一种CD3+CD8+CD56+T细胞亚型促进NK细胞增殖的方法

摘要

本发明公开了一种促进NK细胞增殖的方法。本发明提供了CD3+CD56+T细胞的新用途，为如下三种中的任一种：1)在制备促进NK细胞增殖的产品中的应用；2)在制备促进NK细胞有丝分裂的产品中的应用；3)在制备增强NK细胞抗凋亡能力的产品中的应用。本发明利用CD3+CD56+T细胞具有促进NK细胞增殖的特性，将CD3+CD56+T细胞和NK细胞这两类具有强大杀伤功能的免疫细胞共同培养，建立了NK细胞混合培养体系。本发明为NK细胞的体外大量增殖培养提供了新的思路。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种促进NK细胞增殖的方法。 

背景技术

2013年末，SCIENCE杂志评选出十大突破性科学成就中，肿瘤的免疫治疗名列第一。与传统抗肿瘤治疗手段相比，细胞治疗应用范围广泛，尤其对微小转移灶的疗效更是明显，而且其毒副作用要明显低于放化疗。随着肿瘤生物学、分子生物学和免疫学的发展，免疫细胞治疗是目前最有希望取得突破的治疗手段，并已成为继传统肿瘤治疗方法手术和放化疗后的第四种肿瘤治疗模式。目前应用最广泛的工具细胞是T淋巴细胞，但是由于来自肿瘤患者自体的淋巴细胞长期收到肿瘤微环境的免疫编辑，导致其肿瘤识别和杀伤等多方面的低能。如不通过基因修饰技术为T细胞加载特异性识别受体，则很多肿瘤患者无法从该类治疗中获益。也有人常用异体淋巴细胞作为工具细胞为肿瘤患者治疗，但是由于受MHC配型限制，很多患者产生了严重的移植物抗宿主反应(GvHD)。人体中NK细胞被定义为CD3^-CD56⁺淋巴细胞，可以通过识别肿瘤细胞表面发生突变或表达缺失的MHC抗原而激活自体杀伤功能。针对能够表达正常MHC分子的肿瘤细胞，NK细胞还能通过其表面的活化受体进行识别。活化受体包括NKG2D、DN1M-1、NKG2C、2B4和自然细胞毒性受体(NCR：NKp30，NKp44和NKp46)等。尽管近期的研究发现，肿瘤微环境会释放假活化信号，使得NK细胞尚未接触到肿瘤时其抗肿瘤活性已被消耗殆尽。当NK细胞的数量足以克服该影响后，那将会对肿瘤细胞产生强大的杀伤作用。 

由于NK细胞数量稀少，仅占外周血淋巴细胞的5％左右，即使经过体外扩增后仍无法获得满意的NK细胞数量用以后期治疗。因此，突破NK细胞治疗瓶颈的关键即是建立高效的体外扩增培养方法。 

发明内容

本发明的一个目的是提供一种CD3⁺CD56⁺T细胞的新用途。 

本发明所提供的CD3⁺CD56⁺T细胞的新用途，具体可为如下三种中的任一种： 

(1)CD3⁺CD56⁺T细胞在制备促进NK细胞增殖(体外培养)的产品中的应用。 

(2)CD3⁺CD56⁺T细胞在制备促进NK细胞有丝分裂的产品中的应用。 

(3)CD3⁺CD56⁺T细胞在制备增强NK细胞抗凋亡能力的产品中的应用。 

其中，(1)-(3)中，所述NK细胞均为离体的NK细胞。 

进一步，所述CD3⁺CD56⁺T细胞具体可为CD3⁺CD8⁺CD56⁺T细胞。 

本发明的另一个目的是提供一种促进NK细胞增殖的方法。 

本发明所提供的促进NK细胞增殖的方法，具体可包括将CD3⁺CD56⁺T细胞与NK细胞共培养的步骤。 

在所述方法的共培养体系中，所述CD3⁺CD56⁺T细胞与所述NK细胞的初始数量比可为1:1以上，如3:1以上，再如(3-4):1，具体如3:1。 

进一步，所述CD3⁺CD56⁺T细胞具体可为CD3⁺CD8⁺CD56⁺T细胞。 

在所述方法中，将所述CD3⁺CD56⁺T细胞与所述NK细胞进行共培养的培养基为含有5％体积分数的离体血浆的T551培养基(如日本宝日医公司产品，货号：GT-T551H2)；所述离体血浆与所述NK细胞来源于同一物种。 

