G1/G0期阻滞的五环吲哚喹嗪、其合成、抗肿瘤活性和应用

摘要

本发明公开了G1/G0期阻滞的五环吲哚喹嗪，即(6S)-3-乙酰基-6-(N-苯乙酰氨基酰基)-氧化甲基-4，6，7，12-四氢-4-氧化吲哚[2，3-a]喹嗪，公开了它们的合成，公开了它们的抗细胞增殖活性，进一步公开了抗肿瘤活性及应用。

说明书

发明领域

本发明涉及G1/G0期阻滞的五环吲哚喹嗪，即(6S)-3-乙酰基-6-(N-苯乙酰氨基酰基)-氧化 甲基-4，6，7，12-四氢-4-氧化吲哚[2，3-a]喹嗪，涉及它们的合成，涉及它们的抗细胞增殖活性， 进一步涉及它们在小鼠移植性肿瘤模型上的抗肿瘤活性。因而本发明涉及(6S)-3-乙酰基 -6-(N-苯乙酰氨基酰基)氧化甲基-4，6，7，12-四氢-4-氧化吲哚[2，3-a]喹嗪作为G1/G0期阻滞剂的 临床应用前景。本发明属于生物医药领域。

背景技术

细胞通过增殖产生新细胞代替因为衰老，死亡和创伤所损失的细胞，为机体生长发育和 延续种族提供基础。细胞增殖的过程称为细胞周期。或细胞周期是指细胞从一次分裂结束开 始生长，到下一次分裂结束所经历的过程。细胞增殖周期分为间期和分裂期两个时期。

细胞分裂以后进入间期，完成结构和生物合成的复杂变化。间期又分为DNA合成前期 (G1期)，DNA合成期(S期)和DNA合成后期(G2期)三个分期。G1期细胞可分为永远停留在G1 期直至死亡、暂时不增殖和继续增殖三种类型。暂时不增殖的细胞又称Go期细胞。S初期细 胞内迅速形成DNA聚合酶及四种脱氧核苷酸。S期末细胞核DNA复制为细胞分裂作准备。S 期大约持续7～8小时。G2期细胞合成RNA和蛋白质例如组蛋白、微管蛋白和膜蛋白等，为 纺锤体和新细胞膜等备足原料，以便进入有丝分裂期。G2期大约持续1～1.5小时。有丝分裂 又称M期。M期是前期、中期、后期和末期构成的连续过程，完成由一个母细胞分裂成为两 个子细胞的任务。一般需1～2小时。

肿瘤细胞属于持续增殖的G1期细胞，细胞周期是抗肿瘤药物的重要靶点。作用于肿瘤 细胞细胞的化疗药物又称细胞周期特异性药物。虽然有些临床应用的化疗药物，例如5-氟脲 嘧啶，呋喃氟尿嘧啶，阿霉素，自力霉素和阿糖胞苷，影响细胞周期，但缺乏特异性。由是， 肿瘤细胞周期抑制剂成为抗肿瘤药物研究的重要领域。尤其是发明能够让肿瘤细胞永远停留 在G1期的化疗药物，即G1/G0期阻滞剂，是抗肿瘤药物设计的重要方向。不过，至今没有 G1/G0期阻滞剂的成功案例。按照这些理解，发明人提出了五环吲哚喹嗪，即(6S)-3-乙酰基 -6-(N-苯乙酰氨基酰基)-氧化甲基-4，6，7，12-四氢-4-氧化吲哚[2，3-a]喹嗪，作为G1/G0期阻滞的 发明。

发明内容

本发明的下式代表的化合物7a-i，

7a中AA为L-丙氨酰基，7b中AA为L-缬氨酰基，7c中AA为L-苯丙氨酰基，7d 中AA为甘氨酰基，7e中AA为L-脯氨酰基，7f中AA为L-异亮氨酰基，7g中AA为 L-亮氨酰基，7h中AA为L-蛋氨酰基，7i中AA为L-色氨酰基。

本发明的第二个内容是按照图1的路线制备(6S)-3-乙酰基-6-(N-苯乙酰氨基酰基)氧化 甲基-4，6，7，12-四氢-4-氧化吲哚[2，3-a]喹嗪(7a-i)，包括：

1)制备1-(2，2-二甲氧乙基)-3-羟甲基-1，2，3，4-四氢咔啉(3)；

2)制备(6S)-3-乙酰基-6-羟甲基-4，6，7，12-四氢-4-氧化吲哚[2，3-a]喹嗪(6)；

3)制备(6S)-3-乙酰基-6-(N-苯乙酰氨基酰基)氧化甲基-4，6，7，12-四氢-4-氧化吲哚[2，3-a]喹 嗪(7a-i)。7a中AA为L-丙氨酰基，7b中AA为L-缬氨酰基，7c中AA为L-苯丙氨酰基， 7d中AA为甘氨酰基，7e中AA为L-脯氨酰基，7f中AA为L-异亮氨酰基，7g中AA 为L-亮氨酰基，7h中AA为L-蛋氨酰基，7i中AA为L-色氨酰基。

本发明的第三个内容是评价(6S)-3-乙酰基-6-(N-苯乙酰氨基酰基)氧化甲基-4，6，7，12-四 氢-4-氧化吲哚[2，3-a]喹嗪(7a-i)的抗细胞增殖活性。

