一种用于胸腺肽制剂活力检测中动物胸腺脱E受体胸腺T细胞的提取方法

摘要

本发明涉及细胞提取领域，特别涉及一种脱E受体胸腺T细胞(即淋巴细胞)的提取方法。该提取方法包括步骤：取动物胸腺与Hank’s液混合，获得第一细胞悬液，过滤，获得滤液，经第一离心，弃去上清液，获得第一沉淀物；取第一沉淀物与Hank’s液混合，获得第二细胞悬液，取淋巴细胞分离液与第二细胞悬液混合，经第二离心，取中间层液体，获得胸腺细胞；取胸腺细胞与Hank’s液混合，获得第三细胞悬液，经第三离心，弃去上清液，再经后处理，即得。本发明提供的提取方法可大大提高脱E受体胸腺T细胞的浓度。

说明书

技术领域

本发明涉及细胞提取领域，特别涉及一种脱E受体胸腺T细胞的提取方法。

背景技术

胸腺肽(Thymosin)，又名胸腺素，是胸腺组织分泌的具有生理活性的 一组多肽，其生理功能包括：连续诱导T细胞分化、发育的各个阶段；维持机 体免疫平衡状态，增强T细胞对抗原的反应；提高机体抵抗疾病的能力。胸腺 肽的可以作为一种免疫调节药，主要用于治疗各种原发性或继发性T细胞缺陷 病、某些自身免疫性疾病，还可以对各种细胞免疫功能低下的疾病及肿瘤进 行辅助治疗，其适应症主要包括：各型重症肝炎、慢性活动性肝炎、慢性迁 延性肝炎及肝硬化等；带状疱疹、生殖器疱疹、尖锐湿疣等；支气管炎、支 气管哮喘、肺结核、预防上呼吸道感染等；各种恶性肿瘤前期及化疗，放疗 合用并用；红斑狼疮、风湿性及类风湿性疾病、强直性脊柱炎、格林巴利综 合症等；再生障碍性贫血、白血病、血小板减少症等；病毒性角膜炎、病毒 性结膜炎、过敏性鼻炎等；老年性早衰、妇女更年期综合症等；多发性疖肿 及面部皮肤痤疮等，银屑病、扁平苔癣、鳞状细胞癌及上皮角化症等；儿童 先天性免疫缺陷症等。由于疗效确切、副作用小，胸腺肽已成为治疗各种免 疫性疾病的主要药物。

在胸腺肽制剂的制备中，检测产品中胸腺肽的活性对于质量控制是至关 重要的。胸腺肽活性常采用T细胞活性测定法—脱E受体法进行测定，它的检 测原理是根据胸腺肽可使脱E受体后的胸腺T细胞(即淋巴细胞)恢复其E受体 功能，从而反映胸腺肽的生物活性，其主要操作过程包括：(1)脱E受体胸 腺T细胞悬液的制备；(2)绵羊红血球悬液的制备；(3)供试品溶液的制备； (4)测定：求得供试品管E玫瑰花结百分率和对照管E玫瑰花结百分率，根据 如下计算公式求得样品活力：

样品活力＝供试品管E玫瑰花结百分率－对照管E玫瑰花结百分率

目前，在步骤(1)脱E受体胸腺T细胞悬液的制备主要采用国家药品标准 WS1-XG-042-2000操作方法进行，操作方法为：取新鲜猪胸腺，去脂肪并剪 碎，加适量Hank’s液使成细胞悬液，经100目筛过滤，每分钟1500转离心3～5 分钟，弃去上清液，加入少量Hank’s液打匀，将此溶液加入已具有1/3滤液量 的分离液的离心管中，以每分钟2000转离心20分钟，小心吸出中间层的胸腺 细胞，放入另一离心管中，加适量Hank’s液洗涤，摇匀，以每分钟1500转离心 3～5分钟，弃去上清液，洗涤一次后，在沉淀物中加入适量Hank’s，混匀后， 置45℃恒温水浴保温30分钟(每隔5分钟振摇一次)，取出后以每分钟1500转 离心3～5分钟，弃去上清液。用Hank’s液洗涤稀释并计数。采用此方法提取的 脱E受体胸腺T细胞悬液的浓度只有约0.2×10⁶个/mL，由于其脱E受体胸腺T细 胞悬液的浓度低，无法满足活力测定的需求。因此，提供一种高浓度的脱E受 体胸腺T细胞悬液的制备方法具有重要的现实意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种脱E受体胸腺T细胞的提取方法。该提取方 法通过调整离心的参数后，可大大提高脱E受体胸腺T细胞的浓度。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种脱E受体胸腺T细胞的提取方法，包括如下步骤：

