一株经分离获得的鞘氨醇单胞菌属细菌及其在促进连作西瓜生长中的应用

摘要

本发明公开了一株经分离获得的鞘氨醇单胞菌属细菌及其在促进连作西瓜生长中的应用。所述的一株经分离获得的鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas？sp.)细菌，命名为Sphingomonas？sp.CL01，保藏在中国典型培养物保藏中心，地址在武汉大学，其微生物保藏号是CCTCC？NO：M？2015198，保藏日期2015年4月6日。研究表明，Sphingomonas？sp.CL01的最大解磷量可达到642.60mg/L，IAA最大分泌量可达到22.87mg/L，经该菌的菌液处理后，连作西瓜幼苗根干重、根长、根体积、根尖个数和毛根(0.00mm＜d≤0.50mm)比例显著增加，根系平均直径显著降低，且能够优化西瓜根系形态，改善根系组成，有效缓解西瓜连作障碍。因此，本发明经分离获得的鞘氨醇单胞菌属细菌CL01在促进连作西瓜生长、缓解西瓜连作障碍方面将具有较好的利用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及一株鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonassp.)细菌及其在促进连作西瓜生长中的应用。本发明属于微生物技术领域。

背景技术

中国是世界上最大的西瓜产地，种植面积约占世界总种植面积的55％，并占世界总产量的70％以上。但是随着西瓜的连年种植，连作障碍已经成为我国西瓜栽培中重要瓶颈之一(柯用春,王爽,任红,等.强化还原处理对海南西瓜连作障碍土壤性质的影响[J].生态学杂志,2014,33(4):880-884；徐伟慧,吴凤芝,王志刚,等.连作西瓜光合特性及抗病性对小麦伴生的响应[J].中国生态农业学报,2014,22(6):655-660.)。通过增施化肥和农药等方法来缓解连作障碍具有高污染和高风险的缺点，近些年来，植物根际促生菌在缓解连作障碍上的研究正在兴起，有报道指出土壤经过不同种类微生物接种后能够有效增加植物生长所必需的各类营养元素(夏觅真,马忠友,曹媛媛,等.棉花根际固氮菌、解磷菌及解钾菌的相互作用[J].中国微生态学杂志,2010,22(2):102-105.)，促进有益微生物群落大量繁殖，抑制有害菌生长，减少病菌积累(马玲,马琨,汤梦洁,等.间作与接种AMF对连作土壤微生物群落结构与功能的影响[J].生态环境学报,2013,22(8):1341-1347.LEESW,LEESH,BALARAJUK,etal.Growthpromotionandinduceddiseasesuppressionoffourvegetablecropsbyaselectedplantgrowth-promotingrhizobacteria(PGPR)strainBacilussubtilis21-1undertwodifferentsoilconditions[J].ActaPhysiologiaePlantarum,2014,36(6):1353-1362.LANDABB,MONTES-BORREGOM,JA.UseofPGPRforControllingSoilborneFungalPathogens：AssessingtheFactorsInfluencingItsEfficacy[M]//BacteriainAgrobiology：DiseaseManagement.SpringerBerlinHeidelberg,2013:259-292.)，帮助植物建立良好的根际生长条件(HAYATR,AHMEDI,SHEIRDILRA.Anoverviewofplantgrowthpromotingrhizobacteria(PGPR)forsustainableagriculture[M]//CropProductionforAgriculturalImprovement.SpringerNetherlands,2012:557-579.MEHTAP,WALIAA,CHAUHANA,etal.Plantgrowthpromotingtraitsofphosphate-solubilizingrhizobacteriaisolatedfromappletreesintransHimalayanregionofHimachalPradesh[J].Archivesofmicrobiology,2013,195(5):357-369.)，这些报道充分显示了微生物在防治连作障碍上的潜质。

