTGTGTACTGAAAt(序列1)；

上游引物A0220509373-FV：

GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTTTGTCTGGAATAAGTTGTGTACTGAAAg(序列2)；

下游引物A0220509373-R：

ACACGCTCAAATTAAAATACCATCACAA(序列3)。

上述上游引物最后一位碱基g/t对应A02染色体上第20509373位的SNP位点，即 序列表序列4中第301位核苷酸。

实施例2、A0220509373分子标记在鉴定大白菜根肿病4号生理小种抗性中的应用

1、分子标记鉴定抗大白菜根肿病和大白菜根肿病材料

1)DNA提取

常规CTAB法分别提取表1中68份DH群体的基因组DNA。

用琼脂糖电泳和Nanodrop2100分别检测所提取DNA的质量，发现提取的基因组 DNA均达到了相关的质量要求，即琼脂糖电泳显示DNA条带单一，没有明显弥散； Nanodrop2100检测A260/280介于1.8-2.0之间(DNA样品没有蛋白污染)； A260/230介于1.8-2.0之间(DNA样品盐离子浓度低)；270nm没有明显的光吸收(DNA 样品没有酚污染)；用于竞争性等位基因特异性PCR技术检测的DNA用量为4～10ng/每 样品。稀释DNA浓度成为10ng/μl备用，得到待测DNA。

2)基于竞争性等位基因特异性PCR

按照英国LGC(LaboratoryoftheGovernmentChemist政府化学家实验室)有 限公司提供的标准实验流程，即基于竞争性等位基因特异性PCR技术的实验流程进行 实验，以下试剂除特殊说明为均为LGC公司提供的配套试剂，试剂用量、用法、以及 整个实验步骤按照LGC公司的操作指南GenetypingAssay，ManualPart#15004070 Rev.B进行。KASPar反应在384微孔板或1536微孔板(Cat.No.04729749001,Roche) 中进行，反应体系为3ul或1ul。

具体步骤为：首先利用K-pette分液工作站在微孔板中加入待测DNA模板(4ng /μl)1.5ul，60℃烘干。然后在Kraken操作系统下利用Meridian加样工作站向 每个反应孔中加入1×Mastermix(KBS-1016-002或Cat.No.KBS-1016-011， LaboratoryoftheGovernmentChemist)与引物预混液(实施例1的两条上游引物和 下游引物按照摩尔浓度比6:6:15混合，各引物终浓度为10μM)，Mix分装完毕立即将 微孔板依次放在Kube热封仪和Fusion激光封膜仪上封膜。PCR反应在高通量水浴系 统Hydrocycler中进行，具体程序为94℃预变性，15分钟；94℃，20秒(变性) —61℃-55℃，1分钟(复性&延伸：以touchdown程序扩增10个循环，每循环降低 0.6℃)；94℃，20秒(变性)—55℃，60秒继续扩增26个循环。扩增结束后，利用 BMGPHERAstar仪器检测荧光信号并查看分型情况。若分型不充分，则继续扩增，每3 个循环查看分型情况，直至分型完全。

结果如图1所示，结果显示分型效果良好，A0220509373G/T位点能特异区分该位 点为纯合GG、或纯合TT或杂合G/T的材料。

若待测大白菜基因组的A0220509373G/T位点的核苷酸为GG纯合，则待测大白菜 为感根肿病大白菜；若待测大白菜基因组的A0220509373G/T位点的核苷酸为TT纯合 或G/T杂合，则待测大白菜为抗根肿病大白菜。

2、根肿病抗性检测

将表1中的68份大白菜DH播种后，接种根肿病4号生理小种(湖北长阳病原菌)， 发病后调查病情，接种和调查方法方法可参照文献“汪维红等，湖北省长阳县十字花 科蔬菜根肿病菌生理小种鉴定及抗源筛选，中国蔬菜，2013”中所记载记载的内容进 行。

病情分级标准:0级：无病；1级：侧根上有结节状的小根瘤，发病根占根系全部 的1％-10％；3级：侧根上有根瘤附着，侧根发病根量占10％以上；5级：主根根瘤较 小，侧根发病根量占根系的50％以上；7级：主根根瘤较大，侧根发病根量占根系的 80％以上，9级：主根根瘤大，呈纺锤形。根据病情调查结果按下式计算病情指数：

具体计算公式如下：

病情指数≤10为抗根肿病，病情指数>10为感根肿病。

结果如表1所示，在17(请补充)份病情检测为抗根肿病材料中，分子标记鉴定 A0220509373G/T位点为TT纯合的材料有13份(请补充)，GT杂合的材料有4份(请补充)， 经过实验室人工接种常规验证，该17种为抗根肿病，本发明方法的鉴定准确度为76.5％； 在51份病情检测为感根肿病材料中，分子标记鉴定A0220509373G/T位点为GG纯合的材 料有50份，TT材料的有1份，经过实验室人工接种常规验证，这51份材料为感根肿病病， 本发明方法的鉴定准确度为92％。综合而言，在68份株系材料中，A0220509373G/T位点 有5个发生交换，鉴定准确率为92.6％。结果表明A0220509373G/T位点可用于大白菜抗 根肿病分子标记辅助育种。

表1：分子标记在DH群体中的准确性验证