本发明的第四个内容是评价(6S)-3-乙酰基-6-(N-苯乙酰氨基酰基)氧化甲基-4，6，7，12-四 氢-4-氧化吲哚[2，3-a]喹嗪(7a-i)的抗肿瘤活性。

本发明的第五个内容是以其中一个化合物为代表，考察对细胞周期的影响。

附图说明

图1.(6S)-3-乙酰基-6-(N-苯乙酰氨基酰基)氧化甲基-4，6，7，12-四氢-4-氧化吲哚[2，3-a]喹嗪 (7a-i)的合成路线.(i)二氯亚砜/甲醇；(ii)1，1，3，3-四甲氧基丙烷，三氟乙酸/甲醇；(iii)LiAlH₄， THF；(iv)双乙烯酮，三乙胺/丙酮；(v)2NHCl/丙酮；(vi)K₂CO₃/甲醇；(vii)N-苯乙酰氨基酸， DCC/HOBt，NMM，THF。7a中AA为L-丙氨酰基，7b中AA为L-缬氨酰基，7c中AA为 L-苯丙氨酰基，7d中AA为甘氨酰基，7e中AA为L-脯氨酰基，7f中AA为L-异亮氨酰 基，7g中AA为L-亮氨酰基，7h中AA为L-蛋氨酰基，7i中AA为L-色氨酰基。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅 用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。

实施例1制备L-色氨酸甲酯盐酸盐(1)

50ml无水甲醇在冰浴下滴加3.75ml(50mmol)氯化亚砜，30min内滴加完毕后，分 批加入9.20g(42mmol)L-色氨酸，室温搅拌24h，TLC(CHCl₃∶MeOH＝2∶3)监测至 原料消失终止反应。水泵抽走未反应完的氯化亚砜SOCl₂和HCl，用乙醚反复研磨得白色 固体，甲醇-乙醚重结晶，得L-色氨酸甲酯盐酸盐为无色固体。收率在85-99％之间。ESI-MS (m/e)219[M+H]⁺，熔点、旋光等物理常数与已报道的数据一致。

实施例2制备1-(2，2-二甲氧乙基)-2，3，4，9-四氢-β-咔啉羧酸甲酯(2)

在250ml的圆底烧瓶中加入L-色氨酸甲酯盐酸盐20g(78.6mmol)，100ml甲醇，加 入三氟乙酸20ml，活化半小时，再加入1，1，3，3-四甲氧基丙烷16ml(97.6mmol)，搅拌下 升温到80℃，保温反应10小时，TLC监测原料斑点消失，将反应液降温至室温，滴加饱 和NaHCO₃水溶液调节pH至中性，减压回收甲醇，残余物中加入100ml二氯甲烷，分 液后水层用二氯甲烷萃取(50ml×3)，合并有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩 至干，残余物用硅胶柱层析(石油醚∶丙酮＝2∶1)纯化得14.2g(57％)化合物2，为黄色油状 物。ESI-MS(m/e)319[M+H]⁺。

实施例3制备1-(2，2-二甲氧乙基)-3-羟甲基-1，2，3，4-四氢咔啉(3)

在250ml的圆底烧瓶中加入50ml无水四氢呋喃，搅拌下分批加入LiAlH₄0.9g(23.6 mmol)，活化半小时。将5g(15.7mmol)化合物(2)溶于50ml无水四氢呋喃中，再将其缓 慢滴入反应瓶中，升温到40℃，保温反应3小时，TLC监测原料斑点消失。将反应液降温 至室温，加入0.5ml15％的NaOH水溶液，卒灭反应，用布什漏斗过滤除去铝盐，滤液 减压浓缩至干，加入乙酸乙酯，乙醚磨洗得到目2.52g(54％)合物3，为无色粉末。ESI-MS(m/e) 291[M+H]⁺。

实施例4制备1-(2，2-二甲氧乙基)-2-(1，3-二羰基丁基)-3-(1，3-二羰基丁基)氧化甲基-1，2，3，4- 四氢咔啉(4)

在100ml的圆底烧瓶中加入1.0g(3.8mmol)化合物(3)，再加入20ml丙酮搅拌溶 解，在冰浴下加入双乙烯酮1ml(11.9mmol)，三乙胺0.4ml。反应液室温搅拌24小时， TLC监测原料斑点消失，加入0.2ml水卒灭未反应的双乙烯酮，减压回收溶剂。残余物中 加入50ml二氯甲烷和50ml饱和NaCl水溶液，分液后水层用二氯甲烷萃取(30ml× 3)，合并有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩至干，残余物用硅胶柱层析(石油 醚∶丙酮＝6∶1)纯化得1.32g(76％)化合物4，为黄色粉末。ESI-MS(m/e)459[M+H]⁺。

实施例5制备3-乙酰基-6-(1，3-二羰基丁基)氧化甲基-4，6，7，12-四氢-4-氧化吲哚[2，3-a]喹嗪 (5)

在100ml的圆底烧瓶中加入1.98g(4.3mmol)化合物(4)，加入50ml丙酮搅拌溶 解，在冰浴下加入3ml盐酸水溶液(2mol/L)，室温反应12小时。TLC监测原料斑点消失， 加入饱和NaHCO₃水溶液调节pH至中性，减压回收溶剂，残余物中加入50ml二氯甲烷， 分液后水层用二氯甲烷萃取(30ml×3)，合并有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓 缩至干，残余物用硅胶柱层析(石油醚∶丙酮＝6∶1)纯化得1.26g(75％)化合物5，为黄色粉 末。ESI-MS(m/e)393[M+H]⁺。