磷是植物生长所必须的重要营养元素之一(赵国杰,牛世全,达文燕,等.四株无机解磷菌处理碱化土壤的理化性质及质量评价[J].土壤通报,2014,45(4):996-1002.SINDHUSS,PHOURM,CHOUDHARYSR,etal.PhosphorusCycling：ProspectsofUsingRhizosphereMicroorganismsforImprovingPhosphorusNutritionofPlants[M]//GeomicrobiologyandBiogeochemistry.SpringerBerlinHeidelberg,2014:199-237.)，解磷菌能够将土壤中不能被植物吸收的有机磷转化为可被植物直接利用的有效磷，增加土壤含磷量(王光华,赵英,周德瑞,等.解磷菌的研究现状与展望[J].生态环境,2003,12(1):96-101.王志刚,徐伟慧,莫继先,等.东北黑土区大豆根际促生菌群落组成研究[J].中国生态农业学报,2012,20(5):592-596.)，促进植物磷摄取。此外，解磷菌在代谢过程中还能够分泌生长激素，促进植物生长，缓解连作导致的植株发育不良，为农作物产量的增大提供有利条件。

本发明经筛选和鉴定得到了一株鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonassp.)细菌，其最大解磷量可达到642.60mg/L，IAA最大分泌量可达到22.87mg/L，此外，本发明还研究了其对连作西瓜幼苗生长的影响，以期为利用微生物缓解西瓜连作障碍提供技术支持。

发明内容

本发明的目的之一是提供一株经分离获得的鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonassp.)细菌，该细菌具有较高的解磷能力，能够优化西瓜根系形态，改善根系组成，可有效缓解西瓜连作障碍，对连作西瓜植株具有明显的促生效应；

本发明的目的之二是提供所述分离获得的鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonassp.)细菌在促进连作西瓜植株生长、缓解西瓜连作障碍中的应用。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明的一株经分离获得的鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonassp.)细菌，命名为Sphingomonassp.CL01，分类命名为鞘氨醇单胞菌属CL01，保藏在中国典型培养物保藏中心，地址在武汉大学，其微生物保藏号是CCTCCNO：M2015198，保藏日期为2015年4月6日。

本发明发明人于2014年3月采集黑龙江省齐齐哈尔市某园林中的植物根际土壤，采用抖土法收集根系表面土壤，通过浓度梯度稀释，得到10^-4、10^-5、10^-6浓度土壤悬液，平板涂布后，存放于28℃恒温箱内培养5d，挑取解磷圈较大的单菌落进行纯化。将纯化菌株制作种子液，按1％的接种量接入液体蒙金娜培养基，在28℃、120r/min的摇床中进行培养，取上清液通过钼锑抗比色法进行解磷能力的测定。对比各菌株解磷值，选取解磷能力最高的一株进行后续实验。结果显示，筛选后得到解磷能力最强的菌株CL01，鉴定为Sphingomonassp.，最大解磷量可达到642.60mg/L，IAA最大分泌量可达到22.87mg/L，经OD_600nm＝0.50和OD_600nm＝1.00浓度的菌液分别处理后，结果显示连作西瓜幼苗根干重、根长、根体积、根尖个数和毛根(0.00mm＜d≤0.50mm)比例均显著增加，根系平均直径均显著降低；相比较而言，使用浓度OD_600nm＝0.50的菌液处理促进连作西瓜幼苗生长的效果更好，且用量少。

因此，进一步的，本发明还提出了以上所述的鞘氨醇单胞菌属细菌Sphingomonassp.CL01在促进连作西瓜生长、缓解西瓜连作障碍中的应用。

其中，所述的促进连作西瓜生长以及缓解西瓜连作障碍主要包括增加幼苗的根干重、根长、根体积、根尖个数和毛根比例，以及降低根系平均直径等等。

综上所述，经本发明分离获得Sphingomonassp.CL01具有较高的解磷能力，可分泌IAA，且能够优化西瓜根系形态，改善根系组成，可有效缓解西瓜连作障碍，在缓解西瓜连作障碍方面具有较好的利用前景。

附图说明

图1为各菌株48h时水溶性磷含量；

图2为Sphingomonassp.CL01系统发育进化树；

图3为Sphingomonassp.CL01生长曲线(a)及接菌后IAA浓度变化(b)；

图4为不同处理西瓜根系形态扫描图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1菌株Sphingomonassp.CL01的分离纯化和鉴定