所述物种具体可为人。 

所述离体血浆与所述NK细胞最好来源于同一个体。 

在所述方法中，所述共培养体系中，细胞的初始浓度可为5×10⁵/ml；培养条件可为37℃5％CO₂。 

实验证明，本发明发现CD3⁺CD56⁺T细胞(具体如CD3⁺CD8⁺CD56⁺T细胞)具有促进NK细胞增殖的免疫调节功能，本发明并且利用此特性将CD3⁺CD56⁺T细胞和NK细胞这两类具有强大杀伤功能的免疫细胞共同培养，建立了NK细胞混合培养体系。本发明为NK细胞的体外大量增殖培养提供了新的思路。 

附图说明

图1为CD3⁺CD56⁺T细胞促进NK细胞增殖的功能亚群的鉴定结果。其中，*表示与NK细胞单独培养组相比差异极显著(P<0.01)。 

图2为不同T/NK比例时NK细胞扩增倍数。其中，*表示与NK细胞单独培养组相比差异极显著(P<0.01)。 

图3为流式细胞法检测两种培养方式下NK细胞的细胞周期。单独培养组中NK细胞处于DNA合成期的比例为46.4％，混合培养组中NK细胞处于DNA合成期的比例为61.1％(n＝3，组内趋势一致，选取典型结果展示)。 

图4为流式细胞法检测两种培养方式下NK细胞凋亡的凋亡比例。混合培养组中的NK细胞凋亡比例低于单独培养组NK细胞，细胞抗凋亡能力增强(n＝3，组内趋势一致，选取典型结果展示)。 

图5为流式细胞法检测两种培养方式下NK细胞凋亡的凋亡比例的统计结果。其中，*表示与NK细胞单独培养组相比差异极显著(P<0.01)。 

图6为两种培养方式下NK细胞对人慢性粒细胞白血病系K562的杀伤率。 

图7为两种培养方式下NK细胞对人胰腺癌细胞系JF-305的杀伤率。 

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。 

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 

人慢性粒细胞白血病细胞株K562：为NK敏感细胞。记载于“王芳妹,杨子剑,韩梅等.阿司匹林对人慢性粒细胞白血病细胞株K562的生长抑制作用.湖南师范大学自然科学学报,2013年05期”一文，公众可以从中国医学科学院肿瘤医院获得。 

人胰腺癌细胞系JF305：为NK不敏感细胞。记载于“李昕,王宏,姜奕等.表达p53基因的人胰腺癌细胞系JF305的建立.中华肿瘤杂志,1994年03期”一文，公众可以从中国医学科学院肿瘤医院获得。 

实施例1、CD3⁺CD56⁺T细胞对NK细胞增殖作用的初步研究 

本实施例将初步研究CD3⁺CD56⁺T细胞对NK细胞增殖的影响。按照CD4/CD8分类法，可将CD3⁺CD56⁺T细胞分为CD3⁺CD4⁺CD56⁺T细胞、CD3⁺CD8⁺CD56⁺T细胞和CD3⁺CD4^-CD8^-CD56⁺T细胞三群。由于CD3⁺CD4^-CD8^-CD56⁺T细胞在外周血所占比例非常低，本研究中暂不考虑。 