实施例6制备(6S)-3-乙酰基-6-羟甲基-4，6，7，12-四氢-4-氧化吲哚[2，3-a]喹嗪(6)

在100ml的圆底烧瓶中加入1.06g(2.7mmol)化合物(5)，加入20ml甲醇搅拌溶 解，再加入745mg(5.4mol/L)碳酸钾粉末，室温反应8小时，有固体生成。TLC监测原 料斑点消失，过滤，滤饼用甲醇洗，得到黄色粉末338mg，即目标化合物(6)。滤液减压 浓缩至干，加入丙酮溶解，过滤除盐，滤液用硅胶柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝40∶1)纯化得 709mg(85％)化合物6，为黄色粉末。Mp：210-211℃；[α]_D²⁵＝-42.7(c＝0.10，甲醇)；IR(KBr)： 3321，2974，2922，1655，1551，1429，1364，1327，974，831，743cm^-1；ESI-MS(m/e)307[M-H]^-； ¹H-NMR(300MHz，DMSO-d₆)：δ/ppm＝11.83(s，1H)，8.10(d，J＝7.8Hz，1H)，7.65(d，J＝7.8 Hz，1H)，7.45(d，J＝8.1Hz，1H)，7.28(t，J＝7.8Hz，1H)，7.11(t，J＝7.8Hz，1H)，6.82(d，J＝7.8 Hz，1H)，5.40-5.46(m，1H)，5.18(t，J＝6.0Hz，1H)，3.54-3.60(m，1H)，3.28-3.41(m，2H)，3.11 (dd，J＝6.9Hz，J＝17.1Hz，1H)，2.59(s，1H)；¹³C-NMR(75MHz，DMSO-d₆)：δ/ppm＝196.62， 160.68，142.75，142.51，139.64，126.79，126.21，125.43，123.90，120.53，120.41，114.07，112.60， 100.36，59.24，51.43，31.18，19.70。

实施例7制备3-乙酰基-6-(N-苯乙酰丙氨酰基)氧化甲基-4，6，7，12-四氢-4-氧化吲哚[2，3-a] 喹嗪(7a)

冰浴下，在100ml茄瓶中加入248mg(1.2mmol)N-苯乙酰丙氨酸，用无水四氢呋喃 溶解，加入162mg(1.2mmol)HOBt，加入247mg(1.2mmol)DCC，活化半小时。将308mg (1mmol)(6S)-3-乙酰基-6-羟甲基-4，6，7，12-四氢-4-氧化吲哚[2，3-a]喹嗪(6)溶于无水四氢 呋喃中，将混合液加入反应瓶内。再用NMM调PH至7-8，撤去冰浴，避光室温反应48 小时。将反应液减压浓缩至干，用乙酸乙酯溶解，过滤，滤液用饱和碳酸氢钠溶液洗三次， 再用饱和氯化钠溶液洗三次，酯层用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩至干。残余物用 薄层层析(二氯甲烷∶甲醇＝20∶1)纯化，再用乙醚磨洗，得157mg(31.6％)化合物7a，为 黄色粉末。Mp95-96℃；[α]_D²⁵＝-27.3(c＝0.14，甲醇)；IR(KBr)：2978，2930，1753，1668，1643， 1545，1427，1329，1153，1107，745cm^-1；ESI-MS(m/e)498[M+H]⁺；¹H-NMR(300MHz， DMSO-d₆)：δ/ppm＝11.90(s，1H)，8.40-8.48(m，1H)，8.13(d，J＝7.8Hz，1H)，7.59(d，J＝7.8Hz， 1H)，7.45(d，J＝8.1Hz，1H)，7.17-7.31(m，6H)，7.10(t，J＝7.2Hz，1H)，6.85(d，J＝7.5Hz，1H)， 5.68-5.70(m，1H)，4.11-4.27(m，2H)，3.98(dd，J＝6.0Hz，J＝10.8Hz，1H)，3.43(d，J＝5.1Hz， 2H)，3.09-3.27(m，2H)，2.59(s，3H)，1.17(d，J＝7.2Hz，3H)；¹³C-NMR(75MHz，DMSO-d₆)： δ/ppm＝196.47，172.54，172.48，170.42，160.79，142.90，142.63，139.62，136.53，129.45(2C)， 128.60(2C)，126.78，126.56，125.95，123.95，120.53，113.86，112.63，100.72，62.93，48.29，42.20， 31.21，20.87，17.04。

实施例8制备3-乙酰基-6-(N-苯乙酰缬氨酰基)氧化甲基-4，6，7，12-四氢-4-氧化吲哚[2，3-a] 喹嗪(7b)