1材料与方法

1.1培养基

蒙金娜有机培养基(1L)：葡萄糖10.00g，(NH₄)₂SO₄0.50g，MgSO₄·7H₂O0.30g，NaCl0.30g，KCl0.30g，FeSO₄·7H₂O0.03g，MnSO₄·H₂O0.03g，卵磷脂0.20g，CaCO₃1.00g，酵母粉0.50g，琼脂20.00g，蒸馏水定容至1000.00ml，液体培养基不加琼脂。

1.2解磷菌株粗筛

于2014年3月采集黑龙江省齐齐哈尔市某园林中的植物根际土壤，采用抖土法收集根系表面土壤，通过浓度梯度稀释，得到10^-4、10^-5、10^-6浓度土壤悬液，平板涂布后，存放于28℃恒温箱内培养5d，挑取解磷圈较大的单菌落进行纯化。

1.3解磷菌株解磷能力测定及筛选

1.3.1磷含量标准曲线绘制

分别将2μg/ml的磷标准液梯度稀释为含磷量为0.00μg/ml、0.04μg/ml、0.08μg/ml、0.24μg/ml、0.40μg/ml、0.80μg/ml、1.20μg/ml制作标准曲线。在室温下加入钼锑抗显色剂，显色20min，测得吸光值并制作标准曲线。测定标准曲线为y＝0.5256x+0.0359，相关系数R²＝0.9945。

1.3.2解磷能力测定与筛选

对纯化菌株进行种子液制备，具体方法如下：使用接种环挑取纯化菌株的菌落接种于LB液体培养基中，在28℃、120r/min的条件下进行摇瓶培养，通过分光光度计测定菌液吸光值(OD_600nm)，确定其对数生长期，使用对数生长期菌液作为种子液。

按1％(v/v)的接种量将种子液接入液体蒙金娜培养基，在28℃、120r/min的摇床中进行培养。每隔24h取5.00ml菌悬液在4000r/min下离心20min，取上清液通过钼锑抗比色法进行解磷能力的测定。对比各菌株解磷值，选取解磷能力最高的一株进行后续实验。

1.4菌株鉴定与生长曲线测定

对筛选菌株进行形态和16SrDNA分类鉴定，采用Mega5.0制作进化树。挑取筛选菌株单菌落接种于100.00ml液体蒙金娜培养基中，28℃，120r/min摇瓶培养，每4h测定吸光值(OD_600nm)，制作菌株生长曲线。

1.5IAA分泌量测定

1.5.1IAA标准曲线测定

标准曲线采用分析纯IAA进行制备，将50.00μg/ml的IAA标准液梯度稀释为0.00μg/ml、10.00μg/ml、20.00μg/ml、30.00μg/ml、40.00μg/ml、50.00μg/ml，测定标曲，得到标准曲线为y＝0.0115x+0.003，相关系数R²＝0.9934。

1.5.2植物生长素分泌定量测定

对筛选菌株进行种子液制备，具体方法如下：使用接种环挑取筛选菌株的菌落接种于LB液体培养基中，在28℃、120r/min的条件下进行摇瓶培养，使用对数生长期菌液作为种子液。

按1％(v/v)的接种量将种子液接入含有200mg/L色氨酸的液体蒙金娜培养基中，在28℃、120r/min的摇床中进行培养，采用Salkowski显色法测量IAA。

2结果分析

2.1解磷菌株的筛选

通过筛选得到4种菌株具有解磷圈，使用蒙金娜液体培养基进行培养，测定培养基(CK)初始磷含量为203.20mg/L，在48h后对菌株进行解磷值的测定。由图1可知，4种菌株在培养48h时各菌液最大水溶性磷含量分别为CL01＝845.80mg/L、CL02＝125.19mg/L、CL03＝480.50mg/L、CL05＝314.50mg/L，CL01相较其他菌株相比水溶性磷含量最大，其有效值为642.60mg/L，由此可以确定菌株CL01解磷能力最强，选定其进行后续研究。

菌株Sphingomonassp.CL01，保藏在中国典型培养物保藏中心，地址在武汉大学，其微生物保藏号是CCTCCNO：M2015198，保藏日期为2015年4月6日。