取动物胸腺与Hank’s液混合，获得第一细胞悬液，过滤，获得滤液，经 第一离心，弃去上清液，获得第一沉淀物；

取第一沉淀物与Hank’s液混合，获得第二细胞悬液，取淋巴细胞分离液 与第二细胞悬液混合，经第二离心，取中间层液体，获得胸腺细胞；

取胸腺细胞与Hank’s液混合，获得第三细胞悬液，经第三离心，弃去上 清液，再经后处理，即得；

第一离心具体为2000～2500转/分钟离心3～5分钟；

第二离心具体为3000～3500转/分钟离心20～30分钟；

第三离心具体为3000～3500转/分钟离心3～5分钟。

本发明意外的发现，将国家药品标准WS1-XG-042-2000操作方法中第一 离心的参数调整为2000～2500转/分钟离心3～5分钟，第二离心的参数调整为 3000～3500转/分钟离心20～30分钟，第三离心的参数调整为3000～3500转/分 钟离心3～5分钟后，脱E受体胸腺T细胞的浓度由原来的0.2×10⁶个/mL提高 至3.6×10⁶个/mL，可见，本发明提供的脱E受体胸腺T细胞的提取方法可大 大提高脱E受体胸腺T细胞的浓度。

在本发明提供的一些实施例中，第一离心为2000转/分钟离心5分钟。

在本发明提供的一些实施例中，第二离心具体为3000转/分钟离心20分 钟。

在本发明提供的一些实施例中，第三离心具体为3000转/分钟离心5分钟。

在本发明提供的一些实施例中，后处理具体为：洗涤，与Hank’s液混合， 于40～50℃条件下保温20～40min。

优选地，后处理具体为：洗涤，与Hank’s液混合，于45℃条件下30min。

在本发明提供的一些实施例中，以g/mL计，胸腺与Hank’s液的质量体 积比为2:1。

在本发明提供的一些实施例中，过滤的目数为100目。

在本发明提供的一些实施例中，淋巴细胞分离液与第二细胞悬液的体积 比为1:3。

作为优选，动物胸腺为猪胸腺或小牛胸腺。

在本发明提供的一些实施例中，动物胸腺为猪胸腺。

本发明还提供了上述提取方法在胸腺肽活力检测中的应用；该提取方法 包括步骤：取动物胸腺与Hank’s液混合，获得第一细胞悬液，过滤，获得滤 液，经第一离心，弃去上清液，获得第一沉淀物；取第一沉淀物与Hank’s液 混合，获得第二细胞悬液，取淋巴细胞分离液与第二细胞悬液混合，经第二 离心，取中间层液体，获得胸腺细胞；取胸腺细胞与Hank’s液混合，获得第 三细胞悬液，经第三离心，弃去上清液，再经后处理，即得；第一离心具体 为2000～2500转/分钟离心3～5分钟；第二离心具体为3000～3500转/分钟离心 20～30分钟；第三离心具体为3000～3500转/分钟离心3～5分钟；在本发明提 供的一些实施例中，第一离心为2000转/分钟离心5分钟；在本发明提供的一 些实施例中，第二离心具体为3000转/分钟离心20分钟；在本发明提供的一 些实施例中，第三离心具体为3000转/分钟离心5分钟；在本发明提供的一些 实施例中，后处理具体为：洗涤，与Hank’s液混合，于40～50℃条件下保温 20～40min；优选地，后处理具体为：洗涤，与Hank’s液混合，于45℃条件下 30min；在本发明提供的一些实施例中，以g/mL计，胸腺与Hank’s液的质量 体积比为2:1；在本发明提供的一些实施例中，过滤的目数为100目；在本发 明提供的一些实施例中，淋巴细胞分离液与第二细胞悬液的体积比为1:3；作 为优选，动物胸腺为猪胸腺或小牛胸腺；在本发明提供的一些实施例中，动 物胸腺为猪胸腺。