冰浴下，在100ml茄瓶中加入423mg(1.8mmol)N-苯乙酰缬氨酸，用无水四氢呋喃 溶解，加入243mg(1.8mmol)HOBt，加入371mg(1.8mmol)DCC，活化半小时。将462mg (1.5mmol)(6S)-3-乙酰基-6-羟甲基-4，6，7，12-四氢-4-氧化吲哚[2，3-a]喹嗪(6)溶于无水四 氢呋喃中，将混合液加入反应瓶内。再用NMM调PH至7-8，撤去冰浴，避光室温反应 48小时。将反应液减压浓缩至干，用乙酸乙酯溶解，过滤，滤液用饱和碳酸氢钠溶液洗三 次，再用饱和氯化钠溶液洗三次，酯层用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩至干。残余 物用薄层层析(二氯甲烷∶甲醇＝20∶1)纯化，再用乙醚磨洗，得226mg(28.7％)化合物7b， 为黄色粉末。Mp109-110℃；[α]_D²⁵＝-38.0(c＝0.11，甲醇)；IR(KBr)：2963，2926，1744，1651， 1545，1499，1360，1321，1261，1194，1146，824，745cm^-1；ESI-MS(m/e)526[M+H]⁺；¹H-NMR (300MHz，DMSO-d₆)：δ/ppm＝11.92(s，1H)，8.31(d，J＝8.1Hz，1H)，8.13(d，J＝7.8Hz，1H)， 7.56(d，J＝7.8Hz，1H)，7.45(d，J＝8.4Hz，1H)，7.19-7.31(m，6H)，7.09(t，J＝7.5Hz，1H)，6.85 (d，J＝7.5Hz，1H)，5.67-5.71(m，1H)，4.08-4.19(m，2H)，3.98(dd，J＝5.4Hz，J＝10.5Hz，1H)， 3.50(d，J＝6.2Hz，2H)，3.12-3.29(m，2H)，2.59(s，3H)，1.91-1.97(m，1H)，0.75-0.83(m，6H)； ¹³C-NMR(75MHz，DMSO-d₆)：δ/ppm＝196.45，171.92，169.29，160.75，142.94，142.74，139.61， 135.55，129.86(2C)，128.63(2C)，126.80，126.56，125.92，123.84，120.54，114.06，112.57，100.70， 63.04，58.89，48.40，47.16，31.22，28.81，24.80(2C)，20.95。

实施例9制备3-乙酰基-6-(N-苯乙酰-苯丙氨酰基)氧化甲基-4，6，7，12-四氢-4-氧化吲哚 [2，3-a]喹嗪(7c)

冰浴下，在100ml茄瓶中加入679mg(2.4mmol)N-苯乙酰-苯丙氨酸，用无水四氢呋 喃溶解，加入324mg(2.4mmol)HOBt，加入494mg(2.4mmol)DCC，活化半小时。将616 mg(2.0mmol)(6S)-3-乙酰基-6-羟甲基-4，6，7，12-四氢-4-氧化吲哚[2，3-a]喹嗪(6)溶于无水 四氢呋喃中，将混合液加入反应瓶内。再用NMM调PH至7-8，撤去冰浴，避光室温反 应48小时。将反应液减压浓缩至干，用乙酸乙酯溶解，过滤，滤液用饱和碳酸氢钠溶液洗 三次，再用饱和氯化钠溶液洗三次，酯层用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩至干。残 余物用薄层层析(二氯甲烷∶甲醇＝20∶1)纯化，再用乙醚磨洗，得137mg(12.0％)化合物 7c，为黄色粉末。Mp73-74℃；[α]_D²⁵＝-57.2(c＝0.10，甲醇)；IR(KBr)：3059，2965，2932，1746， 1659，1547，1501，1362，1333，1261，818，746cm^-1；ESI-MS(m/e)574[M+H]⁺；¹H-NMR(500 MHz，DMSO-d₆)：δ/ppm＝11.91(s，1H)，8.38-8.43(m，1H)，8.14(d，J＝7.5Hz，1H)，7.60(t，J＝ 8Hz，1H)，7.44(d，J＝8Hz，1H)，7.27-7.30(m，1H)，7.17-7.23(m，6H)，7.09-7.13(m，3H)， 7.00-7.04(m，2H)，6.86(d，J＝7.5Hz，1H)，5.69-5.74(m，1H)，4.25-4.36(m，2H)，4.16(t，J＝6.5 Hz，1H)，4.03-4.06(m，1H)，3.36-3.40(m，2H)，3.17-3.22(m，1H)，2.75-2.86(m，2H)，2.59(s，3H)； ¹³C-NMR(75MHz，DMSO-d₆)：δ/ppm＝196.44，171.41，170.53，160.83，160.79，142.95，142.69， 142.62，139.63，137.56，136.40，129.41(2C)，128.58(2C)，128.46，126.91，126.71，126.66，126.58， 125.88，123.97，120.54，113.88，112.65，100.73，63.70，53.91，48.21，42.28，36.58，31.21，21.02。

实施例10制备3-乙酰基-6-(N-苯乙酰-甘氨酰基)氧化甲基-4，6，7，12-四氢-4-氧化吲哚[2，3-a] 喹嗪(7d)