2.2菌株CL01鉴定

经鉴定，菌株CL01为G^-，杆状，对其进行16SrDNA序列测定，在NCBI中使用blast对序列进行比对并制作系统发育进化树，由图2可知与菌株CL01与Sphingomonassp.同源性达99％，结合菌株特征鉴定菌株CL01为Sphingomonassp.。

2.3菌株CL01生长曲线及IAA含量测定

每4h对菌株CL01各时间段进行吸光值(OD_600nm)测定，并绘制生长曲线，由图3(a)可以看出菌株CL01的延滞期较短，很快进入对数期，在16h-48h时菌株进入稳定期增长速度开始减缓，密度相对平稳，在48h后进入衰亡期。使用Salkowski显色法每隔1d对菌株CL01的IAA分泌量进行测量。由图3(b)可知菌株CL01具有分泌IAA的能力，生长3d后，其IAA分泌量达到最大，最大值为22.87mg/L。

实施例2菌株Sphingomonassp.CL01对连作西瓜幼苗的影响

1、方法

将CL01接种于LB培养基中，在28℃、120r/min的培养条件下培养24h以上，通过分光光度计测定其吸光值(OD_600nm)，使用无菌水对菌液浓度进行稀释，得到菌液浓度为OD_600nm＝0.50和OD_600nm＝1.00的Sphingomonassp.CL01菌液备用。使用连作土对西瓜种子进行培养。连作土为东北农业大学生命科学与农林学院实验室用土，供试连作土理化性质为有机质含量为16.06g/kg、土壤速效磷含量为372.45mg/kg、土壤pH为6.12、土壤EC为0.53ms/cm。

将待种西瓜种子(京欣一号西瓜种子)消毒后分别播种于灭菌连作土和正常的连作土中，对种子进行不同处理，处理情况见表1。置于智能人工气候箱内培养30d后(28℃/光照12h，18℃/黑暗12h，湿度为60％)测量西瓜幼苗各部分情况。

表1实验处理编号

2结果分析

2.1不同处理对连作西瓜幼苗生长的影响

培养30d后对西瓜幼苗的茎粗、株高、地上部干鲜重、地下部干鲜重进行测量。由表2可知，与CK1相比，经R1处理的西瓜幼苗地下部干重显著增加(p<0.05)，增加量为65.16％，地上部干重有一定程度增加，增加量为24.53％，经R2处理后的西瓜幼苗地下部鲜重、地上部干重分别增加了3.62％和27.04％。较CK2，经R3处理后的西瓜幼苗地下部干重显著增加(p<0.05)，增加量为103.90％，株高、地上部干重、地上部鲜重显著增加(p<0.05)，增加量分别为43.52％、88.01％、13.15％，经R4处理后的西瓜幼苗显著增加了株高、地上部干重、地上部鲜重(p<0.05)，增加量分别为54.42％、90.48％、26.25％，地下部干重有一定程度增加，增加量为42.53％。以上结果显示在灭菌连作土和正常连作土上生长的西瓜幼苗经过OD_600nm＝0.50浓度(R1和R3)的CL01菌液处理后均能显著增加地下部干重，而经过OD_600nm＝1.00浓度处理的西瓜幼苗只在正常连作土(R4)中显著提升植株各生长指标，对灭菌连作土上生长的西瓜幼苗(R2)没有显著的提升，总上所述，OD_600nm＝0.50浓度菌液对连作西瓜幼苗生长更加有效，能够显著提升其地下部生长能力。

表2菌株CL01对连作西瓜幼苗生长影响

2.2不同处理对连作西瓜幼苗根系生长情况的影响

培养30d后对西瓜幼苗根系进行拍照，图4中显示了经过不同处理后植物根系的生长情况，可以看出处理后的西瓜幼苗(R1，R2，R3，R4)较对照组(CK1，CK2)而言侧根数量增加显著，根系密度明显提高，毛根数量增加，整体根系组成向细根化演变，具有良好的延展性。