本发明提供了一种脱E受体胸腺T细胞的提取方法。该提取方法包括步 骤：取动物胸腺与Hank’s液混合，获得第一细胞悬液，过滤，获得滤液，经 第一离心，弃去上清液，获得第一沉淀物；取第一沉淀物与Hank’s液混合， 获得第二细胞悬液，取淋巴细胞分离液与第二细胞悬液混合，经第二离心， 取中间层液体，获得胸腺细胞；取胸腺细胞与Hank’s液混合，获得第三细胞 悬液，经第三离心，弃去上清液，再经后处理，即得；第一离心具体为2000～2500 转/分钟离心3～5分钟；第二离心具体为3000～3500转/分钟离心20～30分钟； 第三离心具体为3000～3500转/分钟离心3～5分钟。通过计数后，本发明提供 的提取方法制得的脱E受体胸腺T细胞的浓度为3.6×10⁶个/mL，而国家药品 标准WS1-XG-042-2000提供的操作方法制得的脱E受体胸腺T细胞的浓度仅 为0.2×10⁶个/mL，可见，本发明提供的脱E受体胸腺T细胞的提取方法可大 大提高脱E受体胸腺T细胞的浓度。

具体实施方式

本发明公开了一种脱E受体胸腺T细胞的提取方法，本领域技术人员可以 借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替 换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。 本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不 脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变 更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的脱E受体胸腺T细胞的提取方法中所用原料药或辅料均可由 市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1脱E受体胸腺T细胞的提取

取新鲜猪胸腺，去脂肪并剪碎后，取10g，加10mLHank’s液使成细胞悬 液，经100目筛过滤，以2000转/分钟离心5分钟，弃去上清液，加入10mLHank’s 液打匀，将此溶液加入已具有1/3滤液量的淋巴细胞分离液(Sigma公司)的离 心管中，以3000转/分钟离心20分钟，小心吸出中间层的胸腺细胞，放入另一 离心管中，加10mLHank’s液洗涤，摇匀，以3000转/分钟离心5分钟，弃去上 清液，洗涤一次后，在沉淀物中加入5mLHank’s液，混匀后，置45℃恒温水 浴保温30分钟(每隔5分钟振摇一次)，取出后，即可获得脱E受体胸腺T细胞 悬液。

取上述制得的脱E受体胸腺T细胞悬液，置血球计数板上，置显微镜下观 察计数，获得脱E受体胸腺T细胞的数量，按照如下公式计算脱E受体胸腺T细 胞悬液的浓度：

脱E受体胸腺T细胞悬液浓度＝脱E受体胸腺T细胞数量÷体积。

结果显示，上述制得的脱E受体胸腺T细胞悬液的浓度为3.6×10⁶个/mL。 而利用现有国家标准提供的方法提取的脱E受体胸腺T细胞悬液浓度只有约 0.2×10⁶个/mL，可见，采用本实施例提供的方法可大大提高脱E受体胸腺T细 胞悬液的浓度。

实施例2脱E受体胸腺T细胞的提取

取新鲜猪胸腺，去脂肪并剪碎后，取10g，加10mLHank’s液使成细胞悬 液，经100目筛过滤，以2200转/分钟离心4分钟，弃去上清液，加入10mLHank’s 液打匀，将此溶液加入已具有1/3滤液量的淋巴细胞分离液(Sigma公司)的离 心管中，以3200转/分钟离心30分钟，小心吸出中间层的胸腺细胞，放入另一 离心管中，加10mLHank’s液洗涤，摇匀，以3200转/分钟离心4分钟，弃去上 清液，洗涤一次后，在沉淀物中加入5mLHank’s液，混匀后，置45℃恒温水 浴保温30分钟(每隔5分钟振摇一次)，取出后，即可获得脱E受体胸腺T细胞 悬液。