冰浴下，在100ml茄瓶中加入232mg(1.2mmol)N-苯乙酰-甘氨酸，用无水四氢呋喃 溶解，加入162mg(1.2mmol)HOBt，加入247mg(1.2mmol)DCC，活化半小时。将308mg (1.0mmol)(6S)-3-乙酰基-6-羟甲基-4，6，7，12-四氢-4-氧化吲哚[2，3-a]喹嗪(6)溶于无水四 氢呋喃中，将混合液加入反应瓶内。再用NMM调PH至7-8，撤去冰浴，避光室温反应 48小时。将反应液减压浓缩至干，用乙酸乙酯溶解，过滤，滤液用饱和碳酸氢钠溶液洗三 次，再用饱和氯化钠溶液洗三次，酯层用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩至干。残余 物用薄层层析(二氯甲烷∶甲醇＝20∶1)纯化，再用乙醚磨洗，得173mg(35.8％)化合物7d， 为黄色粉末。Mp84-85℃；[α]_D²⁵＝-29.4(c＝0.11，甲醇)；IR(KBr)：3327，3064，2922，2858， 1753，1657，1541，1433，1331，1180，976，743cm^-1；ESI-MS(m/e)484[M+H]⁺；¹H-NMR(300 MHz，DMSO-d₆)：δ/ppm＝11.93(s，1H)，8.48(t，J＝5.7Hz，1H)，8.13(d，J＝7.8Hz，1H)，7.61(d， J＝8.1Hz，1H)，7.45(d，J＝8.4Hz，1H)，7.20-7.31(m，6H)，7.10(t，J＝7.5Hz，1H)，6.85(d，J＝ 7.8Hz，1H)，5.67-5.73(m，1H)，4.21-4.27(m，1H)，4.00(dd，J＝6.6Hz，J＝10.8Hz，1H)，3.75(d， J＝5.7Hz，2H)，3.47(s，2H)，3.13-3.32(m，2H)，2.59(s，3H)；¹³C-NMR(75MHz，DMSO-d₆)： δ/ppm＝196.49，171.09，169.96，160.85，142.95，142.42，139.61，136.46，129.48(2C)，128.63 (2C)，126.82，126.54，125.92，125.56，123.89，120.52，113.69，112.64，100.80，62.60，48.12，42.28， 31.32.20.73。

实施例11制备3-乙酰基-6-(N-苯乙酰-脯氨酰基)氧化甲基-4，6，7，12-四氢-4-氧化吲哚[2，3-a] 喹嗪(7e)

冰浴下，在100ml茄瓶中加入559mg(2.4mmol)N-苯乙酰-脯氨酸，用无水四氢呋喃 溶解，加入324mg(2.4mmol)HOBt，加入494mg(2.4mmol)DCC，活化半小时。将616mg (2.0mmol)(6S)-3-乙酰基-6-羟甲基-4，6，7，12-四氢-4-氧化吲哚[2，3-a]喹嗪(6)溶于无水四 氢呋喃中，将混合液加入反应瓶内。再用NMM调PH至7-8，撤去冰浴，避光室温反应 48小时。将反应液减压浓缩至干，用乙酸乙酯溶解，过滤，滤液用饱和碳酸氢钠溶液洗三 次，再用饱和氯化钠溶液洗三次，酯层用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩至干。残余 物用薄层层析(二氯甲烷∶甲醇＝20∶1)纯化，再用乙醚磨洗，得450mg(43.0％)化合物7e， 为黄色粉末。Mp101-102℃；[α]_D²⁵＝-68.0(c＝0.09，甲醇)；IR(KBr)：2974，2880，2845，1748， 1659，1545，1425，1331，1277，1167，1109，966，745cm^-1；ESI-MS(m/e)524[M+H]⁺；¹H-NMR (300MHz，DMSO-d₆)：δ/ppm＝11.91(s，1H)，8.13(d，J＝7.8Hz，1H)，7.56(d，J＝7.8Hz，1H)， 7.45(d，J＝8.1Hz，1H)，7.17-7.31(m，6H)，7.08(q，J＝7.2Hz，1H)，6.85(d，J＝7.5Hz，1H)， 5.68-5.71(m，1H)，4.21-4.26(m，2H)，4.09(dd，J＝5.7Hz，J＝10.8Hz，1H)，3.53(s，2H)， 3.17-3.45(m，6H)，2.59(s，3H)，1.92-2.01(m，1H)，1.53-1.77(m，3H)；¹³C-NMR(75MHz， DMSO-d₆)：δ/ppm＝196.45，171.92，169.29，160.75，142.94，142.74，139.61，135.55，129.64(2C)， 128.63(2C)，126.80，126.56，125.92，125.56，123.84，120.54，114.06，112.57，100.70，65.37，63.04， 58.89，48.40，47.16，31.22，28.81，24.80，20.95。

实施例12制备3-乙酰基-6-(N-苯乙酰-异亮氨酰基)氧化甲基-4，6，7，12-四氢-4-氧化吲哚[2，3-a] 喹嗪(7f)