2.3不同处理对连作西瓜幼苗根系分布影响

通过根系分析仪对培养30d后的西瓜幼苗的根长、根体积、根表面积和根尖数进行测量。由表3可知，与CK1相比，经R1处理后的西瓜幼苗根长、根体积、根尖数显著增加(p<0.05)，增加量为83.60％、14.29％、15.16％，根系平均直径显著降低(p<0.05)，下降量为47.89％，根表面积也有一定程度的提高，增加量为7.98％，经R2处理后的西瓜幼苗根长、根尖数显著增加(p<0.05)，增加量为56.15％、50.29％，根系平均直径显著降低(p<0.05)，下降量为84.21％。与CK2相比，经R3处理后的西瓜幼苗根长、根体积、根尖数显著增加(p<0.05)，增加量为63.75％、100.00％、85.45％，根系平均直径显著降低(p<0.05)，下降量为66.00％，经R4处理后的西瓜幼苗根体积、根尖数显著增加(p<0.05)，增加量为64.71％、12.72％，根系平均直径显著降低，下降量为36.07％，根长也有一定程度增加，增加量为14.88％。通过数据可知，在灭菌连作土和正常连作土(R1和R3)上生长的西瓜幼苗经OD_600nm＝0.50浓度菌液处理后均可显著增加根长、根体积、根尖个数，显著降低根系平均直径，经OD_600nm＝1.00浓度菌液处理(R2和R4)后均可显著增加根尖个数，显著降低根系平均直径，对比而言，OD_600nm＝0.50浓度菌液更好的优化根系形态，增大须根数量。

表3菌株CL01对连作西瓜幼苗根系形态的影响

2.4不同处理对连作西瓜幼苗不同直径根系的根长百分比的影响

培养30d后对西瓜幼苗不同直径根系的根长百分比进行测量。由表3可知，与CK1相比，经R1处理后的西瓜幼苗在大于0.00mm小于等于0.50mm直径范围内的根长百分比显著增加(p<0.05)，增加量为47.81％，在0.50-1.00mm、1.00-1.50mm、1.50-2.00mm、2.50-3.00mm直径范围内的根长百分比显著降低(p<0.05)，下降量为39.86％、38.15％、231.47％、292.50％，经R2处理后，西瓜幼苗在大于0.00mm小于等于0.50mm直径范围内的根长百分比显著增加(p<0.05)，增加量为68.51％，在0.50-1.00mm、1.00-1.50mm、1.50-2.00mm、2.50-3.00mm直径范围内的根长百分比显著降低(p<0.05)，分别下降了141.00％、179.40％、207.79％、313.16％。与CK2相比，经R3处理过的西瓜幼苗在大于0.00mm小于等于0.50mm直径范围内的根长百分比显著增加(p<0.05)，增加量为26.80％，在0.5-1.0mm、1.00-1.50mm、1.50-2.00mm直径范围内根长百分比均有一定程度的降低，经R4处理后的西瓜幼苗在大于0.00mm小于等于0.50mm直径范围内的根长百分比显著增加(p<0.05)，增加量为27.80％，在0.50-1.00mm、1.00-1.50mm、1.50-2.00mm直径范围内根长百分比也有降低，但不显著。由此可知，通过不同浓度的菌液处理灭菌连作土和正常连作土(R1、R2、R3、R4)上生长的西瓜幼苗，其结果均可显著增加大于0.00mm小于等于0.50mm直径范围内的根长百分比，降低其他直径范围内的根长百分比，两种浓度的菌液均可改善了根系组成，促使植物根系向细根化发展。

表4菌株CL01对连作西瓜幼苗不同直径根系的根长百分比的影响

以上结果表明，本发明从植物根际土中分离出的一株解磷菌Sphingomonassp.CL01，具有较高的解磷能力，并能够分泌IAA。连作西瓜幼苗施用此菌后，显著提高了植株的地下部干重、根长、根体积、根尖个数和根毛数量，同时促进了其地下部的生长，优化了根系分布，增大须根数，改善了根系组成。因此，解磷菌CL01能够有效缓解西瓜连作障碍，在西瓜连作栽培中具有较好的应用前景。