一、外周血单个核细胞(PBMC)的分离 

按照如下方法获得来自于同一个健康志愿者(经临床认定无重大疾病的健康人)的外周血单个核细胞(PBMC)： 

采用人淋巴细胞分离液，利用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)。这是一种在密度梯度介质中进行的依密度而分离的离心法，各组分会依其密度分布在与其自身密度相同的液层中。人外周血中各种细胞密度不同，红细胞密度为1.093，粒细胞为1.092，淋巴细胞为1.074。根据各类血细胞密度的差异，采用密度介于两种血细胞之间的细胞分离液对血液进行离心，使一定密度的血细胞依照密度梯度分布于相应的独立带，从而达到分离的目的。本次采用的淋巴细胞分离液密度为1.080。 

1、健康志愿者晨起空腹于肘静脉抽取25ml外周血，混合少量肝素抗凝留用； 

2、50ml离心管中加入15ml淋巴细胞分离液，非常缓慢的将外周血加在淋巴细胞分离液之上； 

3、离心管进行密度梯度离心，2000rpm离心20分钟，调整加速度于最低档位，离心后分层由上至下分别为：血浆、PBMC、淋巴细胞分离液、红细胞； 

4、吸取上层血浆，56℃水浴灭活30分钟，离心取上清留用； 

5、吸取PBMC，PBS充分混匀，1000rpm离心10分钟，弃上清，重复三次；计数。 

二、流式细胞分选 

采用流式细胞分选方法从步骤一获得的外周血单个核细胞(PBMC)中，分离如下五个细胞群：NK细胞(CD3^-CD56⁺)、CD3⁺CD56⁺T细胞、CD3⁺CD4⁺CD56⁺T细胞、 CD3⁺CD8⁺CD56⁺T细胞和CD56^-淋巴细胞。具体操作如下： 

1、PBS重悬吹散步骤一获得的PBMC细胞，离心弃上清； 

2、加入含2％(2g/100ml)BSA的PBS溶液，4℃封闭30分钟； 

3、依照抗体具体要求加入细胞表面荧光标记抗体(FITC-anti-human CD4，Anti-human CD3PE-cy5，Anti-human CD8a APC，Anti-human CD56PE-Cy7，抗体均购自ebioscience)，并做相应同型对照和荧光单标对照； 

4、将所有标记好抗体的流式细胞管，置于4℃避光孵育30分钟； 

5、每管加入3ml预冷的PBS，1000rpm离心5分钟； 

6、加入含2％(体积分数)FBS的无酚红1640培养基重悬，调整细胞密度为2×10⁷/ml； 

7、流式细胞仪上机分选。 

三、细胞培养 

将步骤二获得的五个细胞群进行分组，分为五组，分别为：NK细胞单独培养组、NK细胞与CD3⁺CD56⁺T细胞混合培养组、NK细胞与CD3⁺CD4⁺CD56⁺T细胞混合培养组、NK细胞与CD3⁺CD8⁺CD56⁺T细胞混合培养组，以及NK细胞与CD56^-淋巴细胞混合培养组。五组中，总细胞数和细胞密度均相等，且混合培养组中混合细胞(CD3⁺CD56⁺T细胞或CD3⁺CD4⁺CD56⁺T细胞或CD3⁺CD8⁺CD56⁺T细胞或CD56^-淋巴细胞)与NK细胞的初始比例均为3:1。 

将五组细胞分别加入到培养板中，用添加含有5％(体积分数)的自体血浆的T551培养基(T551培养基购自日本宝日医公司，产品货号：GT-T551H2)将培养板中五组细胞的初始浓度统一调整为5×10⁵/ml，于37℃5％CO₂的细胞培养箱中进行培养。 

经过7天的相同培养条件的体外培养后，统计五组培养体系中NK细胞的扩增倍数。具体操作如下： 

1、计数培养体系中总细胞数； 

2、流式细胞法检测培养体系中NK细胞(CD3^-CD56⁺淋巴细胞)比例，参照步骤二进行，采用抗体为Anti-human CD3PE-cy5和Anti-human CD56PE-Cy7。 