按照实施例1提供的方法测定脱E受体胸腺T细胞悬液的浓度。结果显示， 上述制得的脱E受体胸腺T细胞悬液的浓度为3.6×10⁶个/mL。而利用现有国家 标准提供的方法提取的脱E受体胸腺T细胞悬液浓度只有约0.2×10⁶个/mL，可 见，采用本实施例提供的方法可大大提高脱E受体胸腺T细胞悬液的浓度。

实施例3脱E受体胸腺T细胞的提取

取新鲜猪胸腺，去脂肪并剪碎后，取10g，加10mLHank’s液使成细胞悬 液，经100目筛过滤，以2500转/分钟离心3分钟，弃去上清液，加入10mLHank’s 液打匀，将此溶液加入已具有1/3滤液量的淋巴细胞分离液(Sigma公司)的离 心管中，以3500转/分钟离心25分钟，小心吸出中间层的胸腺细胞，放入另一 离心管中，加10mLHank’s液洗涤，摇匀，以3500转/分钟离心3分钟，弃去上 清液，洗涤一次后，在沉淀物中加入5mLHank’s液，混匀后，置45℃恒温水 浴保温30分钟(每隔5分钟振摇一次)，取出后，即可获得脱E受体胸腺T细胞 悬液。

按照实施例1提供的方法测定脱E受体胸腺T细胞悬液的浓度。结果显示， 上述制得的脱E受体胸腺T细胞悬液的浓度为3.6×10⁶个/mL。而利用现有国家 标准提供的方法提取的脱E受体胸腺T细胞悬液浓度只有约0.2×10⁶个/mL，可 见，采用本实施例提供的方法可大大提高脱E受体胸腺T细胞悬液的浓度。

实施例4胸腺肽活力检测

取适量羊血，用适量Hank’s液洗三次(同前)。弃去上清夜，加适量Hank’s 液稀释并计数，使最终浓度为实施例1制得的脱E受体胸腺T细胞悬液浓度的 8～10倍，获得绵羊红血球悬液。

取供试品(市售的胸腺肽注射制剂)，用Hank’s液配制成每1mL中含0.2～ 1mg的溶液，获得供试品溶液。

取小试管18支，分为3组，每组6支，其中每组3支各加Hank’s液0.1mL作 为对照管，另3支各加供试品溶液0.1mL作为测定管。其中，第一组各管(对 照管和测定管)中各加实施例1提取的脱E受体胸腺T细胞悬液0.2mL，第二组 各管(对照管和测定管)中各加实施例2提取的脱E受体胸腺T细胞悬液0.2mL， 第三组各管(对照管和测定管)中各加实施例3提取的脱E受体胸腺T细胞悬液 0.2mL。37℃保温1小时后，每管加入绵羊红血球悬0.2mL，摇匀，经每分钟500 转离心3分钟，放入4℃冰箱过夜，次日取出，弃去上清液，每管中各加入固 定液一滴，轻轻摇匀，静置10分钟，加入染色液2滴并摇匀，静置15分钟后开 始计数，显微镜视野中淡蓝色的较大的细胞为淋巴细胞，共数计数板16个大 方格上所有的淋巴细胞的个数(不少于200个)，统计其中的E玫瑰花结形成 的细胞数(结合3个以上绵羊红血细胞)，求得结花百分率，取平均值。即为 供试品管或对照管的平均值，按照下式计算供试样品的活力：

样品活力＝供试品测定管E玫瑰花结百分率－对照管E玫瑰花结百分率 胸腺肽制剂的活力检测结果见表1。

表1胸腺肽制剂的活力检测结果

由上述试验结果可知，本发明实施例1～3提取的脱E受体胸腺T细胞悬液可 用于胸腺肽制剂的活力检测中，并且通过提高脱E受体胸腺T细胞悬液的浓度 提高了活力检测的效率。

而利用国家药品标准WS1-XG-042-2000提供的操作方法制得的脱E受体 胸腺T细胞的浓度仅为0.2×10⁶个/mL，此浓度达不到检测活力的要求，无法用 于胸腺肽制剂的活力检测中。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普 通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润 饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。