冰浴下，在100ml茄瓶中加入598mg(2.4mmol)N-苯乙酰-异亮氨酸，用无水四氢呋 喃溶解，加入324mg(2.4mmol)HOBt，加入494mg(2.4mmol)DCC，活化半小时。将616 mg(2.0mmol)(6S)-3-乙酰基-6-羟甲基-4，6，7，12-四氢-4-氧化吲哚[2，3-a]喹嗪(6)溶于无水 四氢呋喃中，将混合液加入反应瓶内。再用NMM调PH至7-8，撤去冰浴，避光室温反 应48小时。将反应液减压浓缩至干，用乙酸乙酯溶解，过滤，滤液用饱和碳酸氢钠溶液洗 三次，再用饱和氯化钠溶液洗三次，酯层用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩至干。残 余物用薄层层析(二氯甲烷∶甲醇＝20∶1)纯化，再用乙醚磨洗，得202mg(18.7％)化合物 7i，为黄色粉末。Mp148-149℃；[α]_D²⁵＝-33.1(c＝0.13，甲醇)；IR(KBr)：2967，2930，2716， 1742，1657，1547，1337，1265，1192，1153，976，745cm^-1；ESI-MS(m/e)540[M+H]⁺；¹H-NMR (300MHz，DMSO-d₆)：δ/ppm＝11.91(s，1H)，8.16-8.29(m，1H)，8.13(d，J＝7.8Hz，1H)，7.58(d， J＝7.8Hz，1H)，7.45(d，J＝8.1Hz，1H)，7.16-7.31(m，6H)，7.10(t，J＝7.5Hz，1H)，6.86(d，J＝ 7.8Hz，1H)，5.67-5.71(m，1H)，4.25-4.31(m，2H)，3.97-4.02(m，1H)，3.57(t，J＝5.4Hz，1H)， 3.49(d，J＝5.7Hz，2H)，3.36-3.44(m，1H)，3.17-3.26(m，1H)，2.59(s，3H)，1.56-1.62(m，1H)， 1.00-1.20(m，2H)，0.75(d，J＝6.9Hz，3H)，0.67(t，J＝7.2Hz，3H)；¹³C-NMR(75MHz， DMSO-d₆)：δ/ppm＝196.43，171.92，171.02，170.88，160.73，142.86，142.65，139.61，136.82， 136.76，129.39(2C)，128.59(2C)，126.72，125.95，125.52，123.94，120.51，113.76，112.62，100.69， 63.41，55.31，48.21，42.17，36.54，31.18，26.04，21.01，15.34，11.74。

实施例13制备3-乙酰基-6-(N-苯乙酰-亮氨酰基)氧化甲基-4，6，7，12-四氢-4-氧化吲哚[2，3-a] 喹嗪(7g)

冰浴下，在100ml茄瓶中加入598mg(2.4mmol)N-苯乙酰-亮氨酸，用无水四氢呋喃 溶解，加入324mg(2.4mmol)HOBt，加入494mg(2.4mmol)DCC，活化半小时。将616mg (2.0mmol)(6S)-3-乙酰基-6-羟甲基-4，6，7，12-四氢-4-氧化吲哚[2，3-a]喹嗪(6)溶于无水四 氢呋喃中，将混合液加入反应瓶内。再用NMM调PH至7-8，撤去冰浴，避光室温反应 48小时。将反应液减压浓缩至干，用乙酸乙酯溶解，过滤，滤液用饱和碳酸氢钠溶液洗三 次，再用饱和氯化钠溶液洗三次，酯层用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩至于。残余 物用薄层层析(二氯甲烷∶甲醇＝20∶1)纯化，再用乙醚磨洗，得350mg(32.5％)化合物71， 为黄色粉末。Mp82-83℃；[α]_D²⁵＝-133.0(c＝0.09，甲醇)；IR(KBr)：2957，2930，2870，1748， 1653，1545，1499，1360，1331，1261，1148，968，744cm^-1；ESI-MS(m/e)540[M+H]⁺；¹H-NMR (300MHz，DMSO-d₆)：δ/ppm＝11.90(s，1H)，8.39(d，J＝7.5Hz，1H)，8.13(d，J＝7.8Hz，1H)， 7.58(d，J＝7.8Hz，1H)，7.44(d，J＝8.1Hz，1H)，7.16-7.31(m，6H)，7.10(t，J＝7.5Hz，1H)，6.86 (d，J＝7.8Hz，1H)，5.69-5.76(m，1H)，4.28(dd，J＝6.6Hz，J＝11.1Hz，1H)，4.07-4.19(m，1H)， 4.00(dd，J＝6.0Hz，J＝11.1Hz，1H)，3.43(s，2H)，3.14-3.26(m，2H)，2.59(s，3H)，1.39-1.52(m， 2H)，1.15-1.22(m，1H)，0.81(d，J＝6.3Hz，3H)，0.64(d，J＝6.3Hz，3H)；¹³C-NMR(75MHz， DMSO-d₆)：δ/ppm＝196.42，172.65，172.51，170.72，160.80，142.91，142.78，142.62，139.58， 136.61，129.38(2C)，128.58(2C)，126.76，126.62，125.83，123.89，120.51，113.96，112.69，100.70， 63.51，50.70，48.17，42.26，31.36，24.54，23.21(2C)，21.33。

实施例14制备3-乙酰基-6-(N-苯乙酰-蛋氨酰基)氧化甲基-4，6，7，12-四氢-4-氧化吲哚[2，3-a] 喹嗪(7h)