3、当日NK细胞数＝总细胞数×NK细胞比例； 

NK细胞扩增倍数＝当日NK细胞数/初代NK细胞数。 

实验中每组设置3次重复；结果取平均值。 

结果显示：与NK细胞单独培养组相比，除NK细胞与CD56^-淋巴细胞混合培养组外，其他三个混合培养组中NK细胞的增殖倍数都有所提高。这说明，CD56^-淋巴细胞并未诱导NK细胞增殖，CD3⁺CD4⁺CD56⁺T细胞具有一定的促NK细胞增殖作用，但远未达到CD3⁺CD56⁺T细胞，而CD3⁺CD8⁺CD56⁺T细胞的促NK细胞增殖的效果 明显(n＝3，P<0.01)，与CD3⁺CD56⁺T细胞能力持平(n＝3，P<0.01)。详见图1。 

实施例2、促增殖过程中CD3⁺CD8⁺CD56⁺T细胞和NK细胞初始比例的优化 

本实施例将在实施例1的基础上，进一步研究在促增殖过程中CD3⁺CD8⁺CD56⁺T细胞和NK细胞初始比例，对NK细胞增殖效果的影响。 

一、外周血单个核细胞(PBMC)的分离 

同实施例1步骤一，不同之处仅在于外周血单个核细胞(PBMC)来自于不同于实施例1的另外一个健康志愿者。 

二、流式细胞分选 

采用流式细胞分选方法从步骤一获得的外周血单个核细胞(PBMC)中，分离NK细胞(CD3^-CD56⁺淋巴细胞)和CD3⁺CD8⁺CD56⁺T细胞。具体操作如下参见实施例1步骤二。 

三、细胞培养 

将步骤二获得的两个细胞群按照CD3⁺CD8⁺CD56⁺T细胞与NK细胞的不同混合比例进行分组，分为六组，分别为：NK细胞单独培养组(T/NK＝0)、CD3⁺CD8⁺CD56⁺T细胞与NK细胞的初始数量比为0.5:1的混合培养组(T/NK＝0.5)、CD3⁺CD8⁺CD56⁺T细胞与NK细胞的初始数量比为1:1的混合培养组(T/NK＝1)、CD3⁺CD8⁺CD56⁺T细胞与NK细胞的初始数量比为2:1的混合培养组(T/NK＝2)、CD3⁺CD8⁺CD56⁺T细胞与NK细胞的初始数量比为3:1的混合培养组(T/NK＝3)、CD3⁺CD8⁺CD56⁺T细胞与NK细胞的初始数量比为4:1的混合培养组(T/NK＝4)。 

将六组细胞分别加入到培养板中，用添加含有5％(体积分数)的自体血浆的T551培养基(T551培养基购自日本宝日医公司，产品货号：GT-T551H2)将培养板中六组细胞的初始浓度统一调整为5×10⁵/ml，于37℃5％CO₂的细胞培养箱中进行培养。 

经过7天的相同培养条件的体外培养后，统计六组培养体系中NK细胞的扩增倍数。具体操作参见实施例1步骤三。 

实验中每组设置3次重复；结果取平均值。 

结果显示：随着培养体系中CD3⁺CD8⁺CD56⁺T细胞比例的升高，NK细胞的扩增能力逐渐增强，当T/NK＝3时，NK细胞的扩增能力达到了最大值，继续提高T细胞的比例无法进一步提高NK细胞数量(n＝3，P<0.01)详见图2。 

实施例3、CD3⁺CD56⁺CD8⁺T细胞促NK细胞增殖的机制研究 

细胞数量的升高主要由两部分因素导致，一是细胞有丝分裂速度加快；二是细胞凋亡速度减慢。为了明确CD3⁺CD56⁺CD8⁺T促进NK细胞体外增殖的机制，本发明的 发明人分别从两方面对不同培养条件下的NK细胞进行研究。 

一、CD3⁺CD56⁺CD8⁺T细胞对NK细胞有丝分裂的影响 

1、外周血单个核细胞(PBMC)的分离 

参照实施例1步骤一进行。 

2、流式细胞分选 

采用流式细胞分选方法从步骤一获得的外周血单个核细胞(PBMC)中，分离NK细胞(CD3^-CD56⁺淋巴细胞)和CD3⁺CD8⁺CD56⁺T细胞。具体操作如下参见实施例1步骤二。 

3、细胞培养 

本发明的发明人将来自正常人外周血中CD3⁺CD56⁺CD8⁺T细胞和NK细胞分为混合培养组(T/NK＝3)和NK细胞单独培养组，具体培养方法参见实施例2步骤三。 

培养72小时后，将混合培养组中的NK细胞利用CD3磁珠阴性筛选法进行纯化： 

用MACS细胞分选系统可以分离出非常纯的细胞群体，而且有极好的回收率和存活率。依据细胞频率和标记表达水平的不同，MACS分离细胞的纯度可达95％-99.9％，回收率>90％。 

1、每10⁷个细胞加入20μl抗人CD3磁珠和80μl磁珠buffe；其中，抗人CD3磁珠为美天旎公司产品，其产品目录号为130-050-101；磁珠buffer的配方：含0.5％(体积百分比)HSA(人血白蛋白，购自成都蓉生药业有限责任公司，国药准字S20023016)和2mM EDTA(EDTA购自SIGMA，货号:E6511-100G)的PBS溶液(pH＝7.2)。 

2、混匀，4℃孵育15分钟； 

3、每10⁷个细胞加入2ml磁珠buffer，1000rpm离心10分钟，弃上清； 

4、用磁珠buffer调整细胞浓度至2×10⁸/ml； 

5、将MS磁珠吸附柱(美天旎公司产品，其产品目录号为130-042-201)置于分离磁场中，吸附柱用3ml磁珠buffer(配方同上)彻底浸透； 

6、吸取细胞悬液加载柱中，并收集未被吸附的细胞； 

7、加入2ml磁珠buffer(配方同上)，继续收集未被吸附的细胞。 

步骤6和步骤7中所收集的未被吸附的细胞即为NK细胞。 

注：步骤1-7中所用试剂均需提前4℃预冷，且要求操作迅速避免磁珠非特异吸附。 

将两组中的NK细胞分别在70％(体积分数)冰乙醇溶液(溶剂为水)中固定48小时后用工作浓度为50μg/ml的PI(碘化丙啶)溶液(配方：将25mg PI粉剂以PBS25ml避光搅拌至充分溶解，得到终浓度为10mg/ml的贮存液，过滤分装后，置于4℃避光保存。)染色，染色后通过流式细胞仪检测NK细胞的周期。 

实验中每组设置3次重复。 

结果显示：单独培养组中的NK细胞处于DNA合成期(S期)的比例为46.4％，而混合培养组中NK细胞处于DNA合成期(S期)的比例显著提高，为61.1％(n＝3，组内各重复趋势一致，如图3所示)。可见，CD3⁺CD56⁺CD8⁺T细胞可以促进NK细胞的分裂能力。 

二、CD3⁺CD56⁺CD8⁺T细胞对NK细胞抗凋亡能力的影响 

1、外周血单个核细胞(PBMC)的分离 

参照实施例1步骤一进行。 

2、流式细胞分选 

采用流式细胞分选方法从步骤一获得的外周血单个核细胞(PBMC)中，分离NK细胞(CD3^-CD56⁺淋巴细胞)和CD3⁺CD8⁺CD56⁺T细胞。具体操作如下参见实施例1步骤二。 

3、细胞培养 

本发明的发明人将来自正常人外周血中CD3⁺CD56⁺CD8⁺T细胞和NK细胞分为混合培养组(T/NK＝3)和NK细胞单独培养组，具体培养方法参见实施例2步骤三。 

培养72小时后，将混合培养组中的NK细胞利用CD3磁珠阴性筛选法进行纯化(参见步骤一进行)。 

两组细胞分别置于无细胞因子无自体血浆的T511培养基(T551培养基购自日本宝日医公司，产品货号：GT-T551H2)凋亡环境中进行诱导。在诱导后连续四天采用Annecin V-FITC+PI双染法对两组细胞的凋亡比率进行检测。 