冰浴下，在100ml茄瓶中加入320mg(1.2mmol)N-苯乙酰-蛋氨酸，用无水四氢呋喃 溶解，加入162mg(1.2mmol)HOBt，加入247mg(1.2mmol)DCC，活化半小时。将308mg (1.0mmol)(6S)-3-乙酰基-6-羟甲基-4，6，7，12-四氢-4-氧化吲哚[2，3-a]喹嗪(6)溶于无水四 氢呋喃中，将混合液加入反应瓶内。再用NMM调PH至7-8，撤去冰浴，避光室温反应 48小时。将反应液减压浓缩至干，用乙酸乙酯溶解，过滤，滤液用饱和碳酸氢钠溶液洗三 次，再用饱和氯化钠溶液洗三次，酯层用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩至干。残余 物用薄层层析(二氯甲烷∶甲醇＝20∶1)纯化，再用乙醚磨洗，得163mg(30.0％)化合物7m， 为黄色粉末。Mp84-85℃；[α]_D²⁵＝-29.3(c＝0.12，甲醇)；IR(KBr)：2957，2920，2855，1744， 1668，1585，1541，1362，1335，1109，970，745cm^-1；ESI-MS(m/e)596[M+K]⁺；¹H-NMR(300 MHz，DMSO-d₆)：δ/ppm＝11.90(s，1H)，8.59(d，J＝7.5Hz，1H)，8.14(d，J＝7.5Hz，1H)，7.58 (d，J＝8.1Hz，1H)，7.45(d，J＝8.1Hz，1H)，7.31-7.18(m，6H)，7.10(t，J＝7.5Hz，1H)，6.85(d，J ＝7.8Hz，1H)，5.68-5.72(m，1H)，4.23-4.30(m，2H)，3.97-4.17(m，1H)，3.45(s，2H)，3.11-3.27 (m，2H)，2.59(s，3H)，2.29-2.46(m，2H)，1.91(s，3H)，1.78(q，J＝7.2Hz，2H)；¹³C-NMR(75 MHz，DMSO-d₆)：δ/ppm＝196.44，171.27，170.85，170.82，160.80，142.94，142.57，139.63， 136.48，136.44，129.47(2C)，128.65(2C)，126.85，126.59，125.93，123.93，120.53，113.71，112.67， 100.83，63.16，51.72，49.91，48.22，42.33，38.50，31.28，20.81，15.62。

实施例15制备3-乙酰基-6-(N-苯乙酰-色氨酰基)氧化甲基-4，6，7，12-四氢-4-氧化吲哚12，3-a] 喹嗪(7i)

冰浴下，在100ml茄瓶中加入773mg(2.4mmol)N-苯乙酰-色氨酸，用无水四氢呋喃 溶解，加入324mg(2.4mmol)HOBt，加入494mg(2.4mmol)DCC，活化半小时。将616mg (2.0mmol)(6S)-3-乙酰基-6-羟甲基-4，6，7，12-四氢-4-氧化吲哚[2，3-a]喹嗪(6)溶于无水四 氢呋喃中，将混合液加入反应瓶内。再用NMM调PH至7-8，撤去冰浴，避光室温反应 48小时。将反应液减压浓缩至干，用乙酸乙酯溶解，过滤，滤液用饱和碳酸氢钠溶液洗三 次，再用饱和氯化钠溶液洗三次，酯层用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩至干。残余 物用薄层层析(二氯甲烷∶甲醇＝20∶1)纯化，再用乙醚磨洗，得300mg(24.6％)化合物7i， 为黄色粉末。Mp86-87℃；[α]_D²⁵＝-33.4(c＝0.10，甲醇)；IR(KBr)：2968，2903，1742，1655， 1545，1427，1331，1280，745cm^-1；ESI-MS(m/e)613[M+H]⁺；¹H-NMR(500MHz，DMSO-d₆)： δ/ppm＝11.93(s，1H)，10.87(d，J＝8.7Hz，1H)，8.43(d，J＝7.3Hz，1H)，8.15(d，J＝7.6Hz，1H)， 7.44-7.59(m，2H)，7.11-7.42(m，13H)，5.68-5.74(m，1H)，4.42-4.45(m，1H)，4.02-4.13(m，2H)， 3.41-3.45(m，2H)，3.12-3.31(m，2H)，2.87-3.11(m，2H)，2.59(s，3H)；¹³C-NMR(75MHz， DMSO-d₆)：δ/ppm＝171.28，171.10，171.00，170.87，161.26，143.16，142.17，139.62，136.08， 134.41，129.30(2C)，128.81(2C)，127.43，126.05，125.73，122.78，122.09，121.04，120.05，119.98， 118.27，112.51，111.41，109.28，65.88，53.44，53.09，27.04，21.57，15.29。

实施例16评价7a-i抗肿瘤细胞增殖活性

先用S180(小鼠肉瘤细胞)和HL60(人白血病细胞)筛选。然后选择化合物7b为代表考 察它们对肿瘤细胞A549(人肺癌细胞)，Bel-7402(人肝癌细胞)，HepG2(人肝癌细胞)， SW480(人结肠癌细胞)和HCT-8(人回盲肠腺癌细胞)及非肿瘤细胞L02(人正常肝细胞)增殖 的影响。