其中，Annecin V-FITC+PI双染法为采用宝赛生物公司产品生产的试剂盒(产品目录号为CX1001-3)进行操作，试剂盒中包含Binding Buffer、Annecin V-FITC、PI。 

1、常规消化处理培养细胞，细胞计数后取1×10⁶个细胞，1000rpm离心5分钟，弃上清； 

2、加入1ml冰预冷的PBS，轻轻震荡使细胞悬浮，1000rpm离心5分钟，弃上清，重复一次； 

3、将细胞重悬于200μl Binding Buffer中，加入10μl Annexin V-FITC轻轻混匀，避光室温反应15分钟； 

4、加入5μl PI，尽快上机检测。 

结果判断方法：Annexin V阳性细胞为凋亡细胞，其中Annexin V和PI双阳性细胞为凋亡晚期的细胞，Annexin V阳性而PI阴性的细胞为凋亡早期的细胞；Annexin V阴性的细胞为未凋亡的细胞。 

细胞凋亡比例＝Annexin V阳性细胞数量/检测细胞总数×100％。 

实验中每组设置3次重复，定量结果取3次重复的平均值。 

结果显示：混合培养组中的NK细胞凋亡速度在第2天和第3天显著低于单独培养组的NK细胞(n＝3，P<0.01)。详见图4和图5。可见，CD3⁺CD56⁺CD8⁺T细胞可以在一定程度上增强NK细胞的抗凋亡能力。 

实施例4、CD3⁺CD56⁺CD8⁺T细胞对NK细胞杀伤能力的影响 

NK细胞对肿瘤细胞的非MHC限制性杀伤活性主要表现为抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)，Fas-FasL诱导凋亡或分泌穿孔素、颗粒酶和IFN-γ，因此研究NK细胞杀伤能力的最直观指标是体外杀伤试验。 

将实施例2中培养7天后的NK细胞单独培养组、CD3⁺CD56⁺CD8⁺T细胞与NK细胞混合培养组(T/NK＝3)中的NK细胞纯化后，选取靶细胞分别为NK敏感细胞人慢性粒细胞白血病细胞株K562和NK不敏感细胞人胰腺癌细胞系JF305分别进行体外细胞杀伤实验。检测方法为CFSE-PI流式细胞检测法，以效靶比(E/T)为1、2、4、8分别将两组中的NK细胞与两种靶细胞混合(具体而言，96孔板中各处理的靶细胞的细胞总数和密度是恒定的，根据不同的效靶比将NK细胞与靶细胞做混合，靶细胞的细胞密度2×10⁵/ml，NK细胞的密度分别为2×10⁵/ml、4×10⁵/ml、8×10⁵/ml、1.6×10⁶/ml)，于含有10％(体积分数)的胎牛血清的1640培养基(1640培养基购自Invitrogen公司，货号11875-085)中，于37℃5％CO₂的细胞培养箱中培养4小时，从而对靶细胞进行杀伤。实验同时设置不加入NK细胞，仅加入等量靶细胞的对照。 

其中，CFSE-PI流式细胞检测法具体如下： 

1、计数靶细胞，并加入CFSE(东仁化学公司产品，其产品目录号为LC01)，使CFSE终浓度达到2μM，37℃30分钟。 

2、拿出后，1000rpm离心5min，可隐约看到细胞染成黄色，PBS洗三次。 

3、与效应细胞混培，作用4小时。 

4、将细胞混合液消化取出，洗二次，PI(东仁化学公司产品，其产品目录号为P346)工作液5μl，避光30分钟后上流式。 

5、CFSE，PI双阳性的细胞为被杀伤的靶细胞，除以靶细胞总数，即为杀伤率(杀伤率＝CFSE⁺PI⁺/CFSE⁺)。 

实验中每个处理设置3个重复，结果取平均值。 

结果发现，两种培养方式下的NK细胞杀伤活性无明显差异(P>0.05)，即与CD3⁺CD56⁺CD8⁺T细胞共培养的NK细胞，其杀伤活性并未受到影响(图6、图7)。