分别将生长状态良好、处于对数生长期的A549，Bel-7402，HCT-8，L02，HepG2，SW480， HL60和S180细胞按照5×10⁴个/mL的密度接种于96孔板，每孔100μl。在37℃、5％CO₂培养箱中培养24小时，按预设的浓度梯度100，50，25，10和5μM加入经灭菌处理的本发明 的化合物7a-i，对照组加入等体积溶解样品的溶媒。继续培养48小时后，每孔加25μl浓度 为5mg/mL的MTT溶液，置于37℃孵育4小时，小心除去上清液(悬浮细胞经离心后除去 上清液)后每孔加入100μlDMSO(二甲基亚砜)，振荡约15分钟，溶解沉淀。立即于酶标仪 上570nm波长下测定OD值(吸光度)。计算抑瘤率及IC₅₀。结果列入表1和表2。表1说明， 本发明的化合物7a-i中大部分化合物对S180和HL60细胞增殖有较强的抑制作用。于是选 择活性好的7c进一步用肿瘤细胞A549、Bel7402、HepG2和HCT-8和非肿瘤细胞L02评价。 表2说明，7b对肿瘤细胞A549、Bel7402、HepG2和HCT-8增殖有明显的抑制作用，而对 非肿瘤细胞L02影响很小。

表17a-i抑制肿瘤细胞S180和HL60增殖的活性(IC₅₀±SDμM)

表27c抑制肿瘤细胞和非肿瘤细胞增殖的活性(IC₅₀±SDμM)

实施例17评价7a-i的抗肿瘤活性

测定前将本发明的化合物加吐温80助溶，溶于生理盐水。无菌条件下取接种于ICR小鼠 7-10天的S180肉瘤，加入适量生理盐水配制成瘤细胞悬液，细胞数为2×10⁷/mL，接种于健 康雄性ICR小鼠前肢腋皮下，每只小鼠注射0.2ml。肿瘤接种24h后，治疗组小鼠每日腹 腔注射0.2ml本发明化合物的水溶液，连续给药7天，剂量为0.1μmol/kg。空白组小鼠 每日腹腔注射0.2ml生理盐水。以阿霉素(剂量为2μmol/kg)作阳性对照。实验进行至第8 天，称小鼠体重，并剖取各组小鼠的肿瘤称重，最后统计各组动物的抑瘤率。实体瘤的疗效 以瘤重抑制百分率表示，计算如下：瘤重抑制率％＝(1-给药组瘤重/空白组瘤重)×100％。 结果列入表3。给药剂量在0.1μmol/kg下，化合物7a-i(除了7g)的体内抗肿瘤活性与生理盐 水相比都有差异。其中化合物7b，7c，7d，7(的抗肿瘤活性与阿霉素相当(p＞0.05)。化合物7c 的活性最强，抑瘤率为51.77％。

表3化合物6和7a-i对S180荷瘤小鼠瘤重的影响结果

n＝12.a)与生理盐水及化合物6比p＜0.01，与阿霉素比p＞0.05；b)与生理盐水比p＜0.01，与化合物6比 p＞0.05；c)与生理盐水比p＜0.05。

实施例18评价7c的剂量对抗肿瘤活性的影响

按照实施例16的方法，测定0.01μmol/kg，0.1μmol/kg，1μmol/kg和10μmol/kg四种剂量 下7c的抗肿瘤活性，结果见表4。表4的数据表明，在0.1μmol/kg，1μmol/kg和10μmol/kg剂量 下7c都具有明显的抗肿瘤活性。在0.01μmol/kg的剂量下7c不再显示抗肿瘤活性。四种 剂量下7c的活性显示明显的依赖关系。

表4不同剂量7c对S180荷瘤小鼠瘤重的景响

n＝12.a)与生理盐水组相比p＜0.01；b)与0.1μmol/kg7c比p＜0.05；c)与0.1pmol/kg和lμmol/kg7c比p ＜0.01.

实施例19评价7c对肿瘤细胞周期的影响

将人肺癌细胞A549消化制成单细胞悬液，均匀地接种到6孔板中，移入培养箱中培养 过夜贴壁后，设阴性对照生理盐水组，阳性对照阿霉素组(终浓度0.51μM)和7c组(终浓度25 μM)。孵育24小时后，用胰酶消化收集细胞，离心去上清，细胞用1ml冰冷PBS把细胞重 悬成单细胞悬液，并转移至1.5ml离心管中，离心小心吸除上清。细胞用1ml冰冷的乙醇 (70％)快速吹匀，避免形成细胞团块。细胞于4℃固定2h，离心收集细胞，小心吸除上 清，加入1ml冰冷的PBS重悬细胞，再次离心收集细胞，小心吸除上清。往留存的细胞加 入0.5ml碘化丙啶(PI)染色液，使细胞重悬并沉淀，37℃避光温浴30分钟。上流式细胞仪 (EPICSXL，贝克曼·库尔特)在488nm波长检测，结果用Wincycle软件分析。每份样 品检测1万个细胞。结果见表4。结果表明，25μM7c作用24小时A549细胞的G1/G0期 细胞比率为87.64％，明显高于生理盐水作用24小时A549细胞的66.64％，而S期和G2/M 期细胞比率都明显低于生理盐水作用24小时A549细胞的比率。阳性对照阿霉素作用24小 时A549细胞的G2/M期细胞比率为29.73％，明显高于生理盐水作用24小时A549细胞的 6.70％，与7c作用24小时A549细胞的G2/M期细胞比率只有3.98％相比，则更高。可见， 7c对A549细胞周期的影响是阻断G1期细胞向G0期细胞过渡，而阿霉素对A549细胞周 期的影响是阻断G2期细胞向M期细胞过渡。象7c这样使G1期细胞不能进入G0期的药 物目前还没有先例。

表47c作用24小时的A549细胞